专利名称：大黄蒽醌类化合物在防治流感病毒感染性疾病上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及大黄蒽醌类化合物的应用，具体地说是大黄蒽醌类化合物在防治流感病毒感染性疾病上的应用背景技术：
流感是由流感病毒引起的一种急性病毒性呼吸道传染病，以发病率高、流行广泛、传播迅速为主要特点。目前临床使用的抗流感病毒药物不少，但多数毒性较大，易损害宿主细胞和易导致耐药毒株出现。当前以病毒唑的治疗效果最佳，但也有一定的副作用，少数病人口服或静注时有口干，软便或稀便，白细胞减少等症状，动物实验有致癌作用，故妊娠初期三月内禁用。
发明内容
本发明的目的是要公开毒副作用低的中药大黄提取物——大黄蒽醌类化合物在防治流感病毒感染性疾病上的应用。
本发明是将大黄蒽醌类化合物应用于防治流感病毒感染性疾病。
所述的大黄蒽醌类化合物在防治流感病毒感染性病症上的应用，是将大黄蒽醌类化合物制成药剂学上的任何剂型。
将大黄蒽醌类化合物制成大黄注射液，大黄总蒽醌含量为100mg/ml，每支2.0ml，临床用于防治流感病毒引起的疾病，用法每次2.0ml、肌肉注射、静脉注射或静脉点滴，每天2次，5天一个疗程。
也可将大黄蒽醌类化合物制成大黄片剂，大黄总蒽醌含量200mg/0.5g/片，临床用于防治流感病毒引起的疾病。用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天为一疗程。
本发明用大黄蒽醌类化合物抗流感病毒是用不同浓度的大黄蒽醌类化合物分别作用于MDCK细胞和接种在MDCK细胞上的流感病毒，以病毒唑为对照药，观察大黄蒽醌类化合物对MDCK细胞的毒性作用和对流感病毒抑制作用的情况，其对MDCK细胞的半数毒性浓度TC50为226.1μg/ml，对照为351.3μg/ml，抗流感病毒的半数有效浓度IC50为122.4μg/ml，对照为62.7μg/ml。应用证实大黄蒽醌类化合物对流感病毒有明显的抑制作用，且存在明显的量效关系，随药物浓度增加，其抗病毒活性增强，抑制率升高，经直线回归分析，P＜0.05，大黄蒽醌类化合物浓度在160μg/ml以上时，对流感病毒引起的细胞病变的抑制率可达50％以上。
应用实验的具体步骤是1、所用的药物为大黄蒽醌类化合物(RAA)，病毒为流感病毒鼠适应株，细胞为MDCK细胞；2、用细胞培养技术培养MDCK细胞，用胰酶将生长良好的MDCK细胞分散成单个细胞悬液，按1×105/ml浓度分种子40孔板，每孔0.1ml。置37℃，5％CO2培养箱中培养24h。待细胞长成单层后备用；3、观察药物对MDCK细胞的毒性作用根据Mosmnna建立的四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物对MDCK细胞的毒性作用。
在培养好长成单层的细胞孔板上，换含不同浓度的含大黄蒽醌类化合物药液，每种浓度重复4孔，并设正常细胞对照。继续培养48h后，弃培养液上清，每孔加含5mg/mlMTT的不含血清的MEM培养基50μl，置CO2培养箱中继续培养2～3h后，弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMSO∶乙醇体积比为1∶1)100μl，振荡5～10分钟，待结晶完全溶解，置96孔酶标测定仪上，测定570nm波长处的光密度OD值，并根据下式计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。
细胞存活率(％)＝(实验孔OD值/对照孔OD值)×100％药物对MDCK细胞的毒性作用表现为细胞粘连、皱缩、脱落并且吸光值明显下降，吸光度OD值在0.10以下。将不同浓度的药物作用于细胞，结果见表1表1大黄蒽醌类化合物(RAA)对MDCK细胞的毒性作用Table 1 The Cytotoxity of RAA to MDCK cells
