本发明涉及一种具有增强免疫力功效的组合物及其制备方法，属于天然药物制备领域。
背景技术：
：：免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)，处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞，以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力，是人体识别和排除“异己”的生理反应。人之所以能在各种环境中健康地生存，人体免疫系统起着决定性的作用。在我们的周围存在很多致病性因素，最普通的就是各种致病细菌、霉菌、病原体、衣原体和病毒等，统称为病原微生物。细菌传播的疾病目前虽有很多有效的治疗药物，但是细菌也常对抗菌药物产生耐药现象，而新抗菌药物发现发明速度跟不上，那么人类抵抗细菌性疾病的问题，就是依靠提高自身的免疫力。现代社会，由于竞争激烈，压力增大，生活节奏越来越快，加上人们的生活习惯、饮食习惯等的快速改变，运动量、睡眠时间的减少，使机体不停地受到损伤，从而造成免疫力下降。免疫力的下降直接导致机体的抗疾病能力下降，直接表现为易感冒、伤口愈合变慢、胃肠道功能减弱、易疲劳等症状。由此可见，增强免疫力的保健食品具有非常大的市场。本发明选取紫苏籽油、越橘提取物和维生素e作为配方原料。紫苏籽油被认为是富含α-亚麻酸的最好的食用油，α-亚麻酸（α-lna）含量高达50％~70％。α-亚麻酸属ω-3系列不饱和脂肪酸，是人体必需的不饱和脂肪酸之一，具有降低胆固醇、降血压、提高记忆力、保护视力、增强免疫力、延缓机体衰老、预防老年痴呆症以及在治疗心脑血管疾病、抗癌、促进大脑发育等方面均有显著作用。越橘提取物能增强免疫功能，表现在原花青素可以提高白细胞介素2的免疫应答能力。原花青素能防止自由基的氧化作用，具有强力抗氧化和抗过敏功能，能穿越血脑屏障，可保护脑神经不被氧化，稳定脑组织功能，保护大脑不受有害化学物质和毒素的伤害，而且原花青素还可以促进血液循环，排除体内自由基，恢复微血管功效，从而改善体内微循环，逆转人体亚健康。维生素e是体内的抗氧化剂，同时又是一种有效的免疫调节剂。维生素e不仅与正常的生育繁殖密切相关，而且还有很多其他营养保健功能。越来越多的研究证明，维生素e是一种高效抗氧化剂，可阻止有毒自由基对机体细胞组织的伤害，维持肌肉的正常生长发育，保持机体内细胞膜的完整性和正常生理功能，并能有效地减少细胞中脂褐质生成，保护细胞，从而起到增强人体免疫功能的作用。技术实现要素：：本发明的目的是要提供一种具有增强免疫力功能的组合物及其制备方法。得到的组合物食用安全，具有显著地增强免疫力的保健功效，其制备方法成本低，具有良好的市场开发前景。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种具有增强免疫力功能的组合物，该组合物的原料组成按质量百分比计为：紫苏籽油75%-85%、越橘提取物5%-15%、维生素e3%-8%、蜂蜡3%-8%，上述百分比总和为100%。优选的组合物原料组成按质量百分比计为：紫苏籽油80%、越橘提取物10%、维生素e5%、蜂蜡5%。本发明还提供了所述增强免疫力的组合物中原料和组合物的制备方法，包括以下步骤：（1）紫苏籽油：紫苏籽分拣、漂洗、浸泡到含水率至10%之后进行蒸炒，120℃下蒸炒15min，经蒸炒的紫苏籽在螺旋榨油机中，预热至110℃进行预榨，获得部分油脂，预榨饼厚度为10mm，至浸出器中用正己烷（1:1）逆流浸出，温度为50℃，110min，真空浓缩去溶剂，得到浸出油，合并预榨油和浸出油；毛油中加入油重0.3%的无碘饱和食盐水，再加入油重2%的热水，反应5min，5000r/min离心除去胶质；搅拌加入naoh至中性，升温至60℃，停止搅拌，静置沉淀，放出油脚；取油重20%的浓度8%盐水洗涤2遍，加热至65℃，真空旋转蒸发脱水；脱水后加入油重3%的活性白土搅拌吸附脱色，脱色温度为80℃，1h，待油温冷却至70℃以下真空过滤得脱色油；脱色油在240℃下进行真空脱臭，真空度为0.005mpa，1.5h，待温度冷却至120℃以下，加入油重0.02%的柠檬酸和油重0.02%的抗氧化剂叔丁基对苯二酚；除臭后的油置于冷冻锅中，冷冻液温度控制在6℃，保持24h,后，真空冷冻抽滤；将抽虑后的油脂称重分装后储存备用。（2）越橘提取物：越橘果实筛选，除去未成熟果；用1.5mol/l盐酸：60%酒精（10：90）作为提取液，料液比1:25，浸提3次，每次1小时，过滤，合并浸提液；将浸提液减压浓缩至相对密度为1.10；浓缩液进行喷雾干燥，进口温度190℃，出口温度70℃，得到越橘提取物。（3）维生素e过100目筛备用；（4）蜂蜡检验合格后备用；（5）原料混合调配：称取配方量的紫苏籽油和蜂蜡，将蜂蜡投入紫苏籽油中，加热至60-70℃，使蜂蜡全部溶解；加入配方量的越橘提取物和维生素e，混合并搅拌均匀，混合液过胶体磨3遍，再移入乳化锅抽去气泡（负压0.09mpa、35~40℃下处理10~20min），最后过100目筛2遍，25℃~35℃下保温备用，即为本发明组合物。整个生产过程中生产环境空气洁净度10万级；室温为18-26℃，相对湿度为45-65％。本发明的生产原料品质优良，安全性和功效性研究深入透彻，将这三种原料配合使用，经动物试验证明具有良好的增强免疫力的功效。本发明生产工艺简便，易于操作，可实现工业化连续生产，因此生产成本低，具有良好的产品市场前景。具体实施方式：下面用具体实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。实施例1组合物的原料组成按质量百分比计为：紫苏籽油75%、越橘提取物15%、维生素e5%、蜂蜡5%。