姜黄素与银杏内酯b配伍组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】姜黄素与银杏内酯B配伍的组合物及其应用，属于医药领域，姜黄素与银杏内酯B配伍的组合物由下列重量比的药物均匀混合制成：姜黄素1-8份，银杏内酯B1份。该药物组合物治疗多囊肾病具有协同作用，优于单一用药。
【专利说明】姜黄素与银杏内酯B配伍组合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及姜黄素与银杏内酯B配伍的药物组合物的制备及应用。
【背景技术】 [0002]多囊肾病是一种常见的单基因遗传性疾病，分为常染色体显性多囊肾病(ADPKD)与常染色体隐性多囊肾病(ARPKD)，发病率分别为1/1000 - 1/400和1/40000-1/10000 (Jin He, Jianhua Ye, Qiuyan Li, et al.Construction of atransgenic pig model overexpressing polycystic kidney disease 2 (PKD2) gene.Transgenic Res, 2013, DO1: 10.1007/sll248-012-9686_z.)。其中 ADPKD 发病率高、危害大，以双肾出现多发性进行性大小不一的囊泡为主要特征，还引起肝囊肿、胰腺囊肿、心瓣膜病等肾外病变，常在成人期导致肾功能衰竭甚至死亡，目前除肾移植和透析外，尚无特效药物，给患者、家庭和社会带来巨大的经济负担。
[0003]多囊肾病的发病机制主要包括:囊泡上皮细胞的过度增殖与囊液的分泌两方面。囊泡上皮细胞的过度增殖主要涉及EGFR的过度表达与异常定位(Aguiari G, CatizoneL, Del Senno L.Multidrug therapy for polycystic kidney disease: a review andperspective.Am J Nephrol, 2013, 37(2): 175-182.)，以及下游的 Ras-MAPK 信号通路(Xu T, Wang NS, Fu LL, et al.Celecoxib inhibits growth of human autosomaldominant polycystic kidney cyst-lining epithelial cells through the VEGF/Raf/MAPK/ERK signaling pathway.Mol Biol Rep, 2012， 39(7): 7743-7753.)和m-T0R 信号通路(Jardine MJ, Liyanage T, Buxton E, et al.mTOR inhibition inautosomal-dominant polycystic kidney disease (ADPKD): the question remainsopen.Nephrol Dial Transplant, 2013, 28(2): 242-244.)，此外，cAMP信号通路、Wnt 信号通路和JAK-STAT信号通路等也参与了囊泡上皮细胞过度增殖这一病理过程。囊液的分泌主要涉及囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR) (Yang B, Sonawane ND, Zhao D, et al.Smal1-molecule CFTR inhibitors slow cyst growth in polycystic kidney disease.JAm Soc Nephrol, 2008，19:1300-1310.)、水通道(Aquaporin, AQP)(高晋生，李囿松.姜黄素体外调控AQP2表达抑制MDCK囊泡生成的实验研究.山西中医.2012，28(8):47-48，53.)、Na+-K+-ATP酶(许书添，姚小丹.多囊肾病发病机制和治疗.肾脏病与透析肾移植杂志.2010，19(4): 367-372.)等。这两个病理过程由基因突变引起，ADPKD致病基因为PKDl和PKD2。如图2所示，PKDl与PKD2基因编码的蛋白分别称为多囊蛋白I (polycystin-1, PCI)和多囊蛋白 2 (polycystin-2, PC2)。PCl 是上皮细胞膜受体,PC2具有钙离子通道的作用，两者相互作用，可以维持肾上皮细胞内Ca2+的正常浓度。当PKDl或PKD2基因发生突变时，细胞内Ca2+浓度降低，cAMP水平增高，后者通过影响细胞内相关信号传导通路，引起囊泡细胞的过度增殖和囊液的分泌，促进囊泡的形成与生长(高晋生，杨宝学.常染色体显性遗传多囊肾病的治疗研究进展.中国药理学通报2009，25(2):141-144.)