专利名称：：23-羟基白桦酸在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及天然药物领域，具体涉及23-羟基白桦酸在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用。随着经济的发展、环境污染的加重，恶性肿瘤的发病率逐年上升，目前已被临床界定为常见病、多发病，严重威胁了人类的健康。肿瘤化疗的效果并不是很理想，目前除了血液肿瘤外多数肿瘤都不能被彻底的治愈，学术界公认的主要原因是肿瘤耐药的发生。产生肿瘤耐药的机制非常复杂，但目前研究最多的且被公认的重要原因之一是P-糖蛋白(P-gp)的高度表达(CancerControl.2003;10:159—165;HematolOncolClinNorthAm.1994;8:383~410)。P-gp能将多种抗肿瘤药泵出细胞外或者使其远离靶点而降低抗肿瘤药原有的细胞毒作用，很多化疗药物都是P-gp的底物，例如蒽环类、长春碱类、紫杉烷类、鬼臼乙叉甙类及米托蒽醌、丝裂霉素等。因此，抑制P-gp的功能可以部分逆转肿瘤的耐药从而增加肿瘤细胞对化疗药的敏感性(AnnuRevPharmacolToxicol.999;39:361-398;EurJPh纖Sci..000;11:265-283.)。体外研究已经发现了很多结构不同的对P-gp具有抑制作用的药物，其中包括钙通道阻滞剂，钙调蛋白拮抗剂，环孢菌素，喹啉及甾体激素类等，国内外对这些逆转剂逆转MDR的活性及作用机制进行了大量的体内外研究，然而多数逆转剂尚未用于临床，其主要原因是，已有的P-gp抑制剂在人体可耐受的剂量下体内不能达到有效的逆转浓度，或毒副作用大。如维拉帕米的心血管毒性，环孢菌素的肝脏毒性等(Pharmacol.Rev.42,155-159)。因此，寻找低毒高效的肿瘤耐药逆转剂成为提高肿瘤化疗疗效的关键之一。23-羟基白桦酸(23-HBA)是从中药白头翁中提取出来的一种五环三萜类化合物，其结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>分子式为C30H48O4(化学学报，1983;41(8):739-745)。CN03152904.6公开了23-羟
背景技术：
基白桦酸具有治疗或预防肠道肿瘤、肺癌、肝癌、脑神经胶质瘤及艾滋病药物的用途，能够作为一种直接杀伤肿瘤细胞的药物，但具体的抗癌机制不明。CN200510038469.5公开了其具有抑制血管生成的功效。CN03152904.6报道了23-羟基白桦酸的小鼠急性毒性试验结果表明灌胃5.0g/kg23-羟基白桦酸混悬液给药，未见小鼠死亡；腹腔注射23-羟基白桦酸的LD50值为2.13士0.65g/kg。表明23-羟基白桦酸毒性很低。
发明内容本发明公开了23-羟基白桦酸的新的医药用途，即其可以用于治疗与P-糖蛋白过度表达相关疾病，特别是其在制备多药耐药逆转剂中的应用。试验表明，23-羟基白桦酸可以抑制P-gp的功能从而增加P-gp底物药在细胞内的累积，进一步药效试验表明，其增加了多种P-gp底物抗肿瘤药的细胞毒作用。体内试验采用荷S180(P-gp高表达)的昆明种小鼠，23-羟基白桦酸增加了阿霉素在肿瘤组织内的富集并且增加了其抗肿瘤药效。本研究采用FDA推荐的Caco-2单层细胞模型对23-羟基白桦酸的抑制强度进行了考察，其抑制P-gp底物地高辛双向转运极性的IC50为1.7^M,和经典的P-gp抑制剂维拉帕米相当。由此可见，23-羟基白桦酸可以作为一种安全高效的肿瘤化疗增敏剂用于临床，从而逆转由于P-gp高表达引起的肿瘤耐药，起到增效减毒的作用。作为肿瘤化疗增敏剂，23-羟基白桦酸可以和其他化疗药联合应用而起到增效减毒的作用。特别是对由于P-gp高表达引起耐药的肿瘤，可以增加肿瘤对化疗药的敏感性，提高临床化疗的效果。所述的化疗药可以是蒽环类(如阿霉素、柔红霉素、表柔比星)、长春碱类(如长春瑞滨、长春新碱、长春碱)、紫杉醇类(如紫杉醇、多西紫杉醇)、鬼臼乙叉甙类(如依托泊苷、替尼泊苷)、米托蒽醌或丝裂霉素。