其制备方法包括如下步骤：（1）紫苏籽油：紫苏籽分拣、漂洗、浸泡到含水率至10%之后进行蒸炒，120℃下蒸炒15min，经蒸炒的紫苏籽在螺旋榨油机中，预热至110℃进行预榨，获得部分油脂，预榨饼厚度为10mm至浸出器中用正己烷（1:1）逆流浸出，温度为50℃，110min，真空浓缩去溶剂，得到浸出油，合并预榨油和浸出油；毛油中加入油重0.3%的无碘饱和食盐水，再加入油重2%的热水，反应5min，5000r/min离心除去胶质；搅拌加入naoh至中性，升温至60℃，停止搅拌，静置沉淀，放出油脚；取油重20%的浓度8%盐水洗涤2遍，加热至65℃，真空旋转蒸发脱水；脱水后加入油重3%的活性白土搅拌吸附脱色，脱色温度为80℃，1h，待油温冷却至70℃以下真空过滤得脱色油；脱色油在240℃下进行真空脱臭，真空度为0.005mpa，1.5h，待温度冷却至120℃以下，加入油重0.02%的柠檬酸和油重0.02%的抗氧化剂叔丁基对苯二酚；除臭后的油置于冷冻锅中，冷冻液温度控制在6℃，保持24h,后，真空冷冻抽滤；将抽虑后的油脂称重分装后储存备用。（2）越橘提取物：越橘果实筛选，除去未成熟果；用1.5mol/l盐酸：60%酒精（10：90）作为提取液，料液比1:25，浸提3次，每次1小时，过滤，合并浸提液；将浸提液减压浓缩至相对密度为1.10；浓缩液进行喷雾干燥，进口温度190℃，出口温度70℃，得到越橘提取物。（3）维生素e过100目筛备用；（4）蜂蜡检验合格后备用；（5）原料混合调配：称取配方量的紫苏籽油和蜂蜡，将蜂蜡投入紫苏籽油中，加热至60-70℃，使蜂蜡全部溶解；加入配方量的越橘提取物和维生素e，混合并搅拌均匀，混合液过胶体磨3遍，再移入乳化锅抽去气泡（负压0.09mpa、35~40℃下处理10~20min），最后过100目筛2遍，25℃~35℃下保温备用。实施例2组合物的原料组成按质量百分比计为：紫苏籽油80%、越橘提取物10%、维生素e5%、蜂蜡5%。实施例3组合物的原料组成按质量百分比计为：紫苏籽油85%、越橘提取物5%、维生素e6%、蜂蜡4%。实施例4组合物的原料组成按质量百分比计为：紫苏籽油78%、越橘提取物11%、维生素e8%、蜂蜡3%。实施例5为验证本发明组合物的功效性，做了小鼠功能试验。料与方法1.1样品：本发明组合物1.2试验动物与分组：spf级昆明种雌性小鼠200只，体重18~22g。饲料由同一单位提供。每40只小鼠为一大组，共五大组。免疫1组进行碳廓清试验；免疫2组进行cona诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、nk细胞的活性测定；免疫3组进行脏体比值测定、半数溶血值（hc50）的测定和抗体生成细胞数的测定；免疫4组进行迟发型变态反应（dth）实验，免疫5组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。每大组40只小鼠按体重随机分为4小组，即对照组和低、中、高剂量组。剂量选择：低、中、高剂量分别为0.167g/kg.bw、0.333g/kg.bw、1.000g/kg.bw（相当于人体推荐剂量的5、10、30倍）；对照组用植物油进行灌胃。试验方法：1.4.1脏器/体重比值测定称重后处死小鼠，取出脾脏和胸腺，在电子分析天平上称重，计算脏/体比值。迟发型变态反应（足跖增厚法）小鼠腹腔注射2%（v/v）srbc（0.2ml/每鼠）致敏后4天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20%（v/v）srbc（20μl/每鼠），于注射后24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。以攻击前后足跖厚度差值来表示dth的程度。诱导的小鼠淋巴细胞转化实验（mtt法）无菌取脾，置于盛有适量无菌hanks液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用hank’s液洗两次，每次离心10分钟（1000r/min）。然后将细胞悬浮于1ml完全培养基中，计数活细胞数，用rpmi1640培养液调整细胞浓度为3×106个/ml。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，在其中一孔加75μlcona液（相当于7.5μg/ml），另一孔作为对照，置5%二氧化碳，37℃培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的rpmi1640培养液，同时加入mtt（5mg/ml）50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加cona孔的光密度值减去不加cona孔的光密度值表示。抗体生成细胞检测（jerne改良玻片法）取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，将压积srbc用生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2ml。4天后将小鼠处死，取脾，轻轻磨碎，用hank’s液制成细胞悬浮，200目筛网过滤，洗涤、离心2次，最后将细胞悬浮在8mlhanks液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/ml。