可溶性鸟苷酸环化酶的天然激活剂的制作方法

专利名称：可溶性鸟苷酸环化酶的天然激活剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学和药物化学领域，具体涉及一种利用3H同位素标记的 办法，从中国、印度以及欧洲传统医学中治疗心血管相关疾病的植物组织中筛选 可激活循环系统中的可溶性鸟苷酸环化酶的天然激活剂。
背景技术：
酶在生物体内具有重要的生理生化功能，许多疾病的防治都与酶参与的信号 转导直接相关。可溶性鸟苷环化酶(soluble guanylate cyclase, sGC)参与的 信号转导对血小板聚集抑制、血管平滑肌舒张等方面具有调节作用，在心血管疾 病的防治中发挥重要作用。
众所周知，心脑血管疾病已经成为危害人类健康的第一大隐患。多年来，人 们一直为寻找治疗它们的有效方法而不断努力着。总的说来现在治疗心脑血管疾 病的药物主要是通过舒张血管和溶解栓塞而起作用。
1977年，Murad发现硝酸甘油等有机硝酸酯必须代谢为一氧化氮后才能发挥 扩张血管的作用，Ignarro与Furchgott发现内皮细胞松弛因子 (endothelium-derived rwlaxing factor, EDRF)与一氧化氮及许多硝基化合物 一样能够激活细胞内的cGMP产生酶-一可溶性鸟苷环化酶(soluble guanylate cyclase, sGC)来产生高浓度的cGMP，而在心脑血管系统中，cGMP可以强大而短 暂的舒张血管平滑肌到扩张血管作用。人们知道了硝酸甘油作用的分子机理，并 且根据这一研究成果，研发出了一系列治疗心脑血管疾病的药物，它们的共同特 性是释放(或促进释放) 一氧化氮。由于NO独特的对sGC激活作用的发现， Ignarro、 Furchgott和Murad获得1998年诺贝尔生理学医学奖。但是随着药物 使用范围的增加、样本量加大，人们发现此类药物有诸多的弊端， 一氧化氮在机 体内的危害日趋明显。2001年，Murad等发表文章指出一氧化氮在体内的危害 一氧化氮在机体内除了通过激活可溶性鸟苷环化酶调节机体相关生物活性外，还 作为一种氧化性较强的自由基在机体内产生氧化、超氧化自由基，对脂类、蛋白 质、糖类、核酸进行不正常修饰，影响生物体正常功能。 一氧化氮类药物所采用 的机理是促进鸟苷酸环化酶活力提高，在生理条件下， 一氧化氮与鸟苷酸环化酶 的血红素结合后使酶活力迅速上升200倍左右。如果这一反应是在生理条件下自 发进行的，应该不会出现不良后果，但是现行的方法是采用外加一氧化氮源提高 体内的一氧化氮浓度以达到治疗的目的，这一方法没有考虑到一氧化氮对可溶性
4烈性、一 氧化氮的加入对尿素循环以及海马回的记忆通路产生的影响。 一氧化氮过剩，还 可以成为病毒性心肌炎并发左心室功能不全的主要原因。所以， 一氧化氮体系治 疗心脑血管疾病的药物正在渐渐退出人们用药的首选视线。
另一种常见的治疗心脑血管疾病的药物是磷酸二酯酶(PDE)的抑制剂，它 通过抑制环化单核苷酸——cGMP的降解，进而达到与一氧化氮药物类似的升高 机体内cGMP浓度的目的。但是由于磷酸二酯酶在机体内是一个超级家族，多数 亚型酶的专一性并不强，可水解cAMP、 cGMP，所以这一类药物的专一性较差， 毒副作用较大，在现有的知识水平上难以进行更有效的研发。例如，西洛芬。这 就注定了它也不能成为治疗心血管疾病药物的主流。
近年来，人们发现另一种气体分子——一氧化碳也可以低倍数(4-6倍)激活
