包括cdk抑制剂和多柔比星的联合的制作方法

专利名称：包括cdk抑制剂和多柔比星的联合的制作方法
技术领域：
本发明涉及适用于癌症和其它增殖性疾病治疗的药物联合。
背景技术：
哺乳动物细胞周期的启动、发展和结束受对细胞生长至关重要的各种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)复合物调控。这些复合物包括至少一种催化(CDK自身)亚基和一种调节(细胞周期蛋白)亚基。用于细胞周期调控的一些比较重要的复合物包括细胞周期蛋白A(CDK1-还称为cdc2，和CDK2)、细胞周期蛋白B1-B3(CDK1)、细胞周期蛋白C(CDK8)、细胞周期蛋白D1-D3(CDK2、CDK4、CDK5、CDK6)、细胞周期蛋白E(CDK2)、细胞周期蛋白K和T(CDK9)和细胞周期蛋白H(CDK7)。这些复合物中的每一种都在细胞周期的特定期中涉及到。
通过与其它蛋白的短暂联合以及它们细胞内定位的变化，CDK的活性在翻译后被调节。肿瘤发展与CDK及其调节蛋白的基因变化和反调节密切相关，表明CDK抑制剂可为有用的抗癌治疗药。事实上，早期结果表明，转化细胞和正常细胞在对例如细胞周期蛋白A/CDK2的需求上不同，因而可开发没有使用常规胞毒和细胞抑制剂时观察到的常见宿主毒性的新型抗肿瘤药。
CDK的功能是磷酸化并因此激活或失活特定的蛋白，包括例如成视网膜细胞瘤蛋白、核纤层蛋白、组蛋白H1和有丝分裂纺锤体的成分。由CDK介导的催化步骤涉及从ATP到大分子酶底物的磷酸基转移反应。已发现几类化合物(N.Gray，L.Détivaud，C.Doerig，L.Meijer，Curr.Med.Chem.1999，6，859)由于CDK特异性ATP拮抗作用而具有抗增殖活性。
Roscovitine为化合物6-苄氨基-2-[(R)-1-乙基-2-羟乙基氨基]-9-异丙基嘌呤。已证实Roscovitine为有效的细胞周期蛋白依赖性激酶尤其是CDK2的抑制剂。目前这种化合物正发展作为抗癌药。CDK抑制剂被认为阻断了来自细胞周期G1/S和G2/M期的细胞途径。还表明Roscovitine为成视网膜细胞瘤磷酸化的抑制剂，并因此被暗示对Rb阳性肿瘤更有效。
在本领域中已很好地证实，为了使治疗方案最佳经常联合提供活性药剂。因此本发明设法提供一种已知药剂的新型联合，该联合特别适用于增殖性疾病尤其是癌症的治疗。更具体地说，本发明集中于令人惊奇和预料不到的与联合使用某些药剂相关的效果。
发明简述第一方面，本发明提供一种包括CDK抑制剂和多柔比星(Doxorubicin)的联合。
第二方面提供一种包括根据本发明的联合并与药物可接受载体、稀释剂或赋形剂混合的药物组合物。
第三方面涉及根据本发明的联合在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的应用。
第四方面涉及包括CDK抑制剂和多柔比星的药物制品，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
第五方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别地为患者给药CDK抑制剂和多柔比星。
第六方面涉及CDK抑制剂在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述治疗包括同时、依次或分别地为患者给药CDK抑制剂和多柔比星。
第七方面涉及CDK抑制剂和多柔比星在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的应用。
第八方面涉及CDK抑制剂在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于在与多柔比星联合治疗中使用。
第九方面涉及多柔比星在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于在与CDK抑制剂联合治疗中使用。
发明详述下文中阐述的优选实施方式适用于本发明的所有上述方面。
如上所述，本发明涉及包括CDK抑制剂和多柔比星的联合。优选地，联合为协同联合。
多柔比星为化合物(8S-顺)-8-乙酰基-10-[(3-氨基-2，3，6-三去氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧]7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-5，12-萘二酮，是一种蒽环类抗生素。在1939年首先从微生物中分离出蒽环类抗生素，并在20世纪50年代研究了它们的抗生素性能。这些抗生素能相当容易地杀死细菌，但毒性太大以至于不能用于治疗人类感染。直到20世纪60年代才试验蒽环类抗生素的抗肿瘤性能，并发现具有抵抗癌细胞的活性。