23-羟基白桦酸可用于多种耐药的肿瘤细胞的化疗增敏，包括由于P-gp高度表达而引起的天然耐药和获得性耐药。这些肿瘤包括但不限于肠道肿瘤、胃癌、肝癌、肺癌、脑部肿瘤、胆囊癌或血液系统肿瘤。所述化疗药物为P-gp底物的化疗药，具体包括但不限于蒽环类、长春碱类、紫杉醇类、鬼臼乙叉甙类及米托蒽醌、丝裂霉素等。这两处是否重复？)图123-羟基白桦酸对P-gp底物地髙辛在NCI-H460细胞内累积的影响。、pO.05VSControl组。图223-羟基白桦酸对阿霉素在NCI-H460细胞内累积的影响。***，p<0.005VSControl组。图323-羟基白桦酸对阿霉素在Caco-2细胞内累积的影响。*，p<0.05VSControl组。图423-羟基白桦酸在NCI-H460细胞上对阿霉素的增敏作用的MTT药效试验,，p0.05VS阿霉素单用组。图523-羟基白桦酸在NCI-H460细胞上对紫杉醇的增敏作用的MTT药效试验。、p0.05VS紫杉醇单用组。图623-羟基白桦酸在Caco-2细胞上对阿霉素(ADM)、紫杉醇(PAC)的增敏作用的MTT药效试验。*，pO.05VS单用组。具体实施方式实施例1细胞摄取实验考察23-羟基白桦酸对P-gp底物药地高辛细胞内累积的影响实验材料选择P-gp高表达的NCI-H460肿瘤细胞(中科院上海细胞库)于37。C，5%C02条件下常规培养，培养基为含10%小牛血清(PAA)的RPMI-1640(Gibco)。23-羟基白桦酸由叶文才(暨南大学)教授提供，母液20mMDMSO配。地高辛标准品购自中国药品生物制品检定所，母液200pM由乙醇配制。实验方法1.分化良好的NCI-H460细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，调节细胞密度为5乂104细胞/ml。lml/孔接种于24孔培养板中，于培养箱中培养，隔天换液，至分化成致密单层进行实验。2.进行实验时，去掉培养基，Hank's液洗板三次，给药组加入含23-羟基白桦酸溶液2，20)nM、地高辛5pM的Hank's液，空白对照组加入只含5pM地高辛的Hank's液，温孵2小时。3.终止反应，冰Hank's液洗板三次。加入超纯水30(^1/孔，反复冻融三次充分破碎细胞。LC-MS测定细胞内药物浓度。实验N-4，平行三次。实验结果见图1。结果显示，23-羟基白桦酸显著增加了P-gp底物地高辛在细胞内的累积。实施例2Caco-2双向转运模型考察23-羟基白桦酸对P-gp底物药地高辛转运极性的影响实验材料Caco-2细胞购自美国ATCC，培养于37。C，5%C02的培养箱，培养基为含10%胎牛血清(Gibco)的高糖DMEM(Gibco)。地高辛标准品购自中国药品生物制品检定所，母液200由乙醇配制。实验方法1.分化良好的Caco-2细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为2X1()S细胞/ml，400^1/孔接种于MillicelI的A侧，B侧补充600W培养基。于培养箱中培养，隔天换液，至第21天进行实验。2.进行实验时，去掉培养基，将Millicell用Hank's液洗三次，给药组分别在A、B两侧加入含23-羟基白桦酸0.2，2,20|iM的Hank's液，对照组加空白Hank's液，预温孵0.5h。后洗掉药物。分别在A侧(测定A—B)和B侧(测定B—A)加入5pM地高辛溶液，温孵2h，分别取B侧和A侧的Hank's液用于测定。3.LC-MS方法测定地高辛的转运量，并计算表观通透系数(Papp)值。用Papp(B—A)/Papp(A—B)表示地高辛的转运极性并考察23-羟基白桦酸对其转运极性的影响。实验结果见表l，结果显示，对照组的Papp(B—A)/Papp(A—B)的值为6.09，说明地高辛为良好的P-gp底物，给药低、中、高三种浓度的23-羟基白桦酸后，Papp(B—A)/Papp(A—B)的值依次减少，最后仅为1.7倍,几乎完全逆转了地高辛的转运极性。