海洋甾体化合物在制备治疗神经元损伤药物中的应用的制作方法

专利名称：海洋甾体化合物在制备治疗神经元损伤药物中的应用的制作方法
海洋留体化合物在制备治疗神经元损伤药物中的应用[技术领域]本发明涉及神经性甾体化合物的应用，具体地说涉及海洋甾体YC-1(24 —亚甲基一胆甾 一3 P ， 5 a , 6 e ， 19—四醇)在制备治疗神经元损伤药物中的应用。[背景技术]脑血管疾病是常见病、多发病，是目前严重危害人类健康的三大主要疾病之一，在疾病 谱中每年因脑血管疾病而死亡者，在日本占第二位，在美国占第三位，而在我国数年来均占 首位！脑血管疾病基本上可以认为是种老年性疾病，其发病率随年龄增长而增高，55岁以上， 年龄每增加10岁，发病率增长一倍，随着人类生活水平的提高和人类寿命的延长，社会人 口老龄化程度加剧，脑血管疾病的发病率在不断上升；同时，由于生活方式的改变，近年来 脑血管疾病的患者还有年轻化的趋势。在脑血管疾病中，缺血性脑血管病(简称脑缺血)约 占60% 80%，其主要发病基础是脑动脉硬化症。它是在全身动脉硬化的基础上，脑动脉发生 弥漫性粥样硬化、血管腔狭窄、小血管闭塞，使脑实质的供血量减少，严重者会导致脑血栓 形成，血管完全闭塞，引起相应供血部位的脑组织发生急性大面积梗塞性坏死，即所谓的"脑 卒中"或"中风"，并最终导致脑功能障碍甚至永久丧失。脑缺血损伤的发病率、致残率、 致死率以及复发率很高，而由其引起的偏瘫、失语、痴呆等致残结果更成为现代社会家庭的 沉重负担。目甜对于缺血性脑损伤的治疗目前侧重于两大方面①尽快改善和恢复缺血损伤脑组织 的血液供应。②保护缺血脑组织免受代谢毒物的进一步损害。早期再通闭塞的脑血管，是为 了在出现不可逆损害之前，给受累脑组织及时供血，以期阻断杀死祌经元的脑化学因子的连 锁反应，增加脑组织的耐受性，从而挽救半暗区脑组织功能；而保护神经元则是通过阻断由 缺血所致各种有害病理过程的发生，从而防止或局限缺血所引起的脑损害，减少脑细胞死亡 和促进功能恢复。双管齐下、协同应用，将使治疗更具针对性和科学性，有望提高缺血性脑 损伤的疗效。
改善和恢复缺血脑组织血液供应的手段包括溶栓治疗、抗凝治疗和抗血小板凝集等。1. 溶栓治疗20世纪80年代以来，溶栓治疗尤其是超早期大剂量溶栓已成为缺血性脑 损伤的首选疗法。但与安慰剂组相比溶栓治疗显著增加了致命性颅内出血的发生率和其它原 因死亡的危险性。因此溶栓治疗风险大，对某些缺血时间较长的区域如缺血中心区和易损区 较易产生再灌注损伤、梗死后出血和严重脑水肿，需要严格掌握适应证和用药时间窗。2. 抗凝治疗抗凝治疗可阻止凝血酶原转变为凝血酶，对抗凝血酶的促进纤维蛋白原 变成纤维蛋白的作用，阻止血小板聚集和破坏，但对己形成的血栓并无直接治疗作用，故十 分强调早期应用。但也有学者提出相反的看法，认为发病后立即进行抗凝治疗，包括使用肝 素、低分子肝素、肝素因子或特殊的凝血酶抑制剂，未显示出长期或短期的改善作用；虽然 可降低深静脉血栓形成和肿动脉栓塞的危险，但这一作用也被其发生颅内外出血的危险性所 抵消。3. 抗血小板凝集阿斯匹林具有抗血小板凝聚作用，现己被广泛应用于缺血性脑损伤 的治疗，但其用量近年来一直未统一。实验室研究证实30 50mg/d阿斯匹林即可达到治疗 目的，因此临床上以小剂量作为治疗及预防缺血性脑血管病的方法。新型抗血小板药物一噻 氯匹啶近年多用于治疗缺血性脑血管病，其临床疗效已得到公认，且优于阿斯匹林。4. 血液稀释疗法血液稀释疗法是通过降低血细胞比容而使血黏度下降，进而增加局 部脑血流量起到治疗作用。文献报道早期采用等容血液稀释，应用半衰期较长的胶渗液，如 白蛋白或具有携氧能力的合成蛋白Pentastarch等有望取得较好疗效。选择性血液成分稀释 是在国内外己应用的血液稀释疗法和血液光量子疗法的基础上，针对缺血性脑损伤患者的血 液流变性不同类型改变或弃血浆、或弃血细胞的一种新疗法。