干酪乳杆菌增殖培养。
[009引 （e)所述的MRS固体培养基（平板）配制完成后，12rc灭菌15min，WlL计，由W 下量的组分组成：
[0093] 蛋白胳 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 粹樣酸氨二钱 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 己酸铺 5.0g; 憐酸氨二钟 2.0g; 硫酸镑 〇.58g; 硫酸猛 0.25g;
[0094] 琼脂 20g; 吐温 80 l.OmL; 水 余量； pH 6.2 ?6.4
[0095] 该MRS固体培养基有利于干酪乳杆菌菌落形成和筛选。
[0096] 讯所述的MRS固体培养基（斜面）配制完成后，121°C灭菌15min，W 1L计，由W 下量的组分组成：
[0097] 蛋白滕 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 巧様酸氨二辕 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸销 5.0g; 磯酸氨二钟 2.0g; 硫酸镜 0.58g; 硫酸猛 0.25g; 琼脂 20g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； pH 6.2 ?6.4 倒试管斜面
[009引该MRS固体培养基（斜面）有利于干酪乳杆菌保藏。
[0099] (g)所述的白芸豆乳发酵培养基W 1L计，由W下量的组分组成：
[0100] 谎糖 50.0g; 酪氨酸 0.5g; 谷氨酸 0.5g; 麦芽糖 20.0g; 打芽汁 lOOmL; 白芸豆汁 余量。
[ow] 化）白芸豆汁制备包括；1000血水中加lOOg白芸豆，浸泡6小时，95°C礙磨成浆 汁，得到白芸豆汁。
[0102] 本发明实施例中，纳豆芽抱杆菌10261和纳豆芽抱杆菌10263采用现有技术，纳豆 芽抱杆菌10261来自中国工业微生物菌种保藏管理中屯、（CICC)，地址；北京市朝阳区酒仙 桥中路24号院6号楼；保藏日期为2002年，菌种保持编号为10261 ;纳豆芽抱杆菌10263 来自中国工业微生物菌种保藏管理中屯、（CICC)，地址；北京市朝阳区酒仙桥中路24号院 6号楼；保藏日期为2002年，菌种保持编号为10263 ;干酪乳杆菌（Lactobacillus casei 化irota)来自养乐多（上海）有限公司；小鼠抗PQQ IgG单抗PQQ-mAb采用市售产品，购 自嘉兴元科生物科技有限公司，商品号为YK-Ab-013。
[0103] 实施例1
[0104] 本发明通过纳豆芽抱杆菌与干酪乳杆菌选育及其共发酵制备富含NK和PQQ的白 芸豆乳，包括w下步骤：
[0105] (1)高产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌BN-NKPQQ-RWX-205的选育
[0106] 采用底物诱导适应性策略，通过基因组重排及高通量筛选技术获得高产NK兼PQQ 的纳豆芽抱杆菌BN-NKPQQ-RWX-205,具体方法为；首先构建纳豆芽抱杆菌突变库，将已获 得的产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌10261和10263分别进行亚硝基脈诱变；然后混合二者诱 变后代，进行细胞融合（促融剂为聚己二醇4000)，传代培养，实现基因组改组，使纳豆芽抱 杆菌10261和10623所有诱变后代的优势突变得到优化整合，选育出NK兼PQQ产率高且生 长旺盛、遗传稳定、适合作为生产菌株的高产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌。
[0107] 突变库高通量筛选；①制备2个豆芽汁白芸豆汁固体培养基平板（白芸豆汁占平 板总量的10-15 %，使得选育培养基与发酵培养基之间发生关联，此即为本发明的底物诱导 适应性策略），其中一个将小鼠抗PQQ IgG单抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂 糖-纤维蛋白配入，形成平板B ;②将纳豆芽抱杆菌10261和纳豆芽抱杆菌10263的诱变融 合后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印 平板；⑨平板A中，高产PQQ诱变融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀线，根据沉淀圈直径 大小可肉眼判断产PQQ量大小；④平板B中，高产NK诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根 据透明圈直径大小可肉眼判断产NK活力高低；⑥平板A与平板B中，高产PQQ菌落与高产 NK菌落处于同一位置者，即为高产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌。所获得的高产NK兼PQQ的 纳豆芽抱杆菌命名为BN-NKPQQ-RWX-205,保藏于豆芽汁白芸豆汁固体培养基（斜面）中。 [010引 似甲硫氨酸营养缺陷（MeO的干酪乳杆菌（LcS-MeO的选育
[0109] 将干酪乳杆菌（Lactobacillus casei化irota)进行亚硝基脈诱变，从中筛选出 甲硫氨酸营养缺陷型（LcS-Met-)。