蒽环类药物全部结合到DNA上，它们的细胞毒性很大程度上由这种结合引起。更具体地说，它们结合到双链DNA上。在用蒽环类药物处理的人类染色体制备物中，观察到结合药物为清晰的橙红色荧光带。这种与DNA的相互作用通过嵌入进行，并已通过数种方法证实。如果修饰蒽环类药物的结构以改变与DNA的结合，则抗肿瘤活性通常会降低或丧失。因此，DNA结合看来对这些药物的抗癌活性至关重要。但是，导致细胞毒性的途径还未被清楚地阐明。并不认为DNA和RNA合成的抑制对细胞毒性至关重要，因为其只在高的药物浓度下发生。
蒽环类药物具有许多重要作用，其中的任何一种或全部都对这些药物的胞毒作用有影响。首先，它们可嵌入DNA，从而影响DNA的许多功能，包括DNA和RNA合成。还会发生DNA链的断裂。这被认为通过酶DNA拓扑异构酶II或通过自由基形成来介导。酶拓扑异构酶II的抑制，例如，可引起导致DNA中双链断裂的一系列反应。
暂时的双链断裂由拓扑异构酶II在其正常催化周期过程中通过形成可分裂复合体来诱导。导致永久双链断裂的这种复合体的破裂很少在没有药物时发生。拓扑异构酶II的抑制剂能促使这种可分裂复合体持续，从而增加了可分裂复合体被转化到不可逆双链断裂的可能性。
蒽环类药物还能导致活性氧物类的形成，并接着主要导致单链断裂。蒽环类药物发色团含有羟基醌，其具有明确的铁螯合结构。药物-Fe-DNA复合体催化电子从谷胱甘肽到氧的转移，从而导致活性氧物类的形成。
本发明的另一方面涉及包括CDK抑制剂和蒽环类药物的联合。
又一方面涉及包括CDK抑制剂和蒽环类药物的药物制品。
如上所述，本发明的一个方面涉及包括CDK抑制剂和多柔比星的药物制品，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
可同时、联合、依次或分别(作为给药方案的一部分)给药CDK抑制剂和多柔比星。
本文中使用的“同时”是指同时地给药两种药剂，而术语“联合”是指在时限内如果不能同时则“依次”地给药以使它们能在同一时限内起治疗作用。因此，“依次”给药可允许在一种药剂后5分钟、10分钟或大约几小时后给药另一种药剂，只要第一种给药药剂的循环半衰期能使二者同时以治疗有效量存在即可。两成分给药间的延时依成分的确切性质、它们之间的相互作用和它们各自的半衰期而改变。
与“联合”或“依次”相比，本文使用的“分别”是指给药一种药剂和另一种药剂之间的间隔是明显的，即当给药第二种药剂时，在血流中可不再存在治疗有效量的第一种给药药剂。
优选地，同时或依次给药CDK抑制剂和多柔比星。
本发明的一个方面涉及CDK抑制剂在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的应用，其中所述治疗包括为患者同时、依次或分别地给药多柔比星和CDK抑制剂。
在一种特别优选的实施方式中，在为患者依次或分别地给药多柔比星前为所述患者给药CDK抑制剂。
在替代优选实施方式中，在为患者依次或分开地给药CDK抑制剂前为所述患者给药多柔比星。
在本发明的一种优选实施方式中，对于单独成分，分别给药治疗有效量的CDK抑制剂和多柔比星。
在本发明的另一种优选实施方式中，对于单独成分，分别给药亚治疗量的CDK抑制剂和多柔比星。
本发明的另一方面涉及CDK抑制剂和多柔比星在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的应用。
本发明的又一方面涉及CDK抑制剂在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于与多柔比星在联合治疗中使用。
本发明的还一方面涉及多柔比星在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于与CDK抑制剂在联合治疗中使用。
本文中使用的术语“联合治疗”是指在时限内如果不能同时则依次给药多柔比星和CDK抑制剂以便在同一时限内它们均可起治疗作用的治疗。
本文使用的术语“药物制备”包括本发明的成分除了用于这类药物制备的任意阶段外还有直接作为药物的应用。
本文使用的术语“增殖性疾病”广义上包括需要控制细胞周期的任何疾病，例如心血管疾病如心瓣手术后再狭窄和心肌病、自动免疫疾病如肾小球肾炎和类风湿性关节炎、皮肤疾病如牛皮癣、抗炎症、抗真菌、抗寄生物的疾病如疟疾、气肿和脱发。在这些疾病中，本发明的成分可根据需要诱导目标细胞内的细胞凋亡或保持停滞。
优选地，增殖性疾病为癌症或白血病，最优选癌症。
在一种特别优选的实施方式中，本发明涉及本文所述的联合在CDK依赖性或敏感性疾病治疗中的应用。CDK依赖性疾病与超过一种或多种CDK酶的活性正常水平有关。这种疾病优选与CDK2和/或CDK4的异常活性水平有关。CDK敏感性疾病为这样一种疾病，其中CDK水平的异常不是主因，而是在主要新陈代谢异常的后阶段。在这种情况下，CDK2和/或CDK4可被认为是敏感性新陈代谢途径的一部分，因此CDK抑制剂可有效地治疗这种疾病。这种疾病优选为癌症或白血病。
优选地，CDK抑制剂为CDK2和/或CDK4的抑制剂。更优选地，CDK抑制剂选自WO97/20842、WO98/05335(CV Therapeutics)、WO99/07705(Regents of the University of California)中描述的roscovitine、purvalanol A、purvalanol B、奥罗莫星和其它2，6，9-三取代嘌呤。