5. 扩血管药物的治疗常用药物如脑益嗪、罂粟碱、碳酸氢钠以及钙拮抗剂尼莫地平 等。但有人对应用血管扩张药提出异议，认为在缺血性脑血管病急性期(发病后1 3周) 应用血管扩张药易引发再灌注损伤，加重缺血区和半暗区脑组织的损害。另一方面，对缺血脑组织和神经细胞进行保护已成为当今脑缺血损伤治疗的研究热点， 许多神经保护剂正在临床开发试用中。目前认为，神经保护剂治疗急性缺血性脑损伤的主要 作用途径有阻止CV'的内流、清除自由基、使用兴奋性氨基酸受体拮抗剂、神经营养因子 和Y-氨基丁酸受体激动剂等，其中研究较多的包括 1. 钙通道阻滞剂研究最早、最广泛的是二氢吡啶类药物，以尼莫地平为代表，该药 为电压敏感钙通道拮抗剂，具有脂溶性，容易通过血脑屏障。在3719例患者的随机对照研 究中，口服120mg未见有显著意义；但在发病12小时内接受治疗的患者，其不良结果的危险性下降了3挑。目前对于发病6小时内尼莫地平治疔临床m期研究还在荷兰进行。镁的小样本研究表明，患者对该药有良好耐受性，治疗组大多数患者神经功能改善，病后6个月再 入院机会减少。 一组包含60例患者的研究显示，硫酸镁定期治疗后，治疗组病死率和伤残 率为30%,安慰剂组为40%，该药的确实疗效仍在进一步研究。2. 自由基清除剂急性脑缺血时，脑内自由基大量产生，使膜结构遭到破坏，导致祌 经元损害。自由基还可使缺血半暗区的血管痉挛及血管内凝血，使梗死范围扩大而加重脑组 织损伤，故清除自由基治疗十分重要。维生素E、维生素C、超氧化物歧化酶(SOD)、激素、 甘露醇等是常用的自由基清除剂，对缺血的脑细胞可提供保护作用。3.谷氨酸释放抑制剂作用机制是抑制突触前谷氨酸的合成及释放，动物实验显示其有明 确的脑保护作用。但其临床应用还有待验证。实际上，世界各地的研究人员一直致力于解决缺血后脑细胞保护这道难题，但由于脑缺 血所致中枢神经组织和细胞损伤的病理机制涉及复杂的时间和空间的级联反应和交互作用， 任何只针对其中单一环节或个别分子机制进行干预的治疗尝试几乎都注定收效甚微，因此尽 管在动物模型上己取得多种有希望的治疗方法；尽管-一直在开发许多化合物进行抗脑缺血作 用的研究，但是迄今为止绝大部分临床试验的结果都令人失望，原因可能就在于忽视了脑缺 血引起的细胞损伤过程具有多阶段、多中心机制和多向性的特点。整体来看，人们对脑缺血损伤的机制和病理改变虽然有比较深入的了解，但是相应的有 效治疗手段仍然缺乏，临床上还只能以溶栓、再通为主，然而这样的处理只解决了血供问题， 对缺血后的神经细胞损伤特别是再灌注损伤和迟发性死亡这些重要环节基本上无能为力，且 应用中还存在出血的危险和其他明显的限制。在我国，尽管总体疗效并不理想，但每年光是 用于治疗中风的支出就高达近百亿元人民币，还未算上可能延及患者一生的漫长的脑损伤康 复和神经功能维持过程所必需的巨额费用。因此，寻找能作用在缺血脑损伤过程的多个环节、 干预其发生发展的多种机制的药物就具有非凡的意义，将对脑缺血损伤的有效缓解和治疗产生深远的影响，既大大减轻r社会、家庭和个人的精祌和经济负担，又可以在潜力巨大的医 药市场占据一席之地，从而带来极为显著的杜会效益和经济效益。因此，有药理学家预测，最终能投入临床实用、高效对抗脑缺血损伤的希望之星将出自 具备多靶点作用机制的化合物。在众多的研究和开发对象当中，神经活性甾体由于对神经系 统具有广泛效应而日益受到关注。神经活性甾体(neuroactive steroids, NASs)是天然存在或者人工合成的在神经组织具有活性的所有甾体激素的统称。