将表层培养基加热溶解后与等量的ph7.4、2倍浓度的hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加入用sa液配制的10%srbc50μl（v/v）、20μl脾细胞悬液（5×106个/ml），迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，待琼脂糖凝固后将玻片水平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，然后用sa液稀释的补体（1：8）加入到玻片凹槽内，继续温育1.5h后计数溶血空斑数。半数溶血值（hc50）的测定取羊血，用生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2%（v/v，用生理盐水配制）srbc0.2ml进行免疫。4天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心10min，收集血清。用sa缓冲液将血清稀释为200倍，取1ml置试管内，依次加入10%srba0.5ml，补体1ml。另设不加血清的对照管。置于37℃恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应。2000rpm离心10min取上清液1ml，加都氏试剂3ml。同时取10%srbc0.25ml，加都氏试剂至4ml于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值（hc50）表示，按下式计算：hc50=样品光密度值/srbc半数溶血时的光密度值×稀释倍数。小鼠碳廓清实验小鼠尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每10g体重注射0.1ml，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min，分别从脾静脉丛取血20μl，加入到2ml0.1%na2co3溶液中，摇匀。以0.1%na2co3溶液作空白对照，600nm下测光密度值。将小鼠处死，取肝、脾，称重，计算吞噬指数a。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验小鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液，间隔30min，颈椎脱臼处死，仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min。取腹腔巨噬细胞洗液1ml，滴于载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置于37℃孵箱温育30min。孵育完后于生理盐水中漂洗以除去未贴片细胞。晾干，以甲醇：丙酮（1:1）固定，4%giemsa-磷酸缓冲液染色，用蒸馏水漂洗晾干。油镜下每片计数100个吞噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：吞噬率=鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞×100%吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数1.4.8nk细胞活性的测定受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用hank’s洗液清洗2次，每次离心10min（1000转/min），弃去上清液将细胞浆弹起，加入0.5ml灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5ml2倍hank’s液及8mlhank’s液，1000rpm离心10min，用1ml含10%小牛血清的rpmi1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数，用台酚蓝染色计数或细胞数，调整细胞浓度为2×107个/ml，此为效应细胞，取传代后24h生长良好的yac-1细胞用rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml，此为靶细胞；取靶细胞和效应细胞各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%triton各100μl；上述各项均设三个平行孔，于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100μl置平底96孔培养板中，同时加入ldh基质液100μl，根据室温反应3-10min，每孔加入1mol/l的hcl30μl，在酶标仪490nm处测定光密度。nk细胞活性=[(反应孔od-自然释放孔od)/(最大释放孔-自然释放孔od)]×100%1.5实验数据统计用excel、spss软件对数据进行转化和统计分析。结果2.1组合物对小鼠体重的影响见表1-表5.各剂量组实验初期、中期末期小鼠体重及实验期间小鼠体重增长与对照组比较，差异均无显著性（p>0.05）。