甚至更优选地，CDK抑制剂选自roscovitine和purvalanol A。
在一种特别优选的实施方式中，CDK抑制剂为roscovitine。
roscovitine为化合物2-[(1-乙基-2-羟乙基)氨基]-6-苄氨基-9-异丙基嘌呤，还描述为2-(1-D，L-羟甲基丙基氨基)-6-苄氨基-9-异丙基嘌呤。本文中使用的术语“roscovitine”包括拆分的R和S对映异构体、它们的混合物和它们的外消旋物。
甚至更优选地，联合具有协同效应，即联合是协同性的。
药物联合的效果本质上不可预知，并经常存在一种药物部分或完全地抑制其它药物作用的倾向。本发明基于以下令人惊奇的观察，即联合(同时、分别或依次)给药多柔比星和roscovitine不会导致两种药剂间任何的不利相互作用。如此意外地不产生任何所述相互拮抗作用对临床应用至关重要。
为了使治疗方案最佳而联合提供多种抗癌药剂。例如，经常作为鸡尾酒或化疗药剂给药方案的一部分给药多柔比星，参见例如http//www.indiacancer.org/prof/acd11.html上的化疗联合疗法数据库。在乳腺癌治疗中多柔比星已被建议在多西他奇(docetaxal)、多柔比星和环磷酰胺的连续疗法中使用(Journal of Clinical Oncology，第19卷，第14期，3367-3375页，2001)。但是，直到目前还没有联合给药多柔比星和roscovitine的任何建议。
在一种优选实施方式中，多柔比星和roscovitine的联合与单独给药的任一种药物相比产生了增强的效果。这种令人惊奇的特性与根据现有技术预料的大不相同。
癌症治疗领域的那些技术人员已很好地认识到，不仅可按它们的位置(乳房、肺、肾等)和性质(小细胞、实体、软性等)将癌症分类，而且可根据与特定肿瘤相关的基因型在生物化学上分类。考虑各式各样的癌症，在显示出p53突变的不同癌症内存在亚群体。例如在特定癌症内，在乳癌内，基于基因型特征的亚型将为显示出brca 1或brca 2突变的那些。随着我们对不同癌症的基因型基础认识的提高，希望能开发更特异性的治疗或治疗方案。
在这点上，在本发明一种尤其优选的实施方式中，增殖性疾病为Rb缺失的增殖性疾病。试验出人意料地显示，在为Rb缺失的癌细胞系给药时，与单独给药任何一种药物相比，多柔比星和roscovitine的联合产生了最大作用。该观察的令人惊奇性质与预料的相反，尤其从所述的roscovitine抑制Rb磷酸化的活性来看。
因此，本发明的一种优选实施方式涉及治疗Rb缺失的增殖性疾病的方法，包括给药治疗有效量的CDK抑制剂和治疗有效量的多柔比星。
另外，本发明的另一优选实施方式涉及CDK抑制剂在生产用于治疗Rb缺失的增殖性疾病的药物中的应用，其中治疗包括给药治疗有效量的CDK抑制剂和治疗有效量的多柔比星。
作为定义，本文使用的术语“Rb缺失的”是指不同于野生型Rb基因的基因型。因此，Rb基因型可能是突变型的或缺失(deleted)的，或野生型Rb基因杂合存在。对于野生型Rb基因的参考在Lee等人(Lee W.H，Booksten，R，Hong，FD，Toung，LJ，Shew JY，Lee，EY-HP，1987Human retinoblastomasusceptibility genecloning，identification and sequence.等Science 2351394-1399)中给出。
成视网膜细胞瘤(Restinoblastoma)蛋白通过在遗传眼肿瘤菌髓(context)中最初识别的基因表达(Nevins JR，Human Molecular Genetics 2001，10，699-703)。在它的磷酸化形式中，已观察到涉及到转录因子如E2F的控制。目前，已在一系列人类癌症中观察到Rb功能的丧失(Hunter T，Cell(1997)88，333-346，Sherr CJ，(1996)Science 274，1672-1677和Weinberg RA(1995)Cell81，537-548)。因此，在不同类型的癌症亚群体内，已观察到在Rb基因中表现出突变，下文中称为Rb缺失的癌症。
Li等人的最近报道(Cancer Research，卷61，第6期，2579-82页，2001)显示，当与CDK抑制剂flavopiridol联合治疗时，pRb缺失的骨肉瘤系SaOS-2显著地对多柔比星的胞毒效应敏感。这种效应只在pRb缺失的细胞中看到，因为用Rb转染的SaOS-2细胞对于同样的药物联合未表现出这种增强的敏感度。细胞周期分析表明，flavopiridol在Rb恢复的细胞中的S期降低了多柔比星诱导的细胞累积，而不是在Rb缺失的细胞中。在SaOS-2 Rb缺失的细胞中看到因flavopiridol的p21waf-l增加和伴随的细胞周期蛋白依赖性激酶2激酶活性的降低，而不是在Rb恢复的细胞中。还报道了脂肪肉瘤细胞系的PRb缺失(Li等人，1994 Br J Cancer 69，1052-1058)。