NASs具有一般甾体激素的经典作用方式，即通过结合神经元内特异的核受体如孕酮和雄激素受体，对神经元和神经胶质细胞的多种受体和蛋白质的基因表达进行调节，称为基因组效应，过程涉及DNA的转录、翻译和蛋白质修饰，所以起效较慢；NASs还能快速调制GABA受体、Glu受体、乙酰胆碱受体和胞内Signml受体的活性，以非基因组方式直接影响情绪、神经元的可塑性及兴奋性、突触传递和学习记忆等中枢活动。近年的一些研究陆续发现，某些神经活性甾体对神经元的损伤、死亡以及多种中枢神经系统疾病有显著的调节作用。例如，海人藻酸可以引起海马CA1和CA3区神经元的丢失，而别孕烯醇酮(allopregnanolone. AL)能缓解海人藻酸的这种神经毒性；在体外培养的海马不可逆神经毒性细胞模型(低氧和谷氨酸)中，AL也显示出其神经保护作用。脱氢表雄酮(dehydro印iandrosterone， DHEA)能降低Glu类似物和皮质甾类的神经毒性作用，但在人体内的含量却随年龄增长而逐渐减少，被认为与衰老过程中的神经退行性变化相关；在可逆的兔脊髓缺血模型中，DHEA也具有神经保护作用；在体外大鼠胚胎中枢皮质神经元缺氧模型中， 一定浓度的DHEA能显著增加神经元存活率。雌激素是已知神经保护作用最强的NAS,对黑质多巴胺能神经毒性有良好的保护作用，与帕金森病(Parkinson' s Disease, PD)的性别差异相符；绝经妇女卵巢停止产生雌激素，而大脑的淀粉样蛋白前体浓度就增加并引起Af3沉积，给予雌激素又能明显降低大脑的A日水平，提示了雌激素与阿尔茨海默病(Alzheimer' s Disease, AD)的内在关联；雌激素对缺血、中风和其它多种因素导致的神经元死亡有保护作用，还能延迟海人藻酸诱导的癫痫并保护癫痫状态导致的海马损伤；雌激素在几种毒性模型中对神经元都有明显的保护效应，提示了其激活受体、抗氧化、拮抗兴奋毒性、调节信号传导通路、调节基因表达等多方面的作用。有研究学者近年的研究也发现雌二醇和睾丸酮具有类似神经营养因子的作用，能够促进中抠神经系统损伤后的再生；雌二醇对脑缺血再灌注损伤有保护作用，可以减少和延缓动物的癫痫发作，具有类似转离子通道拮抗
剂的作用雌二醇和植物雌激素对去势后大鼠中枢神经系统胆碱能神经元退变具有保护作 用，能够减少基底前脑胆碱能神经元和海马胆碱能神经纤维的丢失，提高动物认知能力。[发明内容]海洋甾体YC-1(24 —亚甲基一胆甾一3e，5a，6e， 19一四醇)属于氧代固醇类化合物， 具有不多见的侧链结构。研究资料显示YC-1除具有增强学习记忆的能力以外，还能通过非 基因组机制剂量依赖性地抑制谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元兴奋毒性死亡，此保护作用并不 通过刚DA受体介导；YC-1也能剂量依赖性地抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡，提示是 通过抑制c-Juri基因的表达及降低磷酸化c-Jun水平而发挥作用，PI3K/AKT存活通路可能参 与该调控过程；YC-1还能剂量依赖性地抑制缺氧诱导的小脑颗粒神经元凋亡；在整体动物实 验中，无论是行为学指标还是组织活性检测都明确显示YC-1对大鼠MCA0所致局灶性脑缺血 损伤具有极为显著的防、治效果；对兔脊髓缺血损伤亦有显著的防护作用。研究还发现YC-1 及其同类物软珊瑚胆甾烯可通过阻遏还原型谷胱甘肽耗竭等途径间接发挥抗氧化作用；通过 膜稳定作用明显减少炎性因子PGE2的释放从而发挥抗炎作用。可见，YC-1是一种可能通过 多种作用机制、针对不同靶点有效对抗缺血脑损伤的化合物，具有发展为临床抗脑缺血损伤 用药的潜在价值。此外，兴奋毒性、氧化应激、炎性反应以及神经元的凋亡、坏死在以PD (Parkinson' s Disease)、 AD (Alzheimer' s Disease)为主的神经退行性疾病的发生发 展过程中扮演着十分重要的角色，因此，对这些致病性改变具有显著干预作用的YC-1在抗 神经退行性疾病药物的研发过程中具有广阔的前景。