poulos(2002)通过基因组重排改 造了细菌表型；Patna化等（2002)利用基因组产品技术实现了乳酸杆菌的一株工业菌株 的改良，令其在抑4.0下乳酸产量为出发野生菌株的3倍；Gao等（2012)通过两轮基因 组重排，使 Clostridium acetobut}di州m CICC 8012 产 Acetone-Butanol-Ethanol (ABE0 提高了 34. 53% ;Ge 等（2012)通过基因组重排获得 Saccharomyces cerevisiae GS3-10， 其对五碳糖和六碳糖的转化率达到69. 48 %和100%，而出发菌株为14. 83 %和100%， 己醇产率达到47.08g/l，而出发菌株为18. 12g/L;Kang等（2011)通过基因组重排，使 Aureobasidium pullulans产普鲁藍多糖大幅度提高，并且遗传稳定；Zheng等（2010)通 过基因组重排提高了 Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538的D-乳酸产率和耐 酸性；化hn等（2008)通过原生质体融合式的基因组重排，获得了 W木馨-甘庶渣为基质 的乳酸高产菌株；化等（2008)通过基因组重排获得了糖耐度提高从而乳酸产率增加的 Lactobacillus rhamnosus ;Wang等（2007)通过基因组重排获得了耐酸度提高从而乳酸产 率增加的 Lactobacillus rhamnosus。
[0024] 基因组重排也为进行微生物代谢组学分析提供了支撑。经过基因组重排而代谢 优化的目的菌其遗传背景来源于出发菌，故通过比对目的菌与出发菌的蛋白表达谱差异， 辅W代谢流和代谢控制分析技术，即可解析导致代谢优化的关键酶及有关途径的调控机 审ij。Luo 等（2012)通过基因组重排使 Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的游霉素 (natamycin)产率明显升高，Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326 的蛋白表达谱发生 明显改变，34种蛋白表达上升而20种蛋白表达下降，提示与游霉素合成有关的牵设广泛的 代谢网络得到优化；化ang等（2010)通过基因组重排，使Propionibacterium shermanii产 心2大幅度提高，重排后菌株38种蛋白表达发生改变，其中22种蛋白表达上升而16种蛋白 表达下降，在表达上升的22种蛋白中，有6种是Vei2合成途径中的酶，提示与Vei2合成有关 的牵设广泛的代谢网络得到优化。
[0025] 但目前基因组重排在策略上存在一定缺陷，主要是选育培养基与发酵培养基之间 无关联，使得选育到的菌株在发酵时目标产物产率远低于预期。针对此问题，本发明在进行 基因组重排选育时，选育平板中添加一定比例的发酵培养基组分，而发酵培养基中添加一 定比例的选育平板组分，使得选育与发酵两环节之间形成关联，保障了选育环节表现出高 产表型的菌株在发酵时依然表现出高产表型，此即为本发明的底物诱导适应性策略。因此， 在对纳豆芽抱杆菌高产NK兼PQQ表型进行基因组重排选育时，在选育平板中添加一定比例 白芸豆汁，而在白芸豆乳发酵时则添加一定比例豆芽汁。
【发明内容】
[0026] 本发明提供了一种纳豆芽抱杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方法， 本发明在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略，对纳豆芽抱杆菌所有可 能与NK和PQQ合成有关的主流及旁支途径统筹优化，实现多位点协同突变，进而通过高通 量筛选使多位点协同突变的表型从突变库中凸显，获能够在白芸豆乳发酵中高产NK兼PQQ 的纳豆芽抱杆菌BN-NKPQQ-RWX-205。同时，通过随机诱变获得甲硫氨酸营养缺陷（Mef)干 酪乳杆菌（Lactobacilluscasei Shirota-Met-，LcS-Met-)。LcS-Met-在生长速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-205,但前者对后者营养依赖，两者之间形成稳定共生关系，保障了共发酵顺 利完成，从而获得富含NK和PQQ的白芸亞乳。
[0027] 一种纳豆芽抱杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方法，包括W下步 骤：
[002引 1)、将产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌10261和纳豆芽抱杆菌10263分别进行亚硝基 脈诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，在基因组重排技术基础上进一步 采用底物诱导适应性策略，高通量筛选得到高产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌，命名为纳豆芽 抱杆菌 BN-NKPQQ-RWX-205 ;
[0029] 细胞融合传代培养实现基因组改组，使纳豆芽抱杆菌10261和10623所有诱变后 代的优势突变得到优化整合。如有必要，可对融合后代进行第二轮或者多轮诱变及融合，直 至选育出NK兼PQQ产率高且生长旺盛、遗传稳定、适合作为生产菌株的高产NK兼PQQ纳豆 芽抱杆菌。