表1免疫1组小鼠体重组别动物数初始体重中期体重末期体重增重（只）（g）（g）（g）（g）对照组1020.35±1.2428.58±2.5433.63±2.3613.28±2.83低剂量1020.32±1.2227.74±1.9232.76±2.1412.44±2.30中剂量1020.38±1.1328.13±2.2232.95±2.1012.57±2.07高剂量1020.43±1.1727.92±1.8933.58±1.9813.15±2.48表2免疫2组小鼠体重组别动物数初始体重中期体重末期体重增重（只）（g）（g）（g）（g）对照组1019.87±1.4428.56±1.9833.35±1.9013.48±2.27低剂量1019.86±1.3727.72±2.6332.70±2.6412.84±1.61中剂量1019.89±1.2528.64±2.6933.39±2.7513.50±2.58高剂量1019.93±1.3728.11±2.8333.23±2.7913.30±2.46表3免疫3组小鼠体重组别动物数初始体重中期体重末期体重增重（只）（g）（g）（g）（g）对照组1019.92±1.3527.50±3.1932.18±3.2513.26±2.92低剂量1019.96±1.2228.64±2.3733.38±2.4013.42±1.98中剂量1019.97±1.1427.60±2.2232.58±2.3612.61±2.24高剂量1020.03±1.2328.06±2.3232.83±2.5712.80±1.80表4免疫4组小鼠体重组别动物数初始体重中期体重末期体重增重（只）（g）（g）（g）（g）对照组1019.97±1.3028.32±2.2632.18±3.2512.95±2.54低剂量1020.05±1.2327.81±1.6333.38±2.4013.63±1.78中剂量1020.01±1.1127.86±2.4132.58±2.3612.42±2.13高剂量1020.13±1.2828.09±2.2132.83±2.5713.24±1.86表5免疫5组小鼠体重组别动物数初始体重中期体重末期体重增重（只）（g）（g）（g）（g）对照组1019.60±1.2627.65±3.1732.58±3.1212.98±2.77低剂量1019.61±1.2227.93±2.4332.81±2.4313.20±2.29中剂量1019.61±1.1028.21±2.5633.25±2.5913.64±2.33高剂量1019.64±1.1927.43±1.8732.39±1.6112.75±1.652.2组合物对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响见表6.组合物各剂量对小鼠脾脏/体重比值和胸腺/体重比值无显著影响（p>0.05）。表6组合物对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响2.3组合物对小鼠细胞免疫功能的影响2.3.1组合物对小鼠迟发型变态反应（dth）的影响见表7。中、高剂量组小鼠迟发型变态反应能力与对照组比较差异显著（p<0.05）。表7组合物对小鼠迟发型变态反应（dth）的影响2.3.2组合物对小鼠cona诱导的淋巴细胞转化能力的影响见表8。组合物各剂量对小鼠淋巴细胞转化能力无显著影响（p>0.05）。表8组合物对小鼠淋巴细胞转化能力的影响2.4组合物对体液免疫的影响2.4.1组合物对小鼠抗体生成细胞数的影响见表9。高剂量组对小鼠抗体生成细胞数与对照组比较显著提高（p<0.01）。表9组合物对小鼠抗体生成细胞数的影响2.4.2组合物对小鼠半数溶血值（hc50）的影响见表10。高剂量组小鼠半数溶血值（hc50）与对照组比较显著提高（p<0.05）。表10组合物对小鼠半数溶血值（hc50）的影响2.5组合物对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响2.5.1组合物对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清的影响见表11。各剂量对小鼠碳廓清能力无显著影响（p>0.05）。表11组合物对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清的影响2.5.2组合物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响见表12-1、12-2。组合物各剂量对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力无显著影响（p>0.05）。表12-1组合物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率的影响表12-2组合物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数的影响2.6组合物对小鼠nk细胞活性的影响见表13。中、高剂量组对小鼠nk细胞活性与对照组相比较显著提高（p<0.05）。表13组合物对小鼠nk细胞活性的影响3结论在本实验室条件下，经口灌胃给予小鼠0.167g/kg.bw、0.333g/kg.bw、1.000g/kg.bw剂量的本发明组合物30天，与对照组比较，0.333g/kg.bw、1.000g/kg.bw剂量能显著提高小鼠迟发型变态反应能力、nk细胞活性，1.000g/kg.bw剂量能显著提高小鼠半数溶血值、抗体生成细胞数（p<0.05），各剂量对小鼠体重增长、胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、单核-巨噬细胞碳廓清能力、淋巴细胞转化能力及巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力均无显著影响（p>0.05）。提示本发明组合物具有增强免疫力的功能。实施例6取实施例1所得的组合物，适当加入药用辅料，以常规方法制成软胶囊剂药品或保健食品。当前第1页12