从南沙群岛唇软珊瑚中提取的氧代固醇类化合物海洋甾体YC-1对多种神经元损伤都具 有保护作用，在有效保护剂量下未见毒性反应；然而天然提取的海洋甾体YC-1产量有限， 不利于大规模生产；应用化学合成的方法可解决这一问题。以廉价的猪去氧胆酸为原料，经 14步有机反应合成可得到目标化合物YG-1;利用IR、剛R、 MS、 EA等技术对目标化合物的 结构进行表征，可获得其IR、 1H刚R、 13C丽R、 MS、 EA等数据。本发明为YC-1结构、效能的优化完善并完成临床前试验和临床试验，使之发展成为保 护神经元的新型药物奠定坚实的基础。

图1: YC-1(24 —亚甲基一胆甾一3e，5a,6e,19 —四醇)的合成路线。图2: YC-1的碳核磁共振谱。图3: YC-1的氢核磁共振谱。图4: YC-1的红外光谱。图5: YC-1的质谱。图6: YC-1可减少永久性大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠的半球梗塞体积。图7: YC-1对永久性大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠的保护作用。图8: YC-1对兔脊髓缺血模型的神经功能评分的影响。图9: YC-1对兔脊髓缺血模型行为学的影响。图10: YC-1可增加兔脊髓缺血后脊髓前角神经元的数目。图11: HE染色显示YC-1对兔脊髓缺血后脊髓前角神经元的影响。图12:相差显微镜揭示的给药后的经H/R处理的CGNs的形态。图13: FDA活细胞染色表明海洋甾体YC-1抑制H/R引起的CGNs凋亡。图14: Hoechst33258凋亡细胞核形态学分析表明YC-1可抑制H/R诱导的CGNs凋亡。图15:相差显微镜揭示的给药后的经LK处理的CGNs的形态。图16: FDA活细胞染色表明海洋甾体YC-1抑制LK引起的CGNs凋亡。图17: Hoechst33258凋亡细胞核形态学分析表明YC-1可抑制LK诱导的CGNs凋亡。图18:琼脂糖凝胶电泳分析YC-1可减少LK诱导CGNs凋亡表现的DNA断裂片断。图19: FDA活细胞染色表明海洋甾体YC-1抑制Glu引起的CGNs凋亡。[具体实施方式
]一、海洋甾体YC-1(24 —亚甲基一胆甾一3日，5a ,63， 19 —四醇)的合成以廉价的猪去氧胆酸为原料，经14步有机反应合成得到了目标化合物YC-1及其相关类
似物，并利用波谱技术对各中间体及目标化合物进行表征。1、 YC-1 (24—亚甲基一胆甾一3 5 6 19—四醇)的合成路线，见图1。 2 、 YC-1合成工艺条件优化(1) 3—乙酰氧基一胆甾一5—溴一6—羟基—24 —酮的合成该步反应3 —乙酰氧基一胆甾一5 —烯一24—酮和N—溴代丁二酰亚胺反应而得，产 物中存在多种异构体，产率较低，通过选择溶剂、反应温度等反应条件对其反应过程进行优 化；通过重结晶、溶剂沉淀、柱层析等纯化方法对其分离方法进行研究。(2) —乙酰氧基一胆甾一5—溴一6 19—环氧一24 —酮的合成该步反应3 —乙酰氧基一胆甾一5 —溴一6 —羟基一24 —酮中的6 —羟基发生 远程氧化关环而得，分别采用了四醋酸铅、二乙酰碘代苯在紫外灯光照及超声波两种条件下 进行氧化反应，对该工艺条件进行优化研究。(3) 3 19 — 二乙酰氧基一5 6—环氧—24—酮的合成3 19—二乙酰氧基一5 6—环氧一24 —酮由3 19 — 二乙酰氧基一5 — 烯一24 —酮的5， 6 —位双键氧化制得，不同的氧化剂氧化产物的顺反比例不同，产率不同， 采用三种氧化剂间一氯过氧苯甲酸、双氧水/甲酸体系及高锰酸钾/硫酸铜体系对5,6—位 双键进行氧化，进行工艺条件优化。