如上所述，已观察到CDK抑制剂优选roscovitine联合多柔比星的使用在Rb缺失的癌症中特别有效。下面给出综合但非详尽的癌症列表。可通过简单的基因型分析识别以Rb缺失的方式表现出特定癌症的患者。通过免疫组化的Rb表达降低或增加分析描述在·Xing EP，Guang-Yu，Y，Wang L-D，Shi，ST和Yang CS(1999)Loss ofheterozygosity of the Rb gene correlates wit pRb protein expression andassociates with p53 alteration in hu8man esophageal cancer.Clinical CancerResearch 51231-1240·Geradts，J，Fong，KM，Zimmerman，PV，Maynard，R和Minna，JD(1999)Correlation of abnormal RB，p16ink4a，and p53 expression with 3p loss ofheterozygosity，other genetic abnormalities and clinical features in 103 primarynon-small cell lung cancers因此，本发明的联合尤其在Rb缺失的恶性和肿瘤前疾病的治疗中有效。本发明尤其用于涉及Rb缺失的腺癌治疗，如小细胞肺癌、肾癌、子宫癌、前列腺(prostrate)癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌和乳腺癌。例如，根据本发明可治疗的恶性肿瘤包括Rb缺失的急性和慢性白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，Rb缺失的肉瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、血管肉瘤、内皮肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤，和当Rb缺失的基因型存在时的下列癌症结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、鳞状上皮细胞癌、基细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头癌、乳头腺癌、囊腺癌、脊髓癌、支气管癌、绒膜癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌精原细胞瘤、胚胎癌、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听觉神经瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、menangioma、黑素瘤、中性胚细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
药物组合物尽管可单独给药本发明的成分(包括它们的药物可接受盐、酯和药物可接受溶剂化物)，但对于人类治疗，通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合给药。
因此，本发明的一种优选实施方式涉及包括CDK抑制剂和多柔比星并与药物可接受赋形剂、稀释剂或载体混合的药物组合物。
可在由Wade和PJ Weller编辑的“Handbook of Pharmaceutical Excipients”第二版(1994)中找到用于本文所述各种不同形式药物组合物的这类合适赋形剂的例子。
在药物领域，用于治疗用途的可接受载体或稀释剂是众所周知的，并在例如Remington的Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co(A.R.Gennaroedit.1985)中有描述。合适的载体的例子包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨糖醇等。合适的稀释剂的例子包括乙醇、甘油和水。
药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可根据预定给药途径和标准药物实践来选择。药物组合物可包括作为或除载体、赋形剂或稀释剂之外的任何粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂。
合适的粘合剂的例子包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β乳糖、玉米甜味剂、天然和合成橡胶、如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
合适的润滑剂的例子包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等。
在药物组合物中可提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至增香剂。防腐剂的例子包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。还可使用抗氧化剂和悬浮剂。
