保藏于MRS固体培养基（斜面）中。 [01 巧](3) BN-NKPQQ-RWX-205 的活化培养
[0126] 将保存于豆芽汁白芸豆汁固体培养基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-205取一环，接 种至豆芽汁白芸豆汁液体培养基活化，培养温度35 °C，培养结束菌种密度达到109c化/mL左 右。
[0127] (4) LcS-Met-的活化培养
[0128] 将保存于MRS固体培养基（斜面）中的LcS-Mef取一环，接种至MRS液体培养基 37°C活化培养，培养结束菌种密度达到109c化/mL左右。
[0129] (5)富含NK和PQQ的白芸豆乳的发酵制备
[0130] 将活化的BN-NKPQQ-RWX-205与LcS-Met-混合，使混合菌液中二者密度比为 1:5 (1 X 108CFM/mL: 5 X 108CFM/mL)，混合菌液W 5 %接种量接种白芸豆乳发酵培养基，37°C 六层纱布封口培养36h，得到富含NK和PQQ的白芸豆乳。白芸豆乳发酵培养基中所含豆芽 汁、酪氨酸、谷氨酸和麦芽糖对BN-NKPQQ-RWX-205合成NK和PQQ进行代谢调控，豆芽汁有 利于纳豆芽抱杆菌增殖，麦芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通过肤键连接环 化而成。发酵结束后，白芸豆乳中NK活力1530U/mL，PQQ含量10化g/mL。所获得的白芸豆 乳富含纳豆激酶和化咯嗟咐酿，呈均一乳白色，具有白芸豆乳固有的滋味及发酵后特有的 风味。
[0131] 本发明中采用色谱法测定PQQ，具体步骤参照"Noji N,化kamura T, Kit址ata N, et al. Simple and sensitive method for pyrroloquinoline quinone(PQQ)analysis in various foods using liquid chromatography/electrospray-lonization tandem mass spectrometry. J Agri Food Qiem, 2007, 55(18):7258-7263."。
[0132] 本发明中采用琼脂糖-纤维蛋白原平板法测定NK活力。测定步骤；将发酵液过滤 后点种在琼脂糖-纤维蛋白平板上，37°C解育1她，W尿激酶作为标准品，通过测量透明圈 直径计算纳豆激酶相当于尿激酶的活力单位扣/mL)。
【主权项】
1. 一种纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方法，其特征在于，包 括以下步骤： 1) 、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进 行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳 豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-205 ; 2) 、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌， 命名为干酪乳杆菌LcS-Met_; 3) 将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-205和干酪乳杆菌LcS-Met_*发酵白芸豆汁，得到 富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的白芸豆乳。
2. 根据权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方 法，其特征在于，步骤1)中，所述的高通量筛选具体包括：①制备2个平板豆芽汁白芸豆 汁固体培养基，其中一个将小鼠抗PQQ IgG单抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂 糖-纤维蛋白配入，形成平板B ;②将纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融 合后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影 印平板；③平板A中，高产吡咯喹啉醌的诱变融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀圈，根据 沉淀圈直径大小可肉眼判断产吡咯喹啉醌量大小；④平板B中，高产纳豆激酶的诱变融合 后代菌落周围形成透明圈，根据透明圈直径大小可肉眼判断产纳豆激酶活力高低；⑤平板 A与平板B中，高产吡咯喹啉醌菌落与高产纳豆激酶菌落处于同一位置者，即为高产纳豆激 酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌。
3. 根据权利要求2所述的纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方 法，其特征在于，步骤1)中，所述的平板豆芽汁白芸豆汁固体培养基以IL计，由以下量的组 分组成： |'!2Λ7:? 丨· 100?丨 50mL; 庶糖 4.0?6.0g; 琼脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
4. 根据权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方 法，其特征在于，步骤2)中，所述的从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，具体包 括：①制备2个平板MRS固体培养基，其中一个将甲硫氨酸配入，为平板C，另一个为单纯 MRS固体培养基平板，为平板D ;②将诱变后的干酪乳杆菌涂布其中一个平板后，再用纤维 素膜影印至另一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位 置，平板C出现菌落而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则 该菌落为甲硫氨酸营养缺陷型干酪乳杆菌。
5. 根据权利要求4所述的纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方 法，其特征在于，步骤2)中，所述的平板MRS固体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 丰宁檬酸氢二铵 2.Og; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 〇.58g; 硫酸锰 0.25g; 琼脂 20g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； 该MRS固体培养基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根据权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方 法，其特征在于，步骤3)中，在共发酵之前，将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-205和干酪乳杆 菌LcS-Met_分别进行活化培养，纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-205在豆芽汁白芸豆汁液体 培养基中进行活化培养，培养温度为34?36°C，干酪乳杆菌LcS-Met_i MRS液体培养基中 进行活化培养，培养温度为36?38 °C。
7. 根据权利要求6所述的纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方 法，其特征在于，步骤3)中，所述的豆芽汁白芸豆汁液体培养基以IL计，由以下量的组分组 成： 白芸豆汁 100?150mL ; 鹿糖 4. 0?6. Og ; 豆芽汁 余量； 所述的MRS液体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 柠檬酸氢二铵 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2..0g; 硫酸镁 （).58g; 硫酸锰 0.25g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； 该MRS液体培养基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根据权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方 法，其特征在于，步骤3)中，将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-205和干酪乳杆菌LcS-Met_* 发酵白芸豆汁，具体包括：将活化后的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-205和干酪乳杆菌 LcS-Mef混合，形成混合菌液，将混合菌液接种至含白芸豆汁的白芸豆乳发酵培养基，纱布 封口培养后得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的白芸豆乳； 所述的白芸豆乳发酵培养基以IL计，由以下量的组分组成： 鹿糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g； 谷氨酸 〇.5g; 麦芽糖 20.0g; Λ7:芽il· IOOmL; 白芸豆汁 余量。
9. 根据权利要求8所述的纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方 法，其特征在于，步骤3)中，所述混合菌液中的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-205和干酪乳 杆菌LcS-Meif的菌数密度比为1:2?1:5 ; 所述的混合菌液接种至含白芸豆汁的白芸豆乳发酵培养基的接种量为1%?5% ; 所述的纱布封口培养的条件为：37°C?42°C六层纱布封口培养24h?36h。
10. 根据权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方 法，其特征在于，所述的白芸豆汁制备包括：水中加白芸豆，浸泡2?12小时，90°C?99°C 碾磨成浆汁，得到白芸豆汁，其中，所述的水的体积与白芸豆的质量之比为IOOmL :10? 25g〇
【专利摘要】本发明公开了一种纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备食疗白芸豆乳的方法，包括：将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变，然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌；将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌；将筛选出的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌共发酵白芸豆汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的白芸豆乳。本发明得到的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的白芸豆乳中，吡咯喹啉醌含量达到77-103ng/mL，纳豆激酶活力达到899-1530U/mL。
【IPC分类】C12R1-07, C12N15-01, C12R1-245, A23C11-10, C12N15-03
【公开号】CN104522180
【申请号】CN201410751256
【发明人】李青青, 吴渊, 邓惟
【申请人】杭州元佩特生物科技有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日