可溶性鸟苷环化酶。 一氧化碳在机体中主要是由血红素经血红素氧合酶分解产 生。血红素氧合酶I (HO I )同可溶性鸟苷环化酶、结构型一氧化氮合成酶在机 体中同步分布于脾脏、肝脏、网状内皮系统和骨髓等，当受到缺氧、细胞因子、 内毒素的刺激时，HOI的表达量增多，血红素代素代谢增加，内源性一氧化碳浓 度加大，对胞质的可溶性鸟苷环化酶的激活作用上升，机体内cGMP浓度升高， 引发一系列生理反应，治疗、缓解心脑血管疾病。现有的研究发现内源性一氧化 碳不仅在体循环中有血压调节作用，在肺循环中同样具用调节血压的作用，1998 年Kostoolou等在J nouroimmunol上发表文章指出内源性一氧化碳的中枢调节 作用可能涉及到血管加压素释放的减少。
现在国际上试图以一氧化碳途径治疗心脑血管疾病的药物及疗法的研究正 在迅速兴起。但到目前为止，由于一氧化碳对sGC的低倍数激活，所以研究多局 限在提高体内天然一氧化碳浓度和体外高剂量水平上，有的研究人员曾尝试用一 氧化碳吸入法治疗心脑血管系统疾病。但是由于一氧化碳对血红细胞的结合能力 是氧对血红细胞结合能力的200倍，同氧分子竞争性地结合血红蛋白，氧的转运 发生障碍，引起组织缺氧，所以过量外源性加入一氧化碳的直接吸入法是难于调 控的，其真正的前景受到限制。
人们为研究sGC激活的分子机理，利用组合化学的方法，体外相继化学合成 并选择出了几种非一氧化氮依赖的可溶性鸟苷环化酶激活剂，如YC-1 、 BAY等 等。令人兴奋的是，它们不但自身对sGC有10几倍的激活作用，且与一氧化碳 可以协同激活可溶性鸟苷环化酶，达到一氧化氮同样的激活效果。这一结果，向 人们展示了开避另类途径调节可溶性鸟苷环化酶实现特有生理生化功能，以达到 治疗心脑血管疾病的可能性，已引起国际上相关研究人员的高度重视。然而YC-1， BAY属于人工合成化合物，作为激理研究的模型化合物是非常适宜的；但 其真正的药用应用前景还不明确。但是否天然产物、食物甚至动物体内能存在类 似于YC-1， BAY这样的对sGC有调节作用的天然分子呢？正是由于体外研究证实 可溶性鸟苷环化酶上存在YC-1类分子的作用位点，这可以使我们联想到与治疗 心脑血管系统疾病相关的传统药物中可能存在天然的与YC-1， BAY有相同或相近 构效团的类似物等。他们可能是开启sGC—cGMP通路，治疗心脑血管系统疾病的 天然功能分子。在人们治疗心脑血管疾病对疾病形成的分子机理尚未有很好地了 解时，中外先人从多年的临床经验出发，也都不约而同的选择了部分植物来源的 组织作为治疗心脑血管疾病的首选良方。但是，植物药材的个体差异性及毒副作 用较大，部分植物药物的有效剂量是中毒剂量的60%，这就给该药材的有效使用 带来了极大的不便。因此，对其中以可溶性鸟苷环化为靶部位治疗血管栓塞药物 的主要成分的研究单组份化，可以避免地黄类药材的个体差异性及毒副作用。
本项目将在完善分离纯化可溶性鸟苷环化酶技术基础上，建立同位素标记法 测定具有激活可溶性鸟苷环化酶作用的物质筛选平台，从天然植物中筛选出激活 可溶性鸟苷环化酶的有效组分，利用计算机辅助优化技术，逐步细化筛选分离出
单体化合物，进行结构解析，并进行该分子与一氧化碳协同激活可溶性鸟苷环化 酶的酶学特征研究，为将来进一步开发研制成与一氧化碳协同激活可溶性鸟苷环
化酶治疗心脑血管疾病的药物奠定基础。

发明内容
在中国、印度以及欧洲的传统治疗心脑血管疾病的药剂中存在一些重复出现 的天然植物药物，这些组分中应该含有起主要治疗作用的成分。我们从上述植物 组织中发现解析特异性激活可溶性鸟苷环化酶(sGC/cGMP)通路的天然功能分子。
该激活剂的发现一方面证实了在正常食物或者传统药物中循环系统的可溶性鸟 苷酸环化酶的天然激活剂的存在；一方面为进一步研发有针对性的可溶性鸟苷酸
