耐寒短杆菌及微生物菌剂和它们的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种耐寒短杆菌，其保藏编号为CGMCC?NO.8837。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体包括保藏编号为CGMCC?NO.8837的耐寒短杆菌。本发明还提供了如上所述的耐寒短杆菌和如上所述的微生物菌剂在防治农作物的病害中的应用。通过上述技术方案，本发明可以更加有效地防治农作物的线虫病害。
【专利说明】耐寒短杆菌及微生物菌剂和它们的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，具体地，涉及一种耐寒短杆菌、一种微生物菌剂和它们的应用。
【背景技术】
[0002]线虫引发的病害是近年来危害日趋严重的农作物病害之一，一般受害农作物可减产20-30%，严重的减产程度能达到60%，甚至绝产，危害程度相当严重。能够造成危害的线虫种类有3000多种，主要线虫种类有南方根线虫、爪哇线虫等。线虫主要是以成虫、卵在病株残体上或以幼虫在土壤中越冬，在无寄主的条件下也能够存活3年。在相对较好的环境中，卵可在几个小时内形成一龄幼虫。二龄幼虫非常活跃，从寄主植物根尖幼嫩处侵入，口针分泌的唾液诱导被害细胞过度增大,形成根瘤。雌雄成虫交配后,产卵于虫体后部的角质卵囊内，数量可达100-300粒。下一生长季节来临后，卵囊中的卵可孵化发育，二龄后离开土壤进入土壤再次侵染危害。线虫成虫适宜的温度条件是25-30°C，温度高于55°C或低于5°C时，成虫活动减弱。在27°C的条件下，线虫完成一代需要25-30天，一年可发生5_8代。春季温度低时，“线虫病”发病晚、轻、慢，定植一个月后，才见零星病株出现；秋茬栽培，气温高时，发病早、重、快，定植后11天即可发病。线虫主要分布在5-30厘米深的土壤中，但有人甚至在50厘米的土壤中发现了线虫，增加了防治的难度。
[0003]目前，防治线虫的方法包括化学药物法和生物防治法，化学防治法例如用溴灭泰、维博亩、必速灭、石灰氮等进行土壤熏蒸，但是这类土壤熏蒸剂具有灭生性，可杀死土壤中的病虫草鼠及有益微 生物等；生物防治法例如使用线虫生防真菌来杀灭线虫，线虫生防真菌通常存在萌发率较低且难以建立为控制线虫生长所需要的种群密度，导致它们在防治线虫上存在防效低且防效不稳定的缺陷。
【发明内容】
[0004]本发明的发明人分离了一株耐寒短杆菌，发现其具有优异的杀灭线虫的效果，由此得到了本发明。为了克服现有的生物防治线虫的方法存在的防效低且防效不稳定的缺陷，本发明提供了一种耐寒短杆菌，该耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)的保藏编号为CGMCC N0.8837。
[0005]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体包括保藏编号为CGMCC N0.8837的耐寒短杆菌。
[0006]本发明还提供了如上所述的耐寒短杆菌和如上所述的微生物菌剂在防治农作物的病害中的应用。
[0007]通过上述技术方案，本发明可以更加有效地防治根结线虫病和/或孢囊线虫病等农作物的病害。
[0008]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0009]生物材料保藏[0010]本发明的耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)是本发明的发明人从山东烟台采集的规模化沼气工程沼液样品中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCCN0.8837，保藏日期为2014年2月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)。
【具体实施方式】
[0011]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0012]本发明提供了一种耐寒短杆菌，该耐寒短杆菌(Brevibacteriumfrigoritolerans)的保藏编号为 CGMCC N0.8837。
[0013]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体包括保藏编号为CGMCC N0.8837的耐寒短杆菌。
[0014]其中，所述微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC N0.8837的耐寒短杆菌的活菌数可以为(1-500) X IO7CFU,优选情况下，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC N0.8837的耐寒短杆菌的活菌数可以为(5-150) X 107CFU。
[0015]根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以将各种能够用于培养耐寒短杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基、LB培养基等常用培养基作为种子培养基，用于菌种的保存；而发酵的培养基一般用于生产，这些培养基的种类也为本领域技术人 员所公知。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(Microbiology Culture Media Manual)的记载制备得到。例如，种子培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，其含有I_3g/L的牛肉膏、5-15g/L的蛋白胨、3-8g/L的氯化钠、15-20g/L的琼脂。例如发酵培养基可以含有:40-150g/L的豆粉、40-150g/L的淀粉、0.5_8g/L的氯化钠、0.5-5g/L的碳酸钙、2-10g/L的磷酸二氢钾和l-10g/L的硫酸亚铁。
[0016]其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125°C和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10_30分钟。