估算其IC50约为1.7^M。上述试验结果表明23-羟基白桦酸为较强的P-gp抑制剂。(P-gp存在于A侧，它能将B侧的药物再重新泵回到A侧，一般认为在Caco-2细胞上Papp(B—A)/Papp(A—B)的值大于3时，说明该底物为P-gp的底物)。表1:23-羟基白桦酸对地高辛的转运极性Papp(B—A)/Papp(A—B)的影响Papp(xi(T6cm/s)A—BB—AB~>A/A—B对,照、纟且1.06±0.446.48±0.946.0923-HBA(nM)0.21.46±0.275.22±0.713.5921.67±0.22*4.82±0.942.89201/76±0.32*2.99±0.28*1.70*，p<0.05VS对照组.综合实施例l、2，23-羟基白桦酸为P-gp的抑制剂。下面的实施例将进一步阐述其在抗肿瘤联合用药方面的应用。实施例36细胞摄取实验考察23-羟基白桦酸对P-gp底物抗肿瘤药阿霉素在细胞内累积的影响实验材料选择P-gp高表达的NCI-H460、Caco-2细胞，培养方法同实施例1，2。注射用盐酸阿霉素为浙江海正药业生产，无菌PBS配成母液2mg/ml。实验方法试验方法同实施例1。分别在两株细胞上进行阿霉素的摄取试验研究，给药浓度为5pg/ml。激发波长495nm，检测波长560nm测定细胞内荧光强度，根据随行标曲计算细胞内阿霉素的浓度。N=4，实验平行三次。实验结果见图2和图3。结果显示，在两种P-gp高表达的肿瘤细胞上，23-羟基白桦酸都显著增加了阿霉素在细胞内的累积。实施例4MTT法检测23-羟基白桦酸与阿霉素、紫杉醇联合用药对P-gp高表达的NCI-H460细胞上的细胞毒作用。实验材料细胞、培养方法及药品同实施例1，MTT购自南京建成公司。注射用盐酸阿霉素为浙江海正药业生产，无菌PBS配成母液2mg/ml。紫杉醇标准品由江苏恒瑞公司提供，无菌乙醇配成母液1mg/ml。实验方法1.分化良好的细胞经胰酶消化，悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为2乂104细胞/ml。200^1/孔接种于96孔培养板中，于培养箱中培养过夜。2.次日更换培养基，20p1/孔加入样品，使单独用药组23-羟基白桦酸的终浓度分别为0.2，2，20nM(加入的系列工作液由培养基稀释，DMSO的浓度小于1%。)，阿霉素终浓度分别为0.05，0.5，5pg/ml，紫杉醇终浓度分别O.l，1，10pg/ml，联合用药组则/孔分别加入两种药物上述浓度的工作液。空白对照组含DMSO1%。。3.将给药后的细胞于37。C，5。/。C02条件下培养72小时。4.每孔加入20|ilMTT(5mg/ml)溶液，继续在培养箱中培养4小时。5.洗去培养基，加入150nlDMSO，置于摇床上37。C使充分溶解，以检测波长595nm，参比波长6卯nm测定吸光度的值。计算细胞的生长抑制率。N=6,实验平行三次。实验结果见图4、5。结果显示，在P-gp高表达的NCI-H460细胞上，23-羟基白桦酸在无毒剂量下显著增加了P-gp底物抗肿瘤药阿霉素、紫杉醇的细胞毒作用。实施例5MTT法检测23-羟基白桦酸与阿霉素、紫杉醇联合用药对P-gp高表达的Caco-2细胞的细胞毒作用。实验材料细胞及培养方法同实施例2。实验方法同实施例4，23-羟基白桦酸采用2、20两个给药浓度，阿霉素的给药浓度为0.5pg/ml，紫杉醇的给药浓度为1|ag/ml。实验结果见图6。结果显示，在P-gp高表达的Caco-2细胞上，23-羟基白桦酸在无毒剂量下显著增加了P-gp底物抗肿瘤药阿霉素、紫杉醇的细胞毒作用。实施例35表明，在两种P-gp高表达的细胞株上，23-羟基白桦酸增加了P-gp底物药阿霉素的细胞内摄取量，药效试验证明其也增加了P-gp底物药阿霉素和紫杉醇的MTT细胞毒作用。