3、 目标化合物YC-l及各中间体的表征利用IR、陋R、 MS、 EA等技术对目标化合物及各中间体的结构进行表征，获得它们的IR、 1H刚R、訓MR、 MS、 EA等数据。其中YC-1的波谱数据如下 熔点223—225。C元素分析C28H4804 测定值C，75. 20; H, 10. 36 理论值C，74. 95; H， 10. 78, MS: [M-H20] 432,IR: 3416， 3028， 2936, 2868, 1642, 1464, 1377， 1057 'HNMR(DMSO)5.25(1H，d，6e-0H)， 4. 71 (1H, d， >1. 5Hz'28-CH), 4. 65(1H， d， ,1. 5Hz, 28-CH), 4. 51(1H,d, 19-0H)，4. 16(1H，d，3—CH)， 4. Ol(lH, d, 19-CH)， 3. 84 (1H, ra， 3—CH), 3. 64 (1H， s, 5-0H), 3.23 (lH,m，6-CH),2. 25(1H，m'25-CH), 1. 13 (6H， d, 26-CH3， 27—CH3), l.Ol(犯，s， 19 —CH3)， 0.87(3H,d, 21—CH3)， 0.67(3H，s，18-CH3).13CNMR(DMS0)156.6(C), 107.3(CH2)， 75.4(C), 74.7咖,66.7咖，63.0(CH2)， 57.4(CH), 56.7(CH), 45.9(CH), 43.5(C), 43.3(CH), 42.8(C), 41.3(CH2),肌9(CH), 37.4(CH2)， 36. l(CH), 33.9(CH2〉， 31.8(CH2), 31.4(CH2), 30.5(CH2)， 28.7(CH2), 27.9(CH2)， 24.70(CH2), 22.64(CH3), 22.57(CH3), 19.4(CH3), 13. 1 (CH3).4、 设计合成YC-1的类似物(1) 3 —羟基胆甾系列类似物(2) 3 6 —二羟基胆甾系列类似物(3) 3 5,6—三羟基胆甾系列类似物(4) 3 19 — 二羟基胆甾系列类似物(5) 5,6 19 —四羟基胆甾系列类似物(6) 3 —羟基胆甾的二聚体(7) 3 5 6 19 —四羟基胆甾的二聚体(8) 上述各系列中17位侧链为24—羰基、24 —亚甲基、24 —羟基、24—腙等，并利用 IR、丽R、 MS、 EA等技术对目标化合物的结构进行表征。5、 甾体结构修饰研究YC-1的水溶性较差，为改善其溶解性能，以3 —羟基一胆甾一5 —烯一24 —酮为模型， 对3 —位羟基亲水性修饰。(1) 胆甾一5—烯—24—酮一3—羟基一磺酸酯的合成研究(2) 聚乙二醇修饰的3 —羟基一胆甾一5—烯一24—酮的合成研究二、 YC-1及其类似物对MCA0致大鼠脑缺血模型的作用 方法大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCM))的制备健康雄性SD大鼠25只，随机分成3组，分别为YC-1组(n-ll)即在栓塞大脑中动脉后 10ndn、 6h、 24h至7d，连续腹腔注射12mg. Kg-1的YC-1; DMSO组(n=ll)以同样方式注射等 容量DMS0(lml Kg-1); Sham组(『3)仅插入较短栓线未栓塞MCA。1. 参照Zea Longa (Longa EZ， Weinstein PR， Car丄son S, Cummins R. Reversible middlecerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989， 20: 84—91)等制备方法进行改良大鼠术前一晚禁食，自由饮水；麻醉前lOmin腹注硫酸阿托品(0.5mg/Kg);采用10"X^.