。[0004]姜黄素(curcumin, Cur)是从天然植物姜黄等的根莖中提取的一种多酹类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁、抗血管生成等多种药理作用。银杏内酯(ginkgolides)是从银杏中提取得到的一种萜类内酯类化合物，包括银杏内酯A、B、C、J、K、L和M，银杏内酯是血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)抑制剂，其中，银杏内酯B(ginkgolideB, GB)是银杏内酯中药理活性最强的一种。研究表明，银杏内酯B具有抗炎、抗氧化、抗过敏、神经保护等作用(Xia SH, Fang DC.Pharmacological action andmechanisms of ginkgolide B.Chin Med J, 2007, 120 (10): 922-928.)。
[0005]我们研究发现了姜黄素(JinshengGao, Hong Zhou, Tianluo Lei, et al.Curcumin inhibits renal cyst formation and enlargement in vitro by regulatingintracellular signaling pathways.European Journal of Pharmacology, 2011,654(1): 92-99.)、银杏内酯B (Hong Zhou, Jinsheng Gao, Li Zhou, et al.GinkgolideB inhibits renal cyst development in in vitro and in vivo cyst models.AJP RenalPhysiology, 2012，302(10): F1234-1242.)的抗囊泡生成作用，并发现两者均可通过调控Ras/MAPK信号通路抑制体外囊泡上皮细胞的过度增殖。其中B_raf与Raf-1是这条信号通路的关键调控点，Ras/B-raf/MEK/ERK信号通路的激活促进了囊泡上皮细胞的过度增殖，而Ras/Raf-1/MEK/ERK信号通路的激活使囊泡上皮细胞的增殖恢复正常。多囊肾病发病过程中，B-raf过表达，而Raf-1被抑制，我们研究发现二者可下调B_raf表达，上调Raf-1表达，从而使囊泡细胞增殖恢复正常。
[0006]尽管姜黄素、银杏内酯B均具有抑制囊泡生长的作用，但单用二者效果并不令人满意，目前，姜黄素与银杏内酯B配伍治疗多囊肾病是否具有协同作用，即实现1+1>2的作用国内外尚未见报道。应用MDCK囊泡模型，我们发现姜黄素、银杏内酯B单独用药均抑制囊泡的形成，二者作用后囊泡形态明显不同，姜黄素作用后的囊泡呈厚壁小囊泡或圆形的细胞集落，银杏内酯B作用后的囊泡呈薄壁小囊泡或不规则细胞集落，提示二者作用机制存在不同。应用PKDl基因敲除小鼠，我们发现姜黄素、银杏内酯B单独用药均抑制肾囊泡的生长，二者作用后小鼠精神状态`不同，姜黄素作用后小鼠精神状态良好，银杏内酯精神状态较差，提示姜黄素可能同时具有抗抑郁作用。因此我们通过姜黄素配伍银杏内酯B进行体内外的囊泡抑制研究，发现两者配伍重量之比在1:1-8:1时具有协同作用，作用后MDCK囊泡多呈小的圆形的细胞集落(MDCK囊泡抑制率高达90.46%)，小鼠肾囊泡减少变小(小鼠肾囊泡抑制率高达87.93%)，精神状态良好，生存时间明显延长(小鼠生存期延长率61.40%)。
【发明内容】
[0007]本发明涉提供治疗效果更好的一种姜黄素与银杏内酯B配伍的药物组合物。
[0008]姜黄素与银杏内酯B配伍的药物组合物，姜黄素与银杏内酯B重量份之比为I~8:1。
[0009]姜黄素与银杏内酯B配伍的药物组合物用于治疗多囊肾病。
[0010]姜黄素与银杏内酯B配伍的药物组合物可直接药用，或添加合适的辅料制成片齐?、胶囊、□服液、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、注射剂、栓剂、贴剂、滴剂、喷雾剂、霜剂、混悬剂、酊剂、乳剂、滴丸或粉剂进行使用。
[0011]本发明所述姜黄素与银杏内酯B配伍药物组合物的成人(60kg)用量为:每日姜黄素为528~4224mg (注射)，银杏内酯B为264~528mg (注射)，姜黄素与银杏内酯B配伍重量之比在1:1~8:1，分早晚两次用药。
[0012]本发明通过姜黄素配伍银杏内酯B进行体内外的囊泡抑制研究，发现两者具有协同作用，MDCK囊泡抑制率高达90.46% (单用姜黄素、银杏内酯B分别仅为63.82%,66.73%)；小鼠肾囊泡抑制率高达87.93% (而单用姜黄素、银杏内酯B分别仅为41.22%,46.43%);小鼠生存期延长率61.40% (而单用姜黄素、银杏内酯B分别仅为20.18%,7.02%)。【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为姜黄素的化学结构式。