[0017]其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括:将CGMCC N0.8837的耐寒短杆菌接种于发酵培养基中进行培养。优选情况下，通过培养使得到的每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC N0.8837的耐寒短杆菌的活菌数可以为(1-500) X IO7CFU,更优选为(5-150) X 107CFU。其中，培养的温度可以为28-30°C，培养的时间可以为16-25小时。
[0018]本发明还提供了如上所述的耐寒短杆菌和如上所述的微生物菌剂在防治农作物的病害中的应用。
[0019]特别优选地，所述农作物的病害包括线虫病。更优选地，所述线虫病包括根结线虫病和/或孢囊线虫病。
[0020]以下通过实施例进一步详细说明本发明:
[0021]实施例1
[0022]本实施例用于说明本发明的耐寒短杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
[0023]将保藏编号为CGMCC N0.8837 的耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和120转/分振荡下培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到种子菌液。
[0024]将IOOmL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的豆粉、80g/L的淀粉、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的硫酸亚铁)，在30°C下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的耐寒短杆菌的活菌数为108CFU，所得到的培养液即为本实施例的微生物菌剂。
[0025]实施例2
[0026]按照实施例1的方法制备微生物菌剂，不同的是，所用的发酵培养基为含有60g/L的豆粉、100g/L的淀粉、2g/L的氯化钠、4g/L的碳酸钙、3g/L的磷酸二氢钾和3g/L的硫酸亚铁的培养基。
[0027]对比例I
[0028]将购自ATCC的商品号为ATCC⑧25097?的耐寒短杆菌(Brevibacteriumfrigoritolerans)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和120转/分振荡下培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到种子菌液。
[0029]将IOOmL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的豆粉、80g/L的淀粉、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的硫酸亚铁)，在30°C下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的耐寒短杆菌的活菌数为IO8CFU,所得到的培养液即为本对比例的微生物菌剂。
[0030]测试实施例1
[0031]本测试实施例中，在实验室环境测试实施例1、2和对比例I的微生物菌剂对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的抑制作用。南方根结线虫是根据文献(植物根结线虫生物学、分类鉴定和防治.北京:科学出版社，1983)中的方法，从被南方根结线虫侵染的番茄的病根中采集的。具体的采集方法包括:将患有线虫病的番茄病根用清水洗净，用镊子挑出病根上新鲜、饱满、成熟的卵块。将卵块放在装有无菌水的培养皿里(每克卵块用水5mL)，25°C恒温箱中培养，每隔24小时收集一次新孵化的南方根结线虫二龄幼虫，并将线虫悬浮在生理盐水中达到500条/毫升的浓度，作为线虫悬浮液待用。
[0032]将实施例1、2和 对比例I的微生物菌剂分别加入线虫悬浮液中作为处理实验，每20mL线虫悬浮液中加入Ig微生物菌剂，并以空白的发酵培养基(发酵培养基含有80g/L的豆粉、80g/L的淀粉、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的硫酸亚铁)作为空白对照，25°C恒温箱中培养I天后，显微镜下对存活线虫进行计数，将处理实验的死亡线虫数除以空白对照的死亡线虫数并换算为百分数,得到线虫死亡率,结果如表1所示。
[0033]表1
[0034]
【权利要求】
1.一种耐寒短杆菌，其特征在于:该耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)的保藏编号为CGMCC N0.8837。
2.一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，其特征在于:所述菌体包括保藏编号为CGMCC N0.8837的耐寒短杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于:每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC N0.8837的耐寒短杆菌的活菌数为(5-150) X 107CFU。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于:所述培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少一种。
5.根据权利要求2或3所述的维生素菌剂，其特征在于:所述培养基含有40-150g/L的豆粉、40-150g/L的淀粉、0.5-8g/L的氯化钠、0.5_5g/L的碳酸钙、2_10g/L的磷酸二氢钾和l-10g/L的硫酸亚铁。
6.权利要求1所述的耐寒短杆菌和权利要求2-5中任意一项所述的微生物菌剂在农作物的病害中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述农作物的病害包括线虫病。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述线虫病包括根结线虫病和/或孢囊线虫病。
【文档编号】C12N1/20GK103952348SQ201410167688
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】吕昭辉, 阮志勇, 赵秉强, 王慧敏, 赵君才, 赵文勇, 刘慧 , 宋昭, 王彦伟, 刘小飞 申请人:烟台地元生物科技有限公司