合氯醛3.5ml/kg腹腔注射(ip)麻醉大鼠，以大鼠后肢回缩反射 及角膜反射消失为麻醉指标，麻醉后仰卧固定，于颈中线切开皮肤、皮下组织，分离左 颈部皮肤与二腹肌、胸锁乳突肌和肩胛舌骨肌，在三肌形成的三角区暴露颈总动脉 (co隱om cartid artery ， CCA)分叉，以及由其发出的颈内动脉(internal carotid artery, ICA)和颈外动脉(external carotid artery, ECA)。结扎颈总动脉CCA，在 咽升动脉起始处结扎ECA。在颈内动脉近端备线，颈总动脉分叉处切口，将长5cm的尼 龙栓线插入ICA向心端，当进栓线约为17 18mm左右，要感到有阻力。此时，栓线进入 颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源，从阻断血流开始计时。 扎紧备线，剪去多余线头，伤口以碘酒消毒，最后缝合皮肤，手术完毕回笼饲养。假手 术组除插线较短栓线(10mm)未及MCA起始处外，其余步骤同上。实验过程中使用美体康 电子温度仪测量直肠温度，动物体温严格控制在36. 5 37. 5°C。 结果肉眼观察假手术组脑组织颜色、形态正常、无苍白和肿胀。DMSO组大鼠的脑组织 可见明显的苍白肿胀；YC-1组脑组织无明显的苍白和肿胀。TTC染色显示，YC-l组梗塞体积 较DMSO组明显减少(梗塞面积分别为32±11%和62±8%);假手术组无缺血。三、YC-1对腹主动脉夹闭致兔脊髓缺血模型的作用 方法脊髓缺血模型制作24只雄性新西兰大白兔均分为3组(n-8): YC-1组即在脊髓缺血前30分钟经耳缘静脉 注射8mg.Kg-1海洋甾体YC-1; DMSO组即在脊髓缺血前30钟同样方式注射等容量 DMS0(M . Kg-l); Sham组叩仅仅暴露腹主动脉，而不阻断它。参照Johnson等方法制作兔脊髓缺血模型。动物术前禁食过夜，自由饮水。3%戊巴比妥钠30mg. Kg-1经耳缘静脉麻醉动物，经另侧耳缘静脉置一静脉留置针(24G)，用于术中注药、输液。取右侧耳动脉置一动脉留置针(24G)，用于监测术中近端动脉压及采血样用。取一侧股动脉置一动脉留置针(24G),用于监测术中远端动脉压。动物仰卧位，取腹正中切口 ，暴露腹主动脉。经耳缘静脉给予150U.Kg-1肝素后，在左肾动脉起点以下0.5 1.0cm处用动脉夹阻断腹主动脉，造成兔脊髓缺血。阻断腹主动脉后，远端动脉压立刻下降，股动脉搏动消失。缺血20分钟后移去动脉夹开放腹主动脉，恢复血流，然后关闭腹腔。术毕，肌注庆大霉素4 万U，动物被放回饲养笼，观察48小时。术中持续监测近端动脉压、远端动脉压及心率 (Spacelab，美国)。用加热垫和烤灯维持动物直肠温度38. 5±0. 5'C。分别于缺血前10 分钟、缺血后10分钟和再灌注10分钟经兔耳动脉采血监测血气(AVL-2， Switzerland)和 血糖(One Touch II， USA)。结果各组动物神经功能评分结果详见图l。假手术组兔的后肢神经功能在整个观察期间完全.TE常(4分)；而DMSO组中没有一K兔能够站立CPA组中有6只兔能够站立，另2只兔 后肢也有明显的运动。YC-l组和Sham组的神经功能评分在各观察时间点均明显高于DMSO组 (p<0.05)。组织病理学检测表明在DMS0组，腰段脊髓有严重的损伤，表现为运动神经元 的减少、尼氏体及核消失、空泡变性；而在YC-l组，腰段脊髓损伤明显减轻。见图3。与DMS0 组相比，CPA组和Sham组的脊髓前角正常神经细胞数明显增多(p <0.01)。见图4。四、YC-1及其类似物对缺氧诱导体外培养小脑颗粒神经元死亡的作用方法1.