一种从蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，该方法包括以下步骤：(1)将蚕沙用酸性水或酸性稀乙醇溶剂提取，提取液过滤，浓缩；(2)取阳离子交换树脂，将步骤(1)中得到的浓缩液上样，用酸性水和水洗脱，收集酸性水和水洗脱液，浓缩，再用稀氨水溶液洗脱，收集稀氨水洗脱液；(3)将步骤(2)得到的酸性水和水洗脱浓缩液，通过聚酰胺层析柱纯化，上样，分别用水、乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，洗脱液浓缩干燥，得黄酮提取物。(4)将步骤(2)所得的稀氨水洗脱液，浓缩至pH中性，通过氧化铝层析柱纯化，上样，并用乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥，得亚氨基糖提取物。该方法制得的亚氨基糖及黄酮提取物含量高，且工艺简单，成本低。
【专利说明】一种从蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明具体涉及一种从蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法。
【背景技术】
[0002]蚕沙为家蚕(Bombyx mori L.)幼虫蚕食桑叶后排泄出来的粪便。据测定，风干蚕沙中除含有9.9%的水份，还含有90.1%的干物质(含粗蛋白13.6%，粗脂肪3.7%，无氮浸出物48.7%，粗纤维12.5%，灰分12.6% )。蚕沙中含有18种氨基酸，其含量达到4.4%。
[0003]蚕沙中含有多种亚氨基糖类物质，如1-脱氧野尻霉素、fagomine、3-ep1-fagomine，其中以1_脱氧野尻霉素含量最高，这类物质具有降血糖、抗病毒等作用。中国发明专利申请号为200910167602.5中公开了一种从蚕沙等中药中分离高纯度1_脱氧野尻霉素的方法，该方法需要将样品通过阴离子交换树脂纯化后再经过阳离子交换树脂进行纯化，然后经过有机溶剂萃取、重结晶、凝胶柱层析纯化得到高纯度1-脱氧野尻霉素，该方法较繁琐，而且所用萃取的有机溶剂氯仿毒性较大，且为易制毒试剂，不适合放大生产，且对环境会产生潜在污染。
[0004]蚕沙中还含有多种黄酮类成分，具有很强的生理活性。中国发明专利申请号为200910167602.5中公开了一种从蚕沙中制备粗黄酮的方法，采用阴离子交换树树脂对黄酮进行纯化，但没有说明所制备的粗黄酮的含量。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是解决现有工艺中存在的缺陷，提供一种操作更为安全简便、低成本，同时制备高含量亚氨基糖及黄酮提取物的方法。
[0006]为了达到上述目的，本发明提供了一种从蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，该方法包括以下步骤:
[0007](1)用酸性水或酸性稀乙醇溶剂提取蚕沙，提取液过滤，浓缩；溶剂用量为蚕沙药材量的5-10倍；
[0008](2)取阳离子树脂，将步骤(1)中得到的提取浓缩液上样，用酸性水和水洗脱，收集酸性水洗脱液和水洗脱液，浓缩，得到酸性水和水洗脱合并浓缩液。再用稀氨水溶液洗脱，收集稀氨水洗脱液；
[0009](3)取聚酰胺，将步骤(2)得到的酸性水和水洗脱合并浓缩液通过聚酰胺柱层析纯化，上样，分别用水、乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩干燥，得黄酮提取物；
[0010](4)取氧化铝，将步骤(2)所得的稀氨水洗脱液，浓缩至pH中性，通过氧化铝层析柱纯化，上样，并用乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥，得亚氨基糖提取物。
[0011]其中，步骤(1)中提取方法为:每1千克蚕沙加入5-10L水或10-30%的乙醇，加盐酸或硫酸调节pHl-4，80-100°C加热提取2-4个小时，合并提取液，提取液过滤，浓缩。最佳提取方法为:每千克蚕沙加入8L的水溶液加盐酸调节pH至1，80°C加热提取2个小时，提取2次，过滤，合并提取液，浓缩。[0012]步骤⑵取阳离子交换树脂，树脂与蚕沙的重量比为1:1-1: 2，将步骤⑴中得到的提取浓缩液上样，先采用pH范围为1-3盐酸或硫酸水溶液洗脱，至洗脱液色浅，再以水洗脱至pH中性，合并酸性水洗脱液和水洗脱液，浓缩，得到酸性水和水洗脱合并浓缩液。以0.1-0.3mol.L 1氨水洗脱液洗脱，弃去洗脱液，再以0.4-1.0mol.L 1氨水洗脱，收集0.4-1.0mol.L-1氨水洗脱液。