[0110] LcS-Met-筛选；①制备2个MRS固体培养基平板，其中一个将甲硫氨酸（Met)配 入（平板C，Met添加量为10-15mg/L)，另一个为单纯MRS平板（平板D);②将干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei化irota)的诱变后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至 另一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；⑨在平板C与平板D的同一位置，平板C出 现菌落而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌落甲硫氨 酸营养缺陷型干酪乳杆菌，命名为LcS-Mef，保藏于MRS固体培养基（斜面）中。
[0111] (3) BN-NKPQQ-RWX-205 的活化培养
[0112] 将保存于豆芽汁白芸豆汁固体培养基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-205取一环，接 种至豆芽汁白芸豆汁液体培养基活化，培养温度35 °C，培养结束菌种密度达到109c化/mL左 右。
[011引 （4) LcS-Met-的活化培养
[0114] 将保存于MRS固体培养基（斜面）中的LcS-Mef取一环，接种至MRS液体培养基 37°C活化培养，培养结束菌种密度达到109c化/mL左右。
[01巧](5)富含NK和PQQ的白芸豆乳的发酵制备
[0116] 将活化的BN-NKPQQ-RWX-205与LcS-Met-混合，使混合菌液中二者密度比为 1:2 (1 X 108CFM/mL: 2 X 108CFM/mL)，混合菌液W 1 %接种量接种白芸豆乳发酵培养基，42°C 六层纱布封口培养2化，得到富含NK和PQQ的白芸豆乳。白芸豆乳发酵培养基中所含豆芽 汁、酪氨酸、谷氨酸和麦芽糖对BN-NKPQQ-RWX-205合成NK和PQQ进行代谢调控，豆芽汁有 利于纳豆芽抱杆菌增殖，麦芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通过肤键连接环 化而成。发酵结束后，白芸豆乳中NK活力899U/mL，PQQ含量77ng/血。所获得的白芸豆乳 富含纳豆激酶和化咯嗟咐酿，呈均一乳白色，具有白芸豆乳固有的滋味及发酵后特有的风 味。
[0117] 实施例2
[0118] 本发明通过纳豆芽抱杆菌与干酪乳杆菌选育及其共发酵制备富含NK和PQQ的白 芸豆乳，包括W下步骤：
[0119] (1)高产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌BN-NKPQQ-RWX-205的选育
[0120] 采用底物诱导适应性策略，通过基因组重排及高通量筛选技术获得高产NK兼PQQ 的纳豆芽抱杆菌BN-NKPQQ-RWX-205,具体方法为；首先构建纳豆芽抱杆菌突变库，将已获 得的产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌10261和10263分别进行亚硝基脈诱变；然后混合二者诱 变后代，进行细胞质融合（促融剂为聚己二醇4000)，传代培养，实现基因组改组，使纳豆芽 抱杆菌10261和10623所有诱变后代的优势突变得到优化整合，选育出NK兼PQQ产率高且 生长旺盛、遗传稳定、适合作为生产菌株的高产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌。
[0121] 突变库高通量筛选；①制备2个豆芽汁白芸豆汁固体培养基平板（白芸豆汁占平 板总量的10-15 %，使得选育培养基与发酵培养基之间发生关联，此即为本发明的底物诱导 适应性策略），其中一个将小鼠抗PQQ IgG单抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂 糖-纤维蛋白配入，形成平板B ;②将纳豆芽抱杆菌10261和纳豆芽抱杆菌10263的诱变融 合后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印 平板；⑨平板A中，高产PQQ诱变融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀线，根据沉淀圈直径 大小可肉眼判断产PQQ量大小；④平板B中，高产NK诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根 据透明圈直径大小可肉眼判断产NK活力高低；⑥平板A与平板B中，高产PQQ菌落与高产 NK菌落处于同一位置者，即为高产NK兼PQQ的纳豆芽抱杆菌。所获得的高产NK兼PQQ的 纳豆芽抱杆菌命名为BN-NKPQQ-RWX-205,保藏于豆芽汁白芸豆汁固体培养基（斜面）中。 [012引 似甲硫氨酸营养缺陷（MeO的干酪乳杆菌（LcS-MeO的选育
[0123] 将干酪乳杆菌（Lactobacillus casei化irota)进行亚硝基脈诱变，从中筛选出 甲硫氨酸营养缺陷型（LcS-Met-)。
[0124] LcS-Met-筛选；①制备2个MRS固体培养基平板，其中一个将甲硫氨酸（Met)配入 (平板C，Met添加量为10-15mg/L)，另一个为单纯MRS固体培养基平板（平板D);②将干 酪乳杆菌（Lactobacillus casei化irota)的诱变后代涂布其中一个平板后，再用纤维素 膜影印至另一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；⑨在平板C与平板D的同一位置， 平板C出现菌落而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌 落甲硫氨酸营养缺陷型干酪乳杆菌，命名为LcS-Mef，