水稻高产等位基因gy6的功能特异性分子标记的制作方法
【专利摘要】本发明提供了检测水稻高产等位基因 GY6 的1个功能特异性分子标记Si2926/ Hha I，其上游引物序列如SEQ ID No:1所示、下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，利用该对引物对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增和限制性内切酶酶切，可以检测待测材料是否携带水稻高产等位基因 GY6 ，整个检测过程操作简单且准确性高。
【专利说明】水稻高产等位基因GY6的功能特异性分子标记
【技术领域】
[0001]本发明涉及水稻育种中的检测【技术领域】，特别是高产等位基因碰]I个功能特异性分子标记。
【背景技术】
[0002]水稻是世界上最重要的粮食作物之一。提高水稻单产对解决粮食安全问题具有重要意义。水稻的单株产量由三个构成因子决定:单株穗数、每穗实粒数和千粒重，均属于复杂的数量性状，受多个数量性状基因(Quantitative trait loci，QTL)控制。近年来，随着水稻全基因组测序的完成，水稻产量性状QTL的克隆研宄取得了快速发展，已克隆了 16个控制株型、穗形、每穗实粒数、每穗颖花数和千粒重等水稻产量相关性状的QTL。然而，相对于产量性状的复杂性，目前对其遗传基础的了解还相当有限，因此，迫切需要挖掘更多的产量基因，不仅为理解其遗传基础提供理论根据，而且也为更好更快地培育高产新品种提供基因资源和技术支持。
[0003]目前，分子标记辅助选择(MAS)在水稻育种中得到越来越广泛地应用，但大多数的选择仍是基于与基因连锁的分子标记，而非基因本身的基因标记，特别是功能性标记。应用功能性标记进行MAS可以克服连锁分子标记所带来的一些弊端:1)遗传累赘，即目的基因(有利基因)与其附近的非目的基因(不利基因)存在连锁，在导入目的基因的同时也带入了不利基因，导致改良达不到预期目标；2)标记信息误导，即标记仍然存在，但由于重组使标记与基因分离，导致目标基因的缺失，造成假阳性的发生。
[0004]水稻产量基因伽是本发明人最近克隆的一个产量基因(专利号:ZL201210047301.0 ;发明名称:水稻产量基因的克隆及其应用)。为了加快0?基因在育种中的应用进程，有必要开发出准确有效的鉴定CM高产等位基因的功能特异性分子标记。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供鉴定高产等位基因的功能特异性分子标记Si2926/ HhaI的引物，所述片段如序列表SEQ ID ΝΟ:1-2所示。
[0006]具体地，所述引物对的核苷酸序列如下:
上游引物序列为5’ -CCGGATCACTAACCTCAGCG-3’，如序列表SEQ ID No:1所示；
下游引物序列为5’ -GCATCCAAGATATGATCCGTA-3’，如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0007]本发明通过以下技术方案实现:
以0?基因的珍汕97型和密阳46型等位基因的核苷酸和氨基酸序列为基础，进行序列比对分析，针对第31位氨基酸差异，应用Oligo 7.0软件设计出I个dCAPS标记Si2926/Hha K先应用珍汕97和密阳46进行PCR扩增和限制性内切酶酶切，验证其检测效果和多态性。再应用该分子标记对衍生于珍汕97/密阳46、在0?基因区间存在功能差异的近等基因系群体进行功能验证，并经进一步应用66份水稻种质资源进行基因型检测。表明该功能特异性分子标记对仍货高广等位基因的检测可靠性尚，可以应用于仍货高广等位基因的转育研宄中。
[0008]本发明具有如下明显的有益效果:
本发明通过比较C汕97型和密阳46型两种等位基因的核苷酸和氨基酸序列，基于氨基酸差异位点设计开发了 I个功能特异性分子标记。应用该功能特异性分子标记，以常规PCR技术为基础辅以限制性内切酶酶切，如果得到的片段大小为135 bp，则待测水稻材料含有高产等位基因不仅能快捷有效地从育种群体中筛选到携带目标基因型的个体，而且能准确区分不同水稻资源的等位基因型。
[0009]本发明开发的分子标记源自基因内部功能特异性位点的多态性，不存在遗传累赘和假阳性的问题，以之为基础对目标基因进行常规杂交转育、聚合育种或转基因应用，可以大大节约时间和成本，增加筛选准确性，提高育种效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为珍汕97型和密阳46型等位基因氨基酸序列比对结果。
[0011]图2为分子标记Si2926/通a I在珍汕97和密阳46中的检测结果。其中，M !Maker ；ZS:珍汕97 ；MY:密阳46 ；M左侧为PCR产物，右侧为酶切产物。
[0012]图3为分子标记Si2926//*a I在近等基因系群体中的检测结果。其中，Z:珍汕97 ;M:密阳46 ；1-15:携带珍汕97型等位基因的株系；16-30:携带密阳46型等位基因的株系O
[0013]图4为分子标记Si2926/?a I在66份籼型杂交稻亲本中的检测结果。其中，1:11-32B ；2:D优62B ；3:V20B ；4:博B ；5:川香29A ；6:菲改B ；7:丰源 A ;8:冈 46B ；9:金 23B ；10:龙特浦B ;11:内香2A ；12:内香85A ；13:天丰A ;14:协青早B ;15:印32B ；16:优IB ；17:珍汕 97B ；18:中 100A ；19:中 IA ;20:中 2B ；21:中 3B ;22:中 9B ；23:中浙 A ;24:207 ；25:253 ；26:926:27:CDR22 ；28:R402 ；29:To974 ；30:ZDZ057 ；31:测 64 ；32:多系 I 号；33:恩恢 58 ；34:辐恢 718 ；35:广恢 128 ；36:桂 99 ；37:江恢 151 ；38:泸恢 17 ；39 ;密阳 46 ；40:绵恢501 ；41:绵恢725 ；42:明恢63 ；43:明恢70 ;44:明恢77 ;45:明恢86 ；46:蜀恢162 ；47:蜀恢 527 ；48:盐恢 559 ；49:宜恢 1577 ；50:镇恢 084 ；51:CH238 ；52:CH59 ；53:中恢218 ；54:中恢 8006 ；55:中恢 111 ；56:中恢 1176 ；57:中恢 333 ；58:中恢 161 ；59:特青；60:IR24 ；61:中恢 8012 ；62:中恢 8015 ；63:中恢 465 ；64:中恢 7492 ；65:R600 ；66:恢 66。