盐/酯本发明的药剂可以盐或酯尤其是药物可接受的盐或酯的形式提供。
本发明药剂的药物可接受盐包括它们合适的酸加成盐或碱性盐。可在Berge等人的J.Pharm Sci，66，1-19(1977)中找到合适药物盐的综述。用例如以下酸形成盐强无机酸，如矿物酸，例如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，如未取代或取代(如被卤素)的1至4个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤素)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。
使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯，取决于被酯化的官能团。有机酸包括羧酸，如未取代或取代(如被卤素)的1至12个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤素)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括未取代或取代(如被卤素)的1至12个碳原子的链烷醇。
对映异构体/互变异构体本发明还适当包括药剂的全部对映异构体和互变异构体。本领域的技术人员能认识到具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变异构特征的化合物。可通过本领域中已知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变异构体。
立体异构体和几何异构体本发明的一些药剂可以立体异构体和/或几何异构体的形式存在，例如它们可具有一个或多个不对称和/或几何中心并因此可以二种或多种立体异构和/或几何形式存在。本发明包括药剂所有的单独立体异构体和几何异构体及它们的混合物的使用。权利要求中使用的术语包括这些形式，只要所述形式保留适当的官能活性即可(但不必到相同程度)。
本发明还包括药剂的所有合适的同位素变体或其药物可接受盐。本发明药剂的同位素变体或其药物可接受盐定义为至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量与自然界中通常发现的原子质量不同的原子取代的物质。可被结合到药剂和其药物可接受盐的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。药剂和其药物可接受盐的某些同位素变体，例如结合放射形同位素如3H或14C的那些，在药物和/或底物组织分布研究中是有用的。含氚的即3H和碳-14即14C同位素因其容易制备和可检测性而特别优选。此外，用同位素如氘即2H的取代可因较大的新陈代谢稳定性而提供特定的治疗益处，例如体内半衰期增加或剂量要求降低，并因此可在一些情况下被优选。通常可使用合适试剂的适当同位素变体通过常规过程制备本发明药剂的同位素变体和其药物可接受盐。
溶剂化物本发明还包括本发明药剂的溶剂化物形式。权利要求中使用的术语包括这些形式。
多晶型物本发明还涉及各种结晶形式、多晶型形式和无水/水合形式的本发明的药剂。在药物工业中已很好地完善了通过稍微改变这种化合物合成制备中所用溶剂的纯化方法和或分离形式来分离化合物的任意这类形式。
前体药物本发明还包括前体药物形式的本发明的药剂。这种前体药物通常为一个或多个适当基团已被修饰的化合物，并且，在向人或哺乳动物患者给药时，修饰可被逆转。通常通过在这类患者中天然存在的酶实现这种逆转，但也可与这种前体药物一起给药第二种药剂以实现体内逆转。这类修饰的例子包括酯(例如上述那些中的任一种)，其中可通过酯酶等进行逆转。其它这类系统为本领域中那些技术人员所熟知。
化学衍生物本发明还涉及包括药剂衍生物的联合。本文中使用的术语“衍生物”包括药剂的化学修饰。例如这类化学修饰可为氢被卤基、烷基、酰基或氨基取代。
给药可使本发明的药物组合物适合于口服、直肠、阴道、肠胃外、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、鼻、口腔或舌下给药途径。
对于口服给药，特别利用压片、药丸、片剂、凝胶(gellules)、滴剂和胶囊。优选地，这些组合物每剂包含1-2000mg和更优选50-1000mg的有效成分。
其它给药形式包括溶液或乳液，它们可静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹膜内或肌内注射，并由无菌或可消毒溶液制备。本发明的药物组合物还可为栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳液、洗液、软膏、乳膏剂、凝胶、喷雾剂、溶液或撒布粉的形式。
经皮给药的其他方式是利用皮肤贴片。例如，可将有效成分结合到由聚乙二醇含水乳液或液体石蜡组成的乳膏剂内。还可以1-10wt％的浓度将有效成分结合到软膏内，该软膏由白蜡或白色软石蜡基础成分与可能需要的稳定剂和防腐剂共同组成。