[0013]最佳条件为:取与蚕沙的重量比为1: 1的001X7树脂，将步骤(1)中得到的提取液上样，先采用PH2盐酸水溶液洗脱，至洗脱液色浅，再以水洗脱至pH中性，合并酸性水洗脱液和水洗脱液，浓缩，得到酸性水和水洗脱合并浓缩液。以0.3mol.L—1氨水洗脱液洗脱，弃去洗脱液，再以0.4mol.I71氨水洗脱,收集0.4mol.I71氨水洗脱液。
[0014]步骤(3)取与步骤⑴中蚕沙的重量比为1:1-1:2的聚酰胺，将步骤(2)得到的酸性水和水洗脱合并浓缩液上样，分别用水、10 % -90 %乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩干燥，得黄酮提取物。
[0015]最佳条件为:取与步骤⑴中蚕沙的重量比为1: 1的聚酰胺，将步骤(2)得到的酸性水和水洗脱合并浓缩液上样，分别用水、30%乙醇和70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，70%乙醇洗脱液浓缩干燥，得黄酮提取物。
[0016]步骤⑷取与步骤(1)中蚕沙的重量比为1: 0.5-1: 2的氧化铝，将步骤(2)所得的氨水洗脱液浓缩至pH中性，上样，并用10% -90%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，洗脱液浓缩干燥得亚氨基糖提取物。
[0017]最佳条件为:取与步骤⑴中蚕沙的重量比为1: 1的碱性氧化铝或中性氧化铝，将步骤(2)所得的0.4mol.L-1氨水洗脱液浓缩至pH中性，上样，并用50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩干燥，得亚氨基糖提取物。
[0018]本发明具有以下优点:
[0019](1)蚕沙中亚氨基糖类成分极性较大且由于含亚氨基显碱性，所以本发明使用盐酸或硫酸调节pH至酸性的水或低极性乙醇作为提取溶剂，可以提高亚氨基糖类成分的提取率。由于蚕沙提取液中除亚氨基糖类成分外还含有可溶性糖、黄酮类和氨基酸类等大极性成分，本发明采用阳离子交换树脂对亚氨基糖类成分进行初步纯化。文献有采用阳离子交换树脂纯化蚕沙中亚氨基糖类成分的报道，但洗脱方法一般是采用上样后直接以水洗脱再以氨水洗脱。本发明采用PH1-4的盐酸水或者硫酸水溶液对非亚氨基糖类成分进行洗脱，可以去除可溶性糖和黄酮类等大极性杂质。除此之外由于蚕沙提取液中的酸性氨基酸类成分与阳离子交换树脂的结合能力较碱性的亚氨基糖类弱，酸性水溶液与水相比对这类氨基酸成分洗脱能力更强，所以可以更好的去除这些成分。本发明还在氨水洗脱过程中采用氨水浓度由稀到浓梯度洗脱，先采用0.1-0.3mol.L-1氨水洗脱，去除部分包括碱性氨基酸类在内的碱性杂质，再用0.4-0.5mol.L-1氨水洗脱，亚氨基糖类成分可以被洗脱下来。本发明在使用阳离子交换树脂对亚氨基糖类成分初步纯化基础上，再使用氧化铝对亚氨基糖类成分进行精制，因为亚氨基糖类成分显碱性，所以氧化铝对这类成分结合能力较弱，采用乙醇洗脱可以使亚氨基糖类成分被洗脱下来，而其余包括氨基酸类在内的酸性杂质，由于和氧化铝结合能力较强，不能被洗脱。通过氧化铝吸附使亚氨基糖类成分得到进一步精制，最终得到的亚氨基糖类提取物中1-脱氧野尻霉素含量可达到24%，而亚氨基糖类成分总含量可以达到50%以上。且操作相对简便，使用的有机溶剂相对价格低廉，且对环境污染较小，适合大生产操作。
[0020](2)在阳离子交换树脂对亚氨基糖类成分纯化过程中酸性水和水洗脱可以将蚕沙提取液中的黄酮类成分洗脱下来，本发明采用聚酰胺对其进行精制，聚酰胺中的酰胺羰基可以与提取液中的黄酮类成分特异性结合而被吸附，通过水洗和30%乙醇洗脱可以去除大量非黄酮类大极性杂质，黄酮类成分被70%乙醇洗脱下来，得到的总黄酮含量达到50%以上。本发明通过阳离子交换树脂和聚酰胺柱层析相结合的方法，得到的黄酮提取物含量较高，操作简便，适合大生产。
【具体实施方式】
[0021]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。[0022]各实施例中使用的仪器设备以及检查方法如下:
[0023]仪器设备:Mettler EL204电子天平；Dionex-Ultimate3000高效液相色谱仪，Alltech3300ELSD检测器；TU-1810型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；
[0024]1-脱氧野尻霉素高效液相色谱法含量测定:
[0025]色谱条件色谱柱为Inerstil NH2 (4.6mmX 250mm, 5 μ m);流动相为乙腈-水(80: 20);流速 1.0mL.mirT1 ;柱温 35。。；
[0026]ELSD检测器参数漂移管温度:50°C ;载气流速:1.5L.mirT1。