【具体实施方式】
[0014]以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0015]实施例1 61!?基因特异性分子标记的开发
1.等位基因氨基酸序列比对及特异氨基酸位点的鉴定
利用序列比对软件DNASTAR MegAlign模块(Lasergene)对珍汕97和密阳46在基因座位上氨基酸序列(专利号:ZL 201210047301.0，SEQ ID No:3和SEQ ID No:6)进行序列比对分析。鉴定到GY6蛋白在6个氨基酸位点上存在差异，分别为A3IV、K105E、N144S、K146R、D147N 以及 A160T (图1)。
[0016]2.0?基因特异性分子标记引物的设计
针对上述6个氨基酸差异位点中的第31位氨基酸位点，根据CAPS标记设计原理，应用在线软件 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)和 Oligo 7.0 (Molecular B1logy Insights)设计引物。其上游引物序列为5’ -CCGGATCACTAACCTCAGCG-3’，下游引物序列为 5’ -GCATCCAAGATATGATCCGTA-3’。
[0017]3.DNA微量提取
(I)剪取水稻幼苗叶片2?3 cm，剪成0.5 cm长的碎片，放入2.0 mL离心管中。
[0018](2)加入450 μ I DNA提取液和一颗钢珠，应用组织研磨仪进行研磨。
[0019](3)加入450 μ I氯仿萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀。
[0020](4) 11，000 rpm离心2分钟至清晰分相。吸取上清液400 μ 1，转入新的1.5 ml尚;匕、官中，弃枪头。
[0021](5)加入800 μ I预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀。_20°C放置30分钟。
[0022](6) 11，000 rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。
[0023](7)用70%乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5 ml离心管倒置于纸上，自然干燥。
[0024](8)加入100 μ I的1/10XTE缓冲液溶解沉淀。
[0025](9 )取 2 μ I 进行 PCR 扩增。
[0026]4.PCR扩增及检测
扩增反应体系如下:10XPCR Buffer 2 μ I, dNTPs (2.5 mM each) 1.6 μ?，引物(5pmol) 2 μ I, Taq 酶(2.5 U/μΙ，Cwb1)0.2 μ?，DNA 模板(50 ng/ μ I) 2 μ?，加 ddH20至 20 μ 1 反应条件:94°C 2 分钟；94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 30 秒，30 循环；72°C 8分钟；10°C保存。
[0027]取2 μ I PCR产物上样于2%琼脂糖凝胶，接通电极，在100V恒定电压下电泳I小时，关闭电源；取下凝胶，GelRed (B1tium)染色后凝胶成像。
[0028]5.PCR产物酶切及检测
酶切反应体系如下:10XBuffer M 2 μ 1，限制性内切酶胤a I (Takara) I μ I, PCR产物7 4 1，加(1(1!120至20 4 1;反应条件:37°0 3小时。
[0029]取10 μ I PCR产物上样于2%琼脂糖凝胶，接通电极，在100V恒定电压下电泳1.5小时，关闭电源；取下凝胶，GelRed (B1tium)染色后凝胶成像。
[0030]结果显示，应用Si2926引物扩增珍汕97和密阳46，其PCR产物大小均为155 bp,经通a I酶切后，珍汕97获得135 bp的片段，而密阳46保持不变(图2)。
[0031]实施例2 0?基因特异性分子标记在近等基因系群体中的验证
以衍生于珍汕97/密阳46的I套近等基因系群体为材料，该群体只在CM区间分离，含珍汕97和密阳46两种基因型，与后者相比，前者实粒数多、千粒重大、产量高，对仍^基因特异性分子标记Si2926//*a I进行功能验证。应用实施例1中描述的PCR扩增体系及反应条件，利用Si2926/?a I进行扩增和酶切。
[0032]电泳结果(图3)显示，Si2926/通a I在近等基因系群体中呈现分离，实粒数多、千粒重大、产量高的株系(1-15号)都检测出与珍汕97 —样的带型，表明它们均携带珍汕97型高产等位基因；反之，其余株系(16-30号)则携带密阳46型等位基因。该结果表明，本发明提供的分子标记Si2926/?a I对CM高产等位基因的检测可靠性高，可以作为0?基因的功能特异性分子标记，应用于CM高产等位基因的转育研宄中。
[0033]实施例3 0?基因特异性分子标记在水稻种质资源中的检测利用基因功能特异性分子标记Si2926//*a I，对66份籼型杂交稻亲本进行检测。结果表明，17份亲本携带珍汕97型等位基因，49份亲本携带密阳46型等位基因(图4)。
【权利要求】
1.检测水稻高产等位基因的功能特异性分子标记Si2926/?a I的引物，其特征在于:其上游引物序列为5’-CCGGATCACTAACCTCAGCG-3’，如序列表SEQ ID No:1所示；其下游引物序列为 5’ -GCATCCAAGATATGATCCGTA-3’，如序列表 SEQ ID N0.2 所示。
【文档编号】C12N15/11GK104450897SQ201410681948
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】樊叶杨, 庄杰云, 朱玉君 申请人:中国水稻研究所