可注射形式每剂量可包含10-1000mg、优选10-500mg的有效成分。
组合物可被配制成单元剂型，即包含单元剂量的离散部分或单元剂量的多重单位或亚单位的形式。
在一种特别优选的实施方式中，静脉内给药本发明的联合或药物组合物。
剂量本领域的普通技术人员不用额外试验就可容易地确定一种速溶组合物的适宜剂量以为患者给药。典型地，医师会确定对个体患者最适合的实际剂量，并且其取决于各种因素，包括使用的具体药剂的活性、药剂的新陈代谢稳定性和作用长短、年龄、体重、平常健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄速度、药物联合、特定病症的严重程度和个别正进行的治疗。本文公开的剂量为典型的一般情况。当然也可有较高或较低剂量范围有益的个别情况，这都在本发明的范围内。
根据需要，可以0.1-30mg/kg体重或2-20mg/kg体重的剂量给药药剂。更优选地，以0.1-1mg/kg体重的剂量给药药剂。
如上所述，优选以药学可接受量的形式给药治疗有效量的每种有效成分即CDK抑制剂和多柔比星。本领域那些技术人员熟悉这些用量。利用手册，典型地静脉内或口服给药多柔比星，最典型地静脉内给药。对于单一药剂，静脉内剂量典型地为60mg/m2，每21天1次，在联合治疗中剂量在20-30mg/m2范围内，每21或28天再有1次。其它合适的给药方案可包括250mg或500mg多柔比星，并根据医师指导以依据患者体重的总剂量静脉内给药，例如每周口服15mg/kg，最大剂量1g/天，或4小时内静脉内12mg/kg，或每天24小时内24-49mg/kg连续5天。典型地使施用的剂量和频率适合于患者平常的体格状况和引起的副作用的严重程度，尤其是引起造血、肝和肾系统的那些。
多柔比星可在几种剂型中存在；用于再组成的粉剂、在溶液中、和在包裹在脂质体内的脂质制剂中。熟练的医师能确定对具体患者和癌症类型最适合的剂量和剂型。
典型地以约0.05-约5g/天、优选约0.5-约5g/天或1-约5g/天、甚至更优选约1-约3g/天的剂量口服或静脉内给药roscovitine。或者，优选以约0.4-约3g/天的剂量给药roscovitine。优选以片剂或胶囊的形式口服给药roscovitine。roscovitine的总日剂量可作为单次剂量给药，或分成每天给药2、3或4次的分散剂量。
通过实施例并结合以下图进一步描述本发明，其中

图1显示了使用中值效果分析HTB88，多柔比星和roscovitine联合处理的效应。使用CalcuSyn程序得到数据。联合指数(CI)＜1.0表明有协同作用。
图2显示了使用中值效果分析HTB114，多柔比星和roscovitine联合处理的效应。使用CalcuSyn程序得到数据。联合指数(CI)＜1.0表明有协同作用。
图3显示了在POMC-Cre/POMC-Luc；Rb-flox(flox)/flox复合突变型小鼠中的肿瘤发展。顶部12、14和16周后的肿瘤发展；中部生物体发光(BLU)对时间，对于八种不同的小鼠；底部BLU对肿瘤重量(mg)。
图4显示了在POMC-Cre/POMC-Luc；Rb-flox/flox复合突变型小鼠中对用多柔比星处理(4×5mg/kg；静脉内)的肿瘤应答。
图5显示了药物给药时间表，其中每周给药多柔比星一次，连续四周(5mg/kg；静脉内)，并在每次多柔比星给药前，每日口服给药roscovitine两次，连续两天(500mg/kg)。
图6显示了未处理小鼠相对于第1天的生物体发光上的倍差(folddifference)。
图7显示了未处理小鼠和单独用多柔比星或roscivitine处理的小鼠相对于第1天的生物体发光上的倍差。
图8显示了未处理小鼠、单独用多柔比星或roscivitine处理的小鼠和用多柔比星/roscovitine联合处理的小鼠相对于第1天的生物体发光上的倍差。
图9显示了单独用多柔比星处理的小鼠和用多柔比星/roscovitine联合处理的小鼠相对于第1天的生物体发光上的倍差。
图10显示了细胞周期蛋白A的Western免疫印迹分析；A对照(48小时)；B10μM roscovitine；C20μM roscovitine；D5nM多柔比星；E10nM多柔比星；Froscovitine/多柔比星。
实施例材料多柔比星和组织培养试剂由Sigma Aldrich提供。Roscovitine由CyclacelLtd.(Dundee UK)提供。CalcuSyn程序从Cambridge Biosoft(2001/2002)得到。HTB-88SK-LMS-1细胞系从ATCC得到；人类外阴原发平滑肌肉瘤，p53突变体(Patterson等人(1994)Br J Cancer 691052-1058)、pRb野生型、p16缺失。HTB-114SK-UT-1从ATCC得到；人类子宫等级III平滑肌肉瘤，p53突变体(Patterson等人(1994)supra.)，pRb缺失，p16野生型。
细胞毒性方法将细胞以3×104个细胞/ml的密度接种到200μl等分试样中的96孔板中。培养液为最低基本的培养液，并加入非必需氨基酸和丙酮酸钠和10％FCS(Life Technologies/Invitrogen)。在充气的增湿培育箱中放置细胞24小时以平衡。