[0027]总黄酮含量的测定:
[0028]标准品溶液的配制和标准曲线的建立
[0029]精密称取芦丁对照品，用70%乙醇溶解配制成浓度为0.2mg.L-1的芦丁对照品溶液。精密吸取芦丁对照品溶液0.0,0.5，1.0,2.0,3.0,4.0mL,分别加入0.3mL5% NaN02溶液，摇匀，6min后加入0.3mll0% A1 (N03)3溶液，摇匀，静置6min，各加入4.0ml4% NaOH溶液，并用70%乙醇将反应溶液体积补足到10ml，放置10-15min，于510nm处测定吸光值。以吸光值(X)和芦丁含量(y)绘制总黄酮含量标准曲线:y=0.8647x,r2=0.9991 (n=3)，线性范围为 0-0.8mg。
[0030]样品中总黄酮含量的测定
[0031]精密移取待测样品液于10mL的容量瓶中，别加入0.3mL5% NaN02溶液，摇匀，6min后加入0.3mL10 % A1 (N03) 3溶液，摇匀，静置6min，各加入4.0mL4% NaOH溶液，并用70 %乙醇将反应溶液体积补足到10mL，放置10-15min，于510nm处测定吸光值。代入标准曲线，计
算总黄酮含量。
[0032]总亚氨基糖含量测定方法:
[0033]精密移取待测样品溶液至具塞试管中，加入3.0mL2%雷氏铵盐溶液，混匀，冰水浴反应1.5h，反应液以lOOOOr.mirT1离心lOmin，沉淀以冰水洗涤至无色。加入丙酮溶解转移至5mL容量瓶中，以丙酮定容至刻度，于523nm处测定吸光度。
[0034]含量计算公式:W=AXMXV/ ε，其中Α为吸光度；ε为硫氰酸铬铵在丙酮中的摩尔吸收系数，其值为106.5…是被测物质的分子量，以1-脱氧野尻霉素的分子量计即163 ；V是丙酮的体积，单位为mL ；ff是被测物总亚氨基糖的质量，单位为mg。
[0035]产品实施例1
[0036]取蚕沙1.0kg，加入5L30%乙醇，加盐酸调节pH至4，90°C提取2个小时，提取液滤过，浓缩。[0037]取1.0kg的001X14.5阳离子交换树脂，将蚕沙提取浓缩液上样，先采用pH4盐酸水溶液洗脱，至洗脱液色浅，再以水洗脱至pH中性，合并酸性水洗脱液和水洗脱液，浓缩，得到酸性水和水洗脱合并浓缩液。以0.lmol.L—1氨水洗脱液洗脱，弃去洗脱液，再以
1.0mol.L—1氨水洗脱，收集1.0mol.L—1氨水洗脱液。
[0038]取2.0kg聚酰胺，将阳离子树脂酸性水和水洗脱合并浓缩液上样，分别用水、10%乙醇和90%乙醇洗脱，收集90%乙醇洗脱液，90%乙醇洗脱液浓缩干燥，得黄酮提取物
14.lg。经含量测定，测得提取物总黄酮含量为48.4%
[0039]取1.0kg酸性氧化铝，将1.0mol.L-1氨水洗脱液浓缩至pH中性，上样，并用90%乙醇洗脱，收集90%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩干燥，得亚氨基糖提取物1.6g。经含量测定，提取物1-脱氧野尻霉素含量为13.8%，总亚氨基糖含量以1-脱氧野尻霉素计为43.1%。
[0040]产品实施例2:
[0041]取蚕沙1.0kg，加入10L10%乙醇，加硫酸调节pH至1，80°C提取4个小时，提取液过滤，浓缩。
[0042]取2.0kg的D001阳离子交换树脂，将蚕沙提取浓缩液上样，先采用pHl硫酸水溶液洗脱，至洗脱液色浅，再以水洗脱至pH中性，合并酸性水洗脱液和水洗脱液，浓缩，得到酸性水和水洗脱合并浓缩液。以0.3mol.Ι^氨水洗脱液洗脱，弃去洗脱液，再以0.5mol -L-1氨水洗脱，收集0.5mol.L—1氨水洗脱液。
[0043]取2.0kg聚酰胺，将阳离子树脂酸性水和水洗脱合并浓缩液上样，分别用水、30%乙醇和70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，70%乙醇洗脱液浓缩干燥，得黄酮提取物9.lg。经含量测定，测得提取物总黄酮含量为56.7%
[0044]取1.0kg酸性氧化铝，将0.5mol.L-1氨水洗脱液浓缩至pH中性，上样，并用10%乙醇洗脱，收集10%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩干燥，得亚氨基糖提取物2.9g。经含量测定，提取物1-脱氧野尻霉素含量为17.8%，总亚氨基糖含量以1-脱氧野尻霉素计为48.9%。
[0045]产品实施例3:
[0046]取蚕沙1.0kg,加入10L水，加盐酸调节pH至2，100°C提取2个小时，提取液过滤，再加8L水，加盐酸调节pH至2，100°C提取2个小时，提取液过滤，合并两次提取液，浓缩。
[0047]取1.0kg的D001阳离子交换树脂，将蚕沙提取浓缩液上样，先采用pH2盐酸水溶液洗脱，至洗脱液色浅，再以水洗脱至pH中性，合