[0030] 2)、将干酪乳杆菌（Lactobacillus casei化irota)进行亚硝基脈诱变，从中筛选 出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LcS-Met-(Lactobacillus casei Shirota-Met_)；
[003U 3)将纳豆芽抱杆菌BN-NKPQQ-RWX-205和干酪乳杆菌LcS-Met-共发酵白芸豆汁， 得到富含NK和PQQ的白芸豆乳，得到的富含NK和PQQ的白芸豆乳即为食疗白芸豆乳。
[0032] 本发明在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略，对纳豆芽抱杆 菌所有可能与NK和PQQ合成有关的主流及旁支途径统筹优化，实现多位点协同突变，进而 通过高通量筛选使多位点协同突变的表型从突变库中凸显，获得能够在白芸豆乳发酵中高 产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌BN-NKPQQ-RWX-205。同时，通过随机诱变获得甲硫氨酸营养缺 陷（Met-)干酪乳杆菌LcS-Met-。
[0033] 欲使干酪乳杆菌与纳豆芽抱杆菌顺利共发酵，两者之间应形成共生关系。本发 明的策略是使通常情况下竞争占优的干酪乳杆菌成为甲硫氨酸营养缺陷（LcS-MetO，从 而在代谢上对纳豆芽抱杆菌BN-NKPQQ-RWX-205形成依赖，其所需要的甲硫氨酸（Met) 由纳豆芽抱杆菌供给，即形成严格的偏利共生关系。虽然LcS-Mef在生长速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-205,但前者对后者营养依赖，两菌之间形成稳定共生关系，保障了共发酵顺 利完成，从而获得富含NK和PQQ的白芸豆乳。
[0034] 所用纳豆芽抱杆菌和干酪乳杆菌均属于食品级安全微生物，共发酵得到的富含 NK和PQQ的白芸豆乳中，PQQ含量达到77-103ng/mL，高于天然食品中含量最高的纳豆 巧5-63ng/mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力达到899-1530U/mL。所获得的白芸豆乳富含 纳豆激酶和化咯嗟咐酿，呈均一乳白色，具有白芸豆乳固有的滋味及发酵后特有的风味。步 骤1)中，纳豆芽抱杆菌10261和纳豆芽抱杆菌10263采用现有技术，纳豆芽抱杆菌10261 来自中国工业微生物菌种保藏管理中屯、（CICC)，地址；北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6 号楼；保藏日期为2002年，菌种保持编号为10261 ;纳豆芽抱杆菌10263来自中国工业微生 物菌种保藏管理中屯、（CICC)，地址；北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼；保藏日期为 2002年，菌种保持编号为10263;干酪乳杆菌（Lactobacillus casei aiirota)来自养乐多 (上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG单抗PQQ-mAb采用市售产品，购自嘉兴元科生物科技有 限公司，商品号为YK-Ab-〇13。
[0035] 所述的底物诱导适应性基因组重排后的高通量筛选具体包括；①制备2个平板豆 芽汁白芸豆汁固体培养基（白芸豆汁占平板总量的10% -15%，使得选育培养基与发酵培 养基之间发生关联，此即为本发明的底物诱导适应性策略），其中一个将小鼠抗PQQ IgG单 抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂糖-纤维蛋白配入，形成平板B ;②将纳豆芽抱 杆菌10261和纳豆芽抱杆菌10263的诱变融合后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影 印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板；⑨平板A中，高产PQQ诱变融合后代菌 落周围形成肉眼可见沉淀线，根据沉淀圈直径大小可肉眼判断产PQQ量大小；④平板B中， 高产NK诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透明圈直径大小可肉眼判断产NK活力高 低；⑥平板A与平板B中，高产PQQ菌落与高产NK菌落处于同一位置者，即为高产NK兼PQQ 的纳豆芽抱杆菌。
[0036] 所获得的高产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌BN-NKPQQ-RWX-205保藏于斜面豆芽汁白 芸豆汁固体培养基中。
[0037] 所述的平板豆芽汁白芸豆汁固体培养基和斜面豆芽汁白芸豆汁固体培养基W 1L 计，由W下量的组分组成：
[00%] f [足口.汁 100?150打也； 庶糖 4.0?6.0g; 琼脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0039] 进一步优选，所述的平板豆芽汁白芸豆汁固体培养基和斜面豆芽汁白芸豆汁固体 培养基W 1L计，由W下量的组分组成：
[0040] 0昔丹汁 100?15〇11^一； 黯糖 5.0g; 琼脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[004U 所述的豆芽汁的制备；刚出芽的大豆500g，加水2500血，煮沸浓缩至1000血后过 滤，得到豆芽汁。
[0042] 该平板豆芽汁白芸豆汁固体培养基的配方有利于纳豆芽抱杆菌菌落形成和高通 量筛选。该斜面豆芽汁白芸豆汁固体培