大鼠小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons, CGNs)的培养按Yan等的方法(w，取出生7 8d，体重约15 20g的清洁级SD大鼠，无菌条件下分离小脑，置无Ca"、 Mg" Kreb' s液(解剖液)中去除脑膜和血管，用眼科剪剪成1 miif大小的组织块，然后在含0.25g* L—'胰酶的消化液中37'C消化15分钟，随即加入0.5 g. L/'胰酶抑制剂和0.05g丄—1 DNase I的吹散液终止消化，并吹散为单个细胞悬液，以200g离心5分钟，沉淀用吹洗液洗1次，再以200g离心5分钟，弃上清液，沉淀用含10y。(v/v)胎牛血清和25mMKCl的BME培养基稀释至细胞密度为1.5-1.8Xl(f个细胞/ml，接种于经多聚赖氨酸预包被的培养皿中，置于5% 0)2及37'C培养箱中培养。接种后24小时加入10 nniol.L—1 Ara-C以抑制非祌经元细胞的生长和增殖，使小脑颗粒神经元的纯度在95%以上。培养第7d加入葡萄糖至5mM，以补充细胞代谢所需能量。第8天进行实验。2.小脑颗粒祌经元缺氧/再给氧(H/R)损伤模型的建立参照Seko (SekoY, Tobe K， UekiK， et al. Hypoxia and hypoxia/reoxygenation activate Raf-1， mitogen-activatedprotein kinase kinase, mitogen-activated protein kinases, and S6 kinase in culturedrat cardiac myocytes. Circ Res. 1996 Jan;78(1) :82-90)等方法制备缺氧/再给氧模型。将CGNs置于放有耗氧剂和指示剂的密闭盒中并于37X:下放置3h,然后将细胞置于5% C02
及37'C培养箱中进行再给氧处理。3.细胞形态学观察和神经元存活率的测定按Yan (Yan G M， Irwin R P， Lin S Z， et al. Diphenylhydantoin induces apoptotic cell death of cultured rat cerebellar granule neurons. J Pharmacol Exp Ther， 1995， 274(2): 983-8)等的方法进行，主要为 小脑颗粒神经元培养在35國的培养皿中，第8 d，各因素处理相应时间后，移去培养基， 用含Ca"、 Mg"的4。C PBS洗2次，40g. L—'多聚甲醛液(4 °C ，溶于PBS)固定10min，移 去固定液，用蒸馏水清洗2次，置4'C下自然晾干，然后在倒置荧光显微镜(Olympus)下观察 形态学变化，并随机拍照。结果相差显微镜下观察，缺氧前，小脑颗粒神经元胞体饱满透亮，细胞突起以及由之 构成的联系网络紧密，清晰而完整；缺氧3h再给氧24h后(H/R)，神经元胞体縮小，结构不 清，突起和网络出现紊乱、断裂；加入10MK801或12yM YC-1或12uM YC-2 3h后再 进行H/R处理，绝大部分CGNs均能保持胞体完整、饱满透亮，突起及网络紧密、清晰而完 整。FDA染色分析，H/R后，神经元的存活率明显降低(16. 56±3. 21%);加入10uMMK801 或12uMYC-1、 YC-2后，细胞存活率分别达86. 73±3.21%、 84. 29± 1. 26%和83. 54±4. 78%。Hoechst33258染色显示，正常CGNs胞核完整，染色质分布均匀；H/R后，CGNs胞核染 色质固缩边聚，出现凋亡小体；而加入12iiM YC-l、 YC-2的CGNs经过H/R处理后，大部分 CGNs的核形态正常，染色质分布均匀。五、YC-1及其类似物对复极化诱导体外培养小脑颗粒神经元死亡的作用方法大鼠小脑颗粒神经元的培养、细胞形态学观察和神经元存活率的测定、细胞形态学观察和神经元存活率的测定同前；琼脂糖凝胶电泳参照文献m,将小脑颗粒神经元种植在35 mm2的培养皿中。