在无菌水中配制多柔比星的药物原料，在DMSO中配制Roscovitine的药物原料，并在使用前在-20℃下贮存。在组织培养液(包含10％FCS)中稀释药物得到所需的终浓度。在50μl等分试样中加入单独或作为联合(即Roscovitine+多柔比星)的药物。以10nM到320nM的逐步剂量单独给药多柔比星(DOX)。以1.25μM到40μM的逐步剂量单独给药单一的Roscovitine。
在上述逐步稀释系列即以10nM DOX1.25μM Roscovitine开始到320nMDOX40μM Roscovitine期间，以DOXRoscovitine彼此的固定比1∶0.125使用联合的药物。
使用MTT方法(根据Twentyman和Luscombe 1987，Br J Cancer 56279-285)分别估算HTB114和HTB88在72小时和96小时后的细胞存活力。
根据基于中值效果分析方法的CacuSyn程序估算联合指数(CI)。
结果提供由CacuSyn程序计算的联合指数(CI)的结果示于图1和2。当显示CI指数＜1时表明协同效应。在HTB-88上观察到轻微的协同效应，其与pRb磷酸化的降低有关系。在HTB-114(Rb缺失)上观察到显著的协同效应。
体内研究在垂体肿瘤发光小鼠模型中研究Roscovitine和多柔比星的效应。产生成视网膜细胞瘤依赖性散发癌症的条件小鼠模型(Vooijs等人；Cancer Res 2002Mar 15；62(6)1862-7；2002)，其能通过体内荧光素酶表达的生物体发光成象而允许非侵入监测活的动物内垂体肿瘤发展。这种小鼠模型允许纵向监测肿瘤发生、发展和对特异性地以成视网膜细胞瘤途径为靶向的治疗药的应答。总之，使成视网膜细胞瘤条件KO系与POMC-Cre/POMC-荧光素酶转基因系杂交以产生POMC-Cre/POMC-Luc；Rb-flox/flox复合突变型小鼠。这些小鼠发育POMC(Rb缺失)肿瘤(Vooijs等人，同前)，如图3所示。用多柔比星的处理(4×5mg/kg；静脉内)显示出能延迟肿瘤发生。多柔比星是S期特异性的并暂时使肿瘤发展停止(参见图4)。
一旦建立了对多柔比星的原始基本应答，就使用模型研究使用Roscovitine和多柔比星联合治疗的效应。在这项研究中，每周给药多柔比星一次，连续四周(5mg/kg；静脉内)。在每次多柔比星给药前，按照图5所示时间表每日口服给药Roscovitine两次，连续两天(500mg/kg)。
相对于第1天的生物体发光的倍差示于图6(未处理的小鼠)、图7(未处理的、多柔比星和Roscovitine(“CDK”)处理的小鼠)、图8(未处理的、多柔比星、Roscovitine、和多柔比星/Roscovitine处理的小鼠)和图9(多柔比星和多柔比星/Roscovitine处理的小鼠)。Kruskal-Wallis检验(P＜0.01)显示四种末期处理组(图8)的平均斜率是不等的。此外，Mann-Whitney检验(P＜0.009)确定在多柔比星处理的组和多柔比星/Roscovitine处理的组之间存在明显差异(图9)。
总之，结果表明，多柔比星能暂时使肿瘤发展停止，而且预给药Roscovitine能加强这种多柔比星作用，从而导致暂时的肿瘤退化。这是第一次在体内证实多柔比星和Roscovitine之间的协同效应。
Western免疫印迹分析使用NOVEX电泳系统利用SDA-PAGE凝胶(10、12或4-12％)和MES或MOPS缓冲进行蛋白质水平的检测。由适当处理的细胞制备全部细胞的溶菌产物，该处理细胞在TRIS缓冲液中用SDS和蛋白酶抑制剂收获并制备。在每个道内装载等量的蛋白质。
结果24小时时，对于Roscovitine，观察到细胞周期蛋白A的剂量依赖性降低，与单独多柔比星相比，对于联合，在SK-UT-1细胞中观察到水平的降低(图10)。在48小时时观察到类似的结果。
细胞周期分析流式细胞仪用于DNA细胞周期分析通过离心收获药物处理的细胞，并在PBS中洗涤，然后在70％乙醇/PBS中固定。用PI染色细胞，并在用适当选通(gating)的FL3进行流式细胞法分析前用核糖核酸酶处理。
结果占整个的％(48小时处理)样品G0 G1 S G2M对照10 64 10 15Roscovitine 23 36 16 19多柔比星22 9 18 43多柔比星+Roscovitine26 36 7 21结果表明，Roscovitine与多柔比星相加导致单独用多柔比星时看到的G2M峰值的大幅度降低，从而推进细胞到G1。细胞周期分析显示了在SK-UT-1细胞中由Roscovitine加入引起的多柔比星诱导的G2M阻断的显著降低。
在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种改变和变化对本领域的那些技术人员来说是显而易见的。尽管已结合具体的优选实施方式描述了本发明，但应该认识到要求的本发明不过分限制于这种具体实施方式
。事实上，对相关领域那些技术人员明显的用于实施本发明上述方式的各种改变都意在被本发明覆盖。
权利要求