环化酶的激活剂提供有益的母核信息。
通过筛选获得可在离体实验条件下激活人循环系统中可溶性鸟苷酸环化酶 的天然组分，并针对该类组分及其在人体内的代谢组分进行了结构研究与进一步 活性分析。获得了可激活可溶性鸟苷酸环化酶的物质的母核结构及其侧链结构信 息[见如下结构式]:其特征在于为洋地黄毒甙和地高辛的共同甾醇结构。其中 Rl、 R2、 R3为甲基、氢或者羟基，R为五碳糖或者六碳糖不同长度的共价聚集体。 Rl、 R2、 R3和R基团的结构和性质与其物种来源及人体内的代谢进程有关，部 分影响该激活剂对可溶性鸟苷酸环化酶的激活能力。
具体实施例方式
(1) 利用我们已建立的方法进行牛肺可溶性鸟苷环化酶提纯、活力测定及纯 度鉴定(Li zhengqiang " Biochemistry (2005) 44:939)。
(2) 用提纯的可溶性鸟苷环化酶和3H-GTP测活技术平台，筛选出有激活作 用的植物药物中的有效组分。
(3) 对筛选出的植物药物进行按类别的组分分离，再行筛选，确定化合物 化学分类归属，并利用计算机辅助优化技术与利用组合化学方法体外化学合成的
如YC-1 、 BAY进行结构对比分析与模拟。
(4) 进行单一化合物的分离，筛选。
(5 )激活剂(化合物)与一氧化碳协同激活可溶性鸟苷环化酶的研究，Km， Vm测定。
权利要求
1、可溶性鸟苷酸环化酶的天然激活剂，其特征在于该激活剂是源于植物药物的，可通过与可溶性鸟苷酸环化酶相互作用，进而提高可溶性鸟苷酸环化酶催化的从GTP到cGMP转化的反应速率的天然产物及其在人体内有限代谢产物。
2、 如权利要求1所述的可溶性鸟苷酸环化酶的天然激活剂，其特征在于上述催化活性中心的物种来源是中国、印度及欧洲传统医学中使用的药用植 物、及人体内有限代谢产物，或根据本激活剂分子母核结构人工合成及半 合成方法构建的模拟物。
3、 如权利要求1所述的可溶性鸟苷酸环化酶的天然激活剂，其特征在于酶 是体内的循环系统内的天然可溶性鸟苷酸环化酶，不包括生殖系统及中枢 神经系统中的天然鸟苷酸环化酶，也不包括来自于其它物种的天然酶、突 变酶、改造酶或人工模拟酶类。
4、 如权利要求2所述的可溶性鸟苷酸环化酶的天然激活剂，其特征在于为 洋地黄毒甙和地高辛的共同甾醇结构，其结构式如下，<formula>formula see original document page 2</formula>其中Rb R2、 R3为甲基、氢或者羟基，R为五碳糖或者六碳糖不同长度的 共价聚集体；R"i、 R2、 R3和R基团的结构和性质与其物种来源及人体内的 代谢进程有关，部分影响该激活剂对可溶性鸟苷酸环化酶的激活能力。
全文摘要
本发明是通过以人循环系统中的可溶性鸟苷酸环化酶作为筛选靶标，利用³H同位素标记的办法，从中国、印度以及欧洲传统医学中治疗心血管相关疾病的植物药物中筛选可激活上述可溶性鸟苷酸环化酶的天然组分。通过筛选获得可在离体实验条件下激活人循环系统中可溶性鸟苷酸环化酶的天然组分，并针对该类组分及其在人体内的代谢组分进行了结构研究与进一步活性分析。获得了可激活可溶性鸟苷酸环化酶的物质的母核结构及其侧链结构信息，为可溶性鸟苷酸环化酶——cGMP信号传导通路相关的心血管疾病治疗相关的药物研发提供针对性的信息。
文档编号A61K31/585GK101670106SQ200910067568
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月22日 优先权日2009年9月22日
发明者明 吕, 张华利, 张跃斌, 李正强, 程瑛琨 申请人:吉林大学