[0014]图2为银杏内酯B的化学结构式。
[0015]图3为MDCK囊泡与细胞集落。
[0016]图4为姜黄素联合银杏内酯B对MDCK囊泡形成的抑制作用表。
[0017]图5为MTT检测姜黄素对MDCK细胞的细胞毒性图。
[0018]图6为MTT检测银杏内酯B对MDCK细胞的细胞毒性图。
[0019]图7为姜黄素联合银杏内酯B对PKDl基因敲除小鼠肾囊泡生长的抑制作用表。
[0020]图8为姜黄素联合银杏内酯B对PKDl基因敲除小鼠生存期的影响图。
[0021]图9为姜黄素对MDCK细胞信号转导通路的作用图。
[0022]图10为银杏内酯B对MDCK细胞信号转导通路的作用图。
【具体实施方式】
[0023]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0024]实施例1:姜黄素联合银杏内酯B对MDCK囊泡形成的抑制作用
犬肾细胞(MDCK)在三维基质胶中培养时受cAMP刺激形成囊泡，并可持续生长。forskolin是腺苷酸环化酶的激活剂,腺苷酸环化酶可介导cAMP的生成，因此forskolin可促进MDCK囊泡形成和生长，其囊泡特性与多囊肾囊泡的特性相似，是筛选评价化合物治疗多囊肾药理活性的最佳体外模型。
[0025]将MDCK细胞(北京大学医学部药理系赠送)分别培养于含不同药物的三维基质胶24孔板中，其中含有IOmM forskolin (FSK，佛司可林，购自美国Sigma公司)和姜黄素(购自美国Sigma公司，商品目录号C1386，浓度分别为0mM、0.4mM、2mM、IOmM)联合银杏内酯B(购自Sigma公司，商品目录号G6910,浓度分别为0.125mM、0.5mM、2mM)的不同配伍方案,每孔大约400个细胞，每组设3个平行孔。培养4-5天后，在含有IOmM forskolin的培养孔中形成MDCK细胞的囊泡。培养第6天时，计数圆形囊泡(直径大于50mm)和非囊泡细胞的集落，计算囊泡占总细胞集落(囊泡和非囊泡集落)的百分率。实验设三次重复，囊泡占总细胞集落的百分率为39.82 ±0.75%。囊泡与非囊泡细胞的形态如图3所示。姜黄素联合银杏内酯B对MDCK囊泡形成的抑制作用如图4所示。从图4、图5中可以看出，姜黄素、银杏内酯B作用后囊泡形态明显不同，姜黄素作用后的囊泡大多呈厚壁小囊泡，银杏内酯B作用后的囊泡大多呈薄壁小囊泡，姜黄素配伍银杏内酯B作用后MDCK囊泡大多呈小的圆形的细胞集落，提示二者作用机制存在不同。从图5中可以看出，中低剂量姜黄素联合银杏内酯B对MDCK囊泡形成抑制具有协同作用。
[0026]姜黄素联合银杏内酯对MDCK囊泡抑制作用，通过金氏公式判断，即Q=EA+B/(EA+EB—EAXEB)，其中 EA+B为姜黄素联合银杏内酯B的抑制率，EA、EB分别为姜黄素、银杏内酯B的抑制率，Q为0.85~1.15之间为单纯相加( + )，Q为1.15~20之间为增强(++)，Q大于20为显著增强(+++)，Q为0.85~0.55之间为拮抗(一)，Q小于0.55为明显拮抗( )。
[0027]实施例2:通过MTT法确定姜黄素、银杏内酯B的细胞毒性
将对数期的MDCK细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔含有4X IO3个细胞，每孔给予200 μ L MDCK细胞培养液(由DMEM培养基(购自美国sigma公司)和F12培养基(购自美国Invitrogen公司)等体积混合而成)，置于37°C的5% CO2培养箱中培养24小时。然后在细胞培养板中加入终浓度分别为1 X10-4、1X 10_5M、1 X 10_6M、1 X1O-7M的姜黄素和银杏内酯B各20 μ L，继续培养24小时。除去上清，加入200 μ L MDCK细胞培养液和20 μ L浓度为5mg/ml的MTT溶液，继续培养3小时。除去上清，每孔加入150 μ L 二甲基亚砜，置摇床上100转/分振荡lOmin，使结晶物充分溶解。酶标仪检测各孔OD值(检测波长为492nm)，设置调零孔(培养基、MTT和二甲基亚砜)和对照孔(细胞、相同浓度的姜黄素的溶解介质、培养基、MTT和二甲基亚砜)，每组设定5个复孔。按照下述公式计算抑制率:抑制率=[(对照孔-调零孔)_(给药孔-调零孔)]/(对照孔-调零孔)χ100%。实验设三次重复，加入姜黄素、银杏内酯B后细胞的MTT结果如图5、图6所示。其中，control表示用不含姜黄素、银杏内酯B的培养液培养。结果表明，1X10_5 M以下浓度的姜黄素、1X 10_4 M以下浓度的银杏内酯B对MDCK细胞均无细胞毒性作用。