4、观察药物对流感病毒增殖的抑制作用于已长成单层MDCK细胞的40孔板上，每孔接种50μl 100TCID50的流感病毒液，于35℃吸附90min，弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果，在药物无毒浓度范围内，加入不同浓度的含药维持液每孔0.2ml，然后将流感病毒培养板置35℃、5％CO2培养，每日观察CPE。隔天换新鲜含药维持液。实验同时设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性药物病毒唑组和中药样品组。
CPE记录方法为一为无CPE，+为25％细胞出现CPE；++为50％细胞出现CPE；+++为75％细胞出现CPE++++为100％细胞出现CPE。约在病毒对照+++～++++时弃培养液上清，每孔加入含5mg/ml MTT的培养液50μl，继续培养2～3h后洗去MTT上清，加DMSO溶解液每孔100μl，混匀，5～10分钟后，用酶标仪测570nm波长处的光密度OD值。并按下述公式计算药物对流感病毒抑制率(Inhibitiverate)。
流感病毒对MDCK细胞CPE表现为细胞皱缩，变园、壁厚、脱落、拆光性增强，在无毒浓度范围内，将药物以不同的浓度进行抑制流感病毒实验，其病毒抑制率见表2。
表2大黄蒽醌类化合物(RAA)的抗流感病毒作用Table 2 The antiviral activity of RAA to influenza virus
5、结合细胞毒性实验结果，用统计软件SPSS10.0的probit回归法计算药物对MDCK细胞的半数毒性浓度TC50为226.1μg/ml和半数有效浓度IC50为122.4μg/ml及药物的治疗指数TI为1.9，分析出大黄蒽醌类化合物在MDCK细胞中对流感病毒有抑制作用。
大黄蒽醌类化合物是从我国的中药大黄提取分离得到的，大黄在我国应用历史悠久，自然资源丰富，大黄蒽醌类化合物抗流感病毒作用强，对人体的毒副作用小，加工提取工艺成熟，可以制成针剂，片剂等多种剂型，应用到流感病毒感染性疾病的防治上，应用前景非常广阔。
(四)具体实施例
实施例1将大黄蒽醌类化合物制成针剂大黄注射液，大黄总蒽醌含量100mg/ml，每支2.0ml，临床用于防治流感病毒引起的疾病，用法每次2.0ml、肌肉注射、静脉注射或静脉点滴，每天2次，5天一个疗程。
实施例2将大黄蒽醌类化合物制成大黄片片剂，大黄总蒽醌含量200mg/0.5g/片，临床用于防治流感病毒引起的疾病。用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天为一疗程。
权利要求
1.大黄蒽醌类化合物在防治流感病毒感染性疾病上的应用，其特征是将大黄蒽醌类化合物应用于防治流感病毒感染性疾病。
2.根据权利要求1所述的大黄蒽醌类化合物在防治流感病毒感染性疾病的应用，其特征是将大黄蒽醌类化合物制成药剂学上的任何剂型。
3.根据权利要求1或2所述的大黄蒽醌类化合物在防治流感病毒感染性疾病上的应用，其特征是将大黄蒽醌类化合物制成大黄注射液，大黄总蒽醌含量100mg/ml，每支2.0ml，临床用于防治流感病毒引起的疾病，用法每次2.0ml、肌肉注射、静脉注射或静脉点滴，每天2次，5天一个疗程。
4.根据权利要求1或2所述的大黄蒽醌类化合物在防治流感病毒感染性疾病上的应用，其特征是将大黄蒽醌类化合物制成大黄片剂，大黄总蒽醌含量200mg/0.5g/片，临床用于防治流感病毒引起的疾病。用法每次2-4片，口服，每天2-3次，7天为一疗程。
全文摘要
大黄蒽醌类化合物在防治流感病毒感染性疾病上的应用，是将大黄蒽醌类化合物制成药剂学上的任何剂型应用于防治流感病毒引起的感染性疾病。大黄蒽醌类化合物对MDCK细胞的半数毒性浓度TC
文档编号A61K9/20GK1843341SQ20051002068
公开日2006年10月11日 申请日期2005年4月6日 优先权日2005年4月6日
发明者罗伟生, 徐庆, 张奉学, 苏小建, 刘卫兵, 唐祖年, 梁荣感, 李丽亚, 韦京辰 申请人:桂林医学院