1.一种联合，包括CDK抑制剂和多柔比星。
2.根据权利要求1所述的联合，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4的抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的联合，其中CDK抑制剂选自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
4.根据任一前述权利要求所述的联合，其中CDK抑制剂为roscovitine。
5.一种药物组合物，包括根据任一前述权利要求所述的联合和药物可接受载体、稀释剂或赋形剂。
6.根据权利要求1至4中任意一项所述的联合在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中增殖性疾病为Rb缺失的增殖性疾病。
8.根据权利要求6所述的应用，其中增殖性疾病为CDK依赖性或CDK敏感性疾病。
9.一种药物制品，包括CDK抑制剂和多柔比星，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
10.根据权利要求9所述的药物制品，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4的抑制剂。
11.根据权利要求9或10所述的药物制品，其中CDK抑制剂选自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
12.根据权利要求9至11中任意一项所述的药物制品，其中CDK抑制剂为roscovitine。
13.根据权利要求9至12中任意一项所述的药物制品，以包括药物可接受载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物的形式存在。
14.根据权利要求9至13中任意一项所述的药物制品，用于治疗增殖性疾病。
15.根据权利要求14所述的药物制品，其中增殖性疾病为Rb缺失的疾病。
16.根据权利要求14所述的药物制品，其中增殖性疾病为癌症。
17.一种治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别地为患者给药多柔比星和CDK抑制剂。
18.根据权利要求17所述的方法，包括在为患者依次或分别地给药多柔比星前为所述患者给药所述CDK抑制剂。
19.根据权利要求17所述的方法，包括在为患者依次或分别地给药CDK抑制剂前为所述患者给药多柔比星。
20.根据权利要求17至19中任意一项所述的方法，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4的抑制剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中CDK抑制剂选自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
22.根据权利要求21所述的方法，其中CDK抑制剂为roscovitine。
23.根据权利要求17至22中任意一项所述的方法，其中对于单独成分，分别给药治疗有效量的CDK抑制剂和多柔比星。
24.根据权利要求17至22中任意一项所述的方法，其中对于单独成分，分别给药亚治疗量的CDK抑制剂和多柔比星。
25.根据权利要求17至24中任意一项所述的方法，其中增殖性疾病为Rb缺失的疾病。
26.根据权利要求17至24中任意一项所述的方法，其中增殖性疾病为癌症。
27.CDK抑制剂在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述治疗包括同时、依次或分别地为患者给药多柔比星和CDK抑制剂。
28.CDK抑制剂和多柔比星在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的应用。
29.CDK抑制剂在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于在与多柔比星联合治疗。
30.多柔比星在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于在与CDK抑制剂联合治疗。
31.一种联合，包括CDK抑制剂和蒽环类药物。
全文摘要
本发明的第一方面涉及包括CDK抑制剂和多柔比星的联合。本发明的第二方面涉及包括CDK抑制剂和多柔比星的药物制品，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。本发明的第三方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别地为患者给药CDK抑制剂和多柔比星。
文档编号A61K45/00GK1655821SQ03812085
公开日2005年8月17日 申请日期2003年3月25日 优先权日2002年3月27日
发明者罗杰·N·斯莱, 安东·伯恩斯, 海伦·M·科利, 斯科特·莱昂斯 申请人:西克拉塞尔有限公司