[0028]实施例3:通过PKDl基因敲除小鼠评价姜黄素联合银杏内酯B对小鼠肾囊泡生长的抑制作用
本课题组将应用多囊肾病PKDl肾脏组织特异性敲除小鼠模型进行研究，普通PKDl基因敲除小鼠具有肾脏、胰腺、血管发育异常，在胚胎期/新生期死亡，而PKDl肾脏组织特异性敲除小鼠可保持其他组织器官正常，只在肾脏发生囊泡，囊泡迅速生长(图7)，在两周内导致肾功能衰竭，死于20天龄。该模型小鼠将用于研究姜黄素联合银杏内酯B是否抑制多囊肾病小鼠肾囊泡的形成和生长，同窝杂合子小鼠表现为野生型表型，将被用作正常对照。野生型小鼠、多囊肾病小鼠分别分为生理盐水组、姜黄素组(分别为80、160、320mg/kg)、银杏内酯B组(分别为20、40、80mg/kg)、姜黄素联合银杏内酯B组，每组至少3只小鼠以上保证结果统计学分析的可靠性。腹部皮下注射给药，每天2次。每次给药前观察小鼠的一般状态。7天龄时每组处死小鼠，取肾组织，检查肾脏组织学特征。通过测定肾内囊泡面积大小观察肾囊泡的生长率，通过记录小鼠寿命观察生存期，从而评价姜黄素联合银杏内酯B治疗多囊肾病PKDl基因敲除小鼠的药理学作用。获得最佳配伍方案:160mg/kg姜黄素联合80mg/kg银杏内酯B，进一步研究其对多囊肾病小鼠生存期的影响，当小鼠表现为衰竭垂死状态时处死，统计生存期(如图8所示，*P〈0.05，***P〈0.001)，计算生存期延长率=(给药组生存期-空白组生存期)/空白组生存期X 100%。
[0029]囊泡发展程度的定量分析:囊泡的发展程度以肾脏指数，肾囊泡大小作为评价指标。肾囊泡大小测定:在光学显微镜下观察系列肾脏组织切片(0.1 mm间隔)，应用Image-Pro Plus 6.0测量囊泡总面积、肾脏面积,计算囊泡大小抑制率=(生理盐水组囊泡面积一给药囊泡面积)/生理盐水组囊泡面积X 100%。结果如图1所示。
姜黄素联合银杏内酯对小鼠肾囊泡抑制作用，通过金氏公式判断，即Q=EA+B/(EA+EB —EAXEB)，其中EA+B为姜黄素联合银杏内酯B的抑制率，EA、EB分别为姜黄素、银杏内酯B的抑制率，Q为0.85~1.15之间为单纯相加( + )，Q为1.15~20之间为增强(++)，Q大于20为显著增强(+++)，Q为0.85-0.55之间为拮抗(一)，Q小于0.55为明显拮抗(一一)。
[0030]实施例4:姜黄素、银杏内酯B的作用靶点和机制
利用Western印迹技术，检测姜黄素对囊泡上皮细胞信号转导通路的影响。具体实验过程如下:
将MDCK细胞培养至70%的细胞密度，换无血清培养液培养24小时，然后加入含IOMforskolin的培养液，同时分别给予姜黄素、银杏内酯B,以不含有forskolin的培养液培养的MDCK细胞作为control组，上述各组细胞均刺激60min。
[0031]提取上述各组细胞的总蛋白，用BCA法作蛋白定量。SDS-PAGE电泳、转膜，加相应一抗和二抗。化学发光，显影、定影。结果如图9、图10所示:
随着forskolin刺激MDCK细胞不同时间，通过Western检测ρ-ERK的水平，发现p_ERK水平在60min左右时达到高峰。因此选择forskolin作用MDCK细胞60min时的蛋白进行一系列 Western 检测，结果发现:在 forskolin 作用下，H-Ras、B_raf、p-MEK、p_ERK、Egr-1、c-fos、p-CREB表达增加，Raf-U NAB2表达减少；姜黄素可以下调细胞内H_Ras、B-raf,p-MEK, p-ERK, Egr-1, c-fos的表达，同时上调Raf_l、NAB2的表达；而银杏内酯B可以下调细胞内H-Ras、B-raf、p-MEK、p-ERK、p-CREB的表达，上调Raf-1的表达；提示两者作用机制存在一定差异，两者联合可能具有协同作用。
【权利要求】
1.姜黄素与银杏内酯B配伍的组合物，其特征在于重量份配比为姜黄素I~8份，银杏内酯B 1份。
2.根据权利要求1所述的姜黄素与银杏内酯B配伍的组合物，其特征是它的用途是治疗多囊肾病。
3.根据权利要求1所述姜黄素与银杏内酯B配伍的组合物，其特征是组合物均匀混合制成片剂、胶囊、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、注射剂、栓剂、贴剂、滴剂、喷雾剂、霜剂、混悬剂、酊剂、乳剂、滴丸或粉剂进行使用。
【文档编号】A61P13/12GK103599098SQ201310568288
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】高晋生, 李囿松, 杨宝学, 王晞星, 郑建忠, 李廷荃, 刘光珍, 郝旭亮, 刘丽坤, 李宜放 申请人:山西省中医药研究院