23-羟基白桦酸在体外可以通过抑制P-gp的功能从而增加P-gp底物药的细胞毒作用，下面进行进一步的体内试验进行验证。实施例6在整体动物水平上考察23-羟基白桦酸对阿霉素的瘤内药物浓度、药效的影响实验材料P-gp高表达的S180瘤株常规腹水保种，每周传代一次。昆明小鼠，体重1822g，由中国药科大学实验动物中心提供。23-羟基白桦酸由叶文才教授(暨南大学)提供，0.5%的CMC-Na制成混悬液，灌胃低高剂量分别为50mg/kg，200mg/kg。注射用盐酸阿霉素为浙江海正药业生产，注射用生理盐水配制，腹腔注射剂量为3mg/kg。实验方法1.取传代一周的S180腹水小鼠，无菌条件下取出腹水，以无菌生理盐水稀释，腋下注射0.1ml稀释的S180腹水溶液。2.将接种好的S180小鼠分别随机分成6组，每组10只。分别为单用23-羟基白桦酸低、高剂量组；单用阿霉素组；合用阿霉素与23-羟基白桦酸低剂量组、合用阿霉素与23-羟基白桦酸高剂量组及阴性对照组。阴性对照组采取假处理，即灌胃不含药物的0.5W的CMC-Na混悬液及腹腔注射生理盐水，单用23-羟基白桦酸低、高剂量组同时腹腔注射生理盐水，单用阿霉素组同时灌胃不含药物的0.5e/。的CMC-Na混悬液。于接种后第二天给药，23-羟基白桦酸连续灌胃7天，阿霉素隔天腹腔注射，第7天给阿霉素两小时后立即处死，称体重，取瘤体称重，避光保存。3.按照下式计算抑瘤率抑瘤率(。/。)气l-T/C)X1000/。，T/C即治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重。4.取100mg瘤组织，加入超纯水0.5ml，匀浆。lOOpl组织匀浆液，加3倍甲醇沉淀后取上清，高速离心后HPLC-UV测定瘤内阿霉素的药物浓度。实验结果23-羟基白桦酸和阿霉素联合用药的药效试验结果如表2。结果显示，23-羟基白桦酸和阿霉素合用后，增加了阿霉素的抑瘤率，低高剂量增敏率分别14.5%，31.1%。体重、死亡率等指标显示毒性没有增加。对瘤内阿霉素的浓度进行了测定，结果表3显示，给予23-羟基白桦酸后，瘤内阿霉素的浓度有所增加，高剂量具有统计学意义。说明23-羟基白桦酸的增效作用之一是增加了阿霉素在瘤内的富集。整体动物试验结果表明灌胃23-羟基白桦酸可以增加P-gp底物抗肿瘤药阿霉素在瘤组织内的富集，进而增加了其抗肿瘤的药效。表223-羟基白桦酸(23-HBA)和阿霉素(ADM)联合用药的药效指标考察<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3瘤内阿霉素浓度的测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*p<0.05VSADM组权利要求1.23-羟基白桦酸用于制备治疗与P-糖蛋白过度表达相关疾病的药物的用途。2.23-羟基白桦酸用于制备肿瘤多药耐药逆转剂的用途。3.权利要求2的用途，其中肿瘤是肠道肿瘤、胃癌、肝癌、肺癌、脑部肿瘤、胆囊癌或血液系统肿瘤。4.23-羟基白桦酸用于制备抗肿瘤药物增敏剂的用途。5.权利要求4的用途，其中抗肿瘤药物是阿霉素、柔红霉素、表柔比星、长春瑞滨、长春新碱、长春碱、紫杉醇、多西紫杉醇、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌或丝裂霉素。全文摘要本发明涉及天然药物领域，具体涉及23-羟基白桦酸在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用，本发明公开了23-羟基白桦酸用于治疗与P-糖蛋白过度表达相关疾病的功效，从而可以用作抗肿瘤药物的增敏剂。文档编号A61K31/7028GK101244067SQ20081002038公开日2008年8月20日申请日期2008年3月4日优先权日2008年3月4日发明者蓓严,叶文才,吴晓兰,芳周,孙建国,李雁楠,温小舟,王广基,郑媛婷,郝海平申请人:中国药科大学