第8天，加入各种药物24h后，移去培养基，用PBS洗2次，将收集的细胞用低温高速离心机(Biofuge22R， Heraeus，德国)离心(5 000rpm， 4'C,5min),再将细胞团块加入600u L含有IO mmol. L—1 Tris-HC1,10隱ol. L—' EDTA和2 g. LH Triton X-100(pH 7. 5)的缓冲液中15min，离心(12 000rpm， 4。C， 10min)。上清加等体积酚抽提1次，离心。上清用等体积的酚、氯仿(i:l)混合液抽提l次，离心。取上清，加入300 mmoLL—'的乙酸 钠和等体积的异丙醇，沉淀过夜。离心后，用70%乙醇洗涤2 3次，干燥后加入TE[Tris 10画1丄—';EDTA 1.0國l丄—'(pH 7.4)和0. 6 g. L—'的RNase A ]37。C温育30min，样品放 在20 g. L—1的琼脂糖凝胶上电泳lh，溴乙淀染色后在紫外灯下观察拍照。结果体外培养8天的大鼠CGNs在含25rnM KC1的无血清BME培养基中，相差显微镜下 观察其胞体及突起完整换成5rnM KC1的无血清BME培养24h后，神经元胞体皱縮，突起断 裂；FDA荧光染色法分析表明，仅有40.2±14.04%的CGN.s存活。如果在更换为低钾培养基 前3h和同时加入12 y M YC-1或YC-2后，再继续培养24h, CGNs大部分都能保持胞体和突起 的完整；FDA染色显示，分别有94.3±14.02%和84.2±13.34%的细胞存活。这表明海洋甾体 YC-1和YC-2可以明显提高低钾培养的大鼠CGNs的存活率。六、YC-1及其类似物对谷氨酸诱导体外培养小脑颗粒神经元死亡的作用方法大鼠小脑颗粒神经元的分离和原代培养；相差显微镜术(phase contrast microscopy)观察神经元的胞体及突起形态；二乙酸荧光素(fluorescein diacetate， FDA) 染色检测神经元的代谢活性(metabolic activity)和存活率(viability)。结果体外培养8天的大鼠CGNs，给予150wM谷氨酸(Glu)， 24h后用相差显微镜观 察，发现神经元胞体明显縮小，细胞核固縮，突起断裂或消失。在加入Glu前lh给予12wM 的YC-1或YC-2， 24h后观察发现，YC-1和YC-2均能明显的抑制Glu引起的CGNs凋亡。FDA 法测定CGNs的存活率发现，与Glu对照组(29. 5±8.23%)相比，12 YC-1和YC-2能 明显提高CGNs的存活率(分别为92.6士2. 59%和91.6±10. 11"。
权利要求
1、海洋甾体化合物在制备治疗神经元损伤药物中的应用。
2、 根据权利要求1所述用途，其特征在于该海洋甾体化合物为24 —亚甲基一胆甾一3(3，5a,6卩，19一四醇。
全文摘要
本发明涉及海洋甾体YC-1(24-亚甲基-胆甾-3β，5α，6β，19-四醇)在制备治疗神经元损伤药物中的应用。从南沙群岛唇软珊瑚中提取的氧代固醇类化合物海洋甾体YC-1对多种神经元损伤都具有保护作用，在有效保护剂量下未见毒性反应；然而天然提取的海洋甾体YC-1产量有限，不利于大规模生产；应用化学合成的方法可解决这一问题。本发明为YC-1结构、效能的优化完善并完成临床前试验和临床试验，使之发展成为保护神经元的新型药物奠定坚实的基础。
文档编号A61K31/56GK101164540SQ20061003692
公开日2008年4月23日 申请日期2006年8月3日 优先权日2006年8月3日
发明者刘爱伶, 桑韩飞, 苏兴文, 翔 蔡, 邱鹏新, 巍 银, 颜光美, 黄奕俊 申请人:中山大学