一种深海鱼皮胶原多肽的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种深海鱼皮胶原多肽的制备方法，该方法是将胶原蛋白液粗品在温度55℃下加入复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中多次用超滤膜过滤，然后将酶解液用复合活性炭采用分次吸附法脱色去腥后纳滤，干燥，得粉末状胶原多肽。本发明采用酶解和超滤分离联用工艺，做到真正的人为控制反应条件，使产品的分子量可控、分子量分布合理，从而产品的各种理化性质更好。
【专利说明】一种深海鱼皮胶原多肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋生物酶解【技术领域】，具体而言，涉及一种以深海鱼的鱼皮胶原蛋白液为底物进行酶解制备胶原多肽的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质是人体生长发育、保持生命正常活动必不可少的物质之一。现代生物代谢研究表明，蛋白质消化后主要是以多肽的形式直接吸收。如鱼皮胶原多肽不仅具有鱼皮蛋白质相同的氨基酸组成，而且其消化吸收比蛋白质态更佳。某些低肽不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，同时还具有防病治病、调节人体生理机能的功效。有些水解多肽具有原食品蛋白或其组成氨基酸所没有的独特生理机能。
[0003]胶原肽的制备方法主要包括化学方法和酶法等。化学方法是利用酸或碱水解胶原蛋白，虽然方法简单、成本低廉，但水解过程中会破坏L-型氨基酸而形成D-型氨基酸，产物复杂，蛋白质的营养损失大，并且生产过程产生的废水多，生产周期长，不利于工业化生产。与酸法和碱法相比，酶法具有水解效率高、条件温和、易于控制水解进程等优点，尤其最重要的一点是能对蛋白质进行定向水解而产生具有特定生物活性的肽类。另外，酶法被广泛用来改善蛋白质的功能性质，如溶解性、乳化性、胶凝性能、起泡性、持水性和包油性等。
[0004]目前，鱼皮多肽的制备都是采用酶法，按照用酶的种类多少分为单酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分为复合水解法和分步水解法。由于每种酶都有自己的酶切位点，因此单酶水解只能切断有限的位点，不仅水解程度有限，而且水解产生的肽片段的端基氨基酸也是单一的。复合酶解则可以利用酶水解位点的互补作用和协同作用来提高底物的水解程度、酶解反应速度和 改变端基氨基酸的类型，更有可能水解出具有某种活性的肽片段，使酶解产品具有更好的理化性质。因此，复合酶解技术是蛋白质水解技术的发展趋势。
[0005]现有的酶解技术都是侧重于控制底物浓度、温度、pH、酶的用量等初始反应条件，然而随着酶解反应的进行，底物浓度和pH都是变化的，导致胶原多肽酶解过程存在复杂、繁琐、难于控制的问题，因此现有技术对反应过程中这些条件的变化很难进行有效控制，同时对苦味肽的控制也是酶解反应后采取方法脱除，没有在反应过程中控制苦味肽的产生。
[0006]传统工艺的脱色去腥都是采用单一活性炭，但产品的处理效果不好，需要采用其它的辅助处理工艺如双氧水等氧化剂进行氧化脱色。因为活性炭是由不同的原料和制备工艺制成的，这样每种活性炭都有自己的吸附特性和吸附选择性:吸附特定的杂质和吸附作用条件:温度、PH、溶液浓度、反应时间等，上述任何一个作用条件控制不合理都可以导致产品的处理效果不好，因此必须采用复合活性炭对产品进行处理。
[0007]另外，已有的胶原蛋白多肽产品存在着一个共同的问题是:分子量的分布不合理，而胶原肽的理化和功能性质与其分子量分布、氨基酸组成密切相关。相对平均分子量为3000的多肽产品中3000-5000道尔顿之间的分子量多肽也占一定比例，甚至5000道尔顿以上分子量的多肽也存在，500道尔顿以下的低分子量多肽比例达20%。500道尔顿以下的部分由寡肽和氨基酸组成，这部分组分的生物活性较差，且大部分是苦味肽。
【发明内容】
[0008]鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于通过对现有工艺及其参数进行改进，从而提供一种以深海鱼的鱼皮胶原蛋白液为底物进行酶解制备胶原多肽的方法。该方法制备的胶原多肽产品呈乳白色、口感平淡且分子量分布合理，各种理化性质较优。
[0009]为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案:
[0010]一种深海鱼皮胶原多肽的制备方法，该方法包括如下步骤:
[0011](1)取深海鱼皮胶原蛋白液粗品，调节胶原蛋白液的底物浓度为5%~6% ( W/V)及pH为6~8，在温度55°C下，添加占胶原蛋白量0.5%。(胃/胃)的复合蛋白酶，搅拌反应0.4~
0.6小时，所述的复合蛋白酶由碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按1:4的重量比组成，所述的碱性蛋白酶的酶活为2.4AU/g，所述的木瓜蛋白酶的酶活为60万IU/g ；
[0012](2)在步骤(1)的酶解液中继续加入酶活为500LAPU/g的风味蛋白酶，其添加量为胶原蛋白量的0.lXXW/W)，搅拌反应0.8~1.2小时，然后用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜过滤，过滤时间10~20分钟；
[0013](3)超滤过滤后，测定过滤后溶液的浓度和pH，调节溶液的底物浓度为5%~6%(W/V)及pH为6~8,继续反应0.4~0.6小时后再超滤一次,超滤后收集滤液；
[0014](4)将步骤(3)所得的滤液的胶原蛋白的浓度调节为4~6% (W/V)，升温到50~700C，pH为5~7，加入I~3%的复合活性炭(基于胶原蛋白的量)，分2~4次加入，搅拌20~40分钟，用板框过滤机过滤，得到清滤液；所述的复合活性炭由脱热原活性炭和脱色去腥活性炭按1:5重量比组成。
[0015](5)将步骤(4)所得的清滤液用截留分子量为400道尔顿的纳滤膜过滤，收集浓缩液，过滤液排放掉；
[0016](6)将步骤(5)所得的浓缩液进行喷雾干燥，进口温度170~190°C，出口温度70~90°C，得到粉末状胶原多肽。
[0017]优选地，如上所述的深海鱼皮胶原多肽的制备方法，其中步骤(1)中所述的深海鱼皮胶原蛋白液是以狭鳕、真鳕或黑线鳕的鱼皮为原料提取的胶原蛋白液。
[0018]优选地，如上所述的深海鱼皮胶原多肽的制备方法，其中所述的碱性蛋白酶为Alcalase2.4L。
[0019]优选地，如上所述的深海鱼皮胶原多肽的制备方法，其中所述的风味蛋白酶为Flavourzyme500MG。
[0020]与现有技术相比，本发明涉及的深海鱼皮胶原多肽的酶解制备工艺具有如下优点和显著进步:
[0021](1)本发明采用酶解和超滤分离联用工艺，做到真正的人为控制反应条件，使产品的分子量可控、分子量分布合理，从而产品的各种理化性质更好。
[0022](2)本发明的酶解和超滤分离是同时进行，并不需要酶解反应停止，克服了传统酶解工艺只是控制酶解反应初始条件，而反应过程没有进行控制而产生的产品质量问题，本发明可以真正的控制酶解反应的条件和水解过程，操作简单，且生产周期缩短。
[0023](3)本发明采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶组合，通过三种酶的协同作用，尽量减少了苦味肽的产生。
[0024](4)本发明在反应过程中用超滤除去小分子产物，避免了继续作为底物被生物酶分解成更小小分子产物，而小分子产物是胶原蛋白苦味肽的来源，这样进一步减少了苦味肽的生成，从而减少了产物的损失。
[0025](5)本发明用超滤连续除去小分子底物，提高了底物利用率，从而减少了生物酶的用量，传统工艺的用酶量2~3%。，而本发明工艺的用酶量0.5~1%。，并增加了酶反应速度。
[0026](6)本发明工艺的生产周期较传统工艺大为缩短。本发明不需要灭酶和真空浓缩过程，生产周期缩短，且采用复合酶分步水解工艺，缩短了酶解时间。
[0027](7)传统工艺都是采用高温灭酶，而本发明工艺不需要灭酶，因为生物酶的相对分子质量很大，一般从一万到几十万以致百万以上，而本发明采用的超滤膜的分子量截留值是3000道尔顿，所以生物酶不能通过该超滤膜进入到产物中，从而不需要灭酶，节省了成本和时间。
[0028](8)传统工艺都是采用真空浓缩，时间长，且需要耗费能源，本发明采用超滤膜分离，在脱除苦味肽的时候同时对产物进行了浓缩，且其在室温下进行，操作简单，过滤速度较快，生产周期缩短。
[0029](9)本发明采用超滤分离脱除苦味肽的的同时也脱掉盐和其它小分子杂质，产品的灰分大幅降低，提闻了广品的品质。
[0030](10)本发明采用复合活性炭对产品进行脱杂质，且采用分次吸附法，这样减少了活性炭的用量，提高了活性炭`的吸附选择性，从而可以把杂质完全脱除，而有效成分不损失。
【具体实施方式】
[0031]以下实施例进一步描述本发明的有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变也包含在本发明范围之内。
[0032]1、取深海鳕鱼皮胶原蛋白提取液粗品，加水调节底物浓度为5.5% (W/V),并调节PH为6.5，在温度55°C下，添加占胶原蛋白量0.5%o (W/W)的复合酶，其复合酶组成为碱性蛋白酶Alcalase:木瓜蛋白酶=1:4，酶解罐的体积为6立方，搅拌反应。
[0033]木瓜蛋白酶酶活:60万IU/克；碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶活:2.4AU/克。
[0034]2、酶解反应0.5小时后，加入风味蛋白酶FlavourZyme500MG，其添加量为胶原蛋白量的0.1%0 (W/W)，搅拌反应至I小时，用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜过滤，超滤时间为10分钟，过滤容器的体积为1.5立方。
[0035]Flavourzyme500MG 酶活:5OOLAPU/ 克；
[0036]3、超滤过滤后，测定过滤后溶液的浓度和pH，加水调节溶液底物的浓度为5.5%(W/V)和pH6.5，反应至1.5小时再超滤一次，超滤时间15分钟，超滤后调整溶液底物的浓度 5.5% (W/V)和 ρΗ6.8。
[0037]反应用水是用双级反渗透(R0膜)纯净水机制取的纯净水。用手持式折光仪测定胶原蛋白的浓度，手持式酸度计测定pH。[0038]4、酶解反应2小时后，终止反应，用超滤膜把酶解液全部过滤，收集所有的过滤液。
[0039]5、过滤后的酶解液升温到65°C，胶原蛋白的浓度调节为4.5% (W/V),pH为6.0，加入2%的复合活性炭(基于胶原蛋白的量)，分2次加入，搅拌25分钟，用板框过滤机过滤，得到清滤液。
[0040]测清滤液胶原蛋白的浓度为4.5% (W/V)，说明该作用条件下，活性炭只是吸附杂质，而胶原蛋白多肽没有被吸附，胶原蛋白没有损失。
[0041]6、将脱色去腥后的过滤液用截留分子量为400道尔顿的纳滤膜过滤，收集浓缩液，过滤液排放掉。
[0042]7、将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度180°C，出口温度80°C，得到乳白色的粉末状胶原蛋白多肽。
[0043]所制备的胶原蛋白多肽经国家轻工业三胶产品质量监督检测中心(北京)所检测的分子量和氨基酸指标，其结果参见表1、表2。
[0044]表1实施例所制备的胶原多肽产品的分子量检测结果(Da)
[0045]
【权利要求】
1.一种深海鱼皮胶原多肽的制备方法，该方法包括如下步骤: (1)取深海鱼皮胶原蛋白液粗品，调节胶原蛋白液的底物浓度为5%~6%(W/V)及pH为6~8，在温度55°C下，添加占胶原蛋白量0.5%o (W/W)的复合蛋白酶，搅拌反应0.4~0.6小时，所述的复合蛋白酶由碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按1:4的重量比组成，所述的碱性蛋白酶的酶活为2.4AU/g，所述的木瓜蛋白酶的酶活为60万IU/g ； (2)在步骤(1)的酶解液中继续加入酶活为500LAPU/g的风味蛋白酶，其添加量为胶原蛋白量的0.lXXW/W)，搅拌反应0.8~1.2小时，然后用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜过滤，过滤时间10~20分钟； (3)超滤过滤后，测定过滤后溶液的浓度和pH，调节溶液的底物浓度为5%~6%(W/V)及pH为6~8,继续反应0.4~0.6小时后再超滤一次,超滤后收集滤液； (4)将步骤(3)所得的滤液的胶原蛋白的浓度调节为4~6%(W/V)，升温到50~70°C，pH为5~7，加入1~3%的复合活性炭(基于胶原蛋白的量)，分2~4次加入，搅拌20~40分钟，用板框过滤机过滤，得到清滤液；所述的复合活性炭由脱热原活性炭和脱色去腥活性炭按1:5重量比组成。 (5)将步骤(4)所得的清滤液用截留分子量为400道尔顿的纳滤膜过滤，收集浓缩液，过滤液排放掉； (6)将步骤(5)所得的浓缩液进行喷雾干燥，进口温度170~190°C，出口温度70~90°C，得到粉末状胶原多肽。
2.根据权利要求1所述的深海鱼皮胶原多肽的制备方法，其特征在于:步骤(1)中所述的深海鱼皮胶原蛋白液是以狭鳕、真鳕或黑线鳕的鱼皮为原料提取的胶原蛋白液。
3.根据权利要求1所述的深海鱼皮胶原多肽的制备方法，其特征在于:所述的碱性蛋白酶为 Alcalase2.4L。
4.根据权利要求1所述的深海鱼皮胶原多肽的制备方法，其特征在于:所述的风味蛋白酶为 Flavourzyme500MG。
【文档编号】C12P21/06GK103805665SQ201410051480
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】荆仕聪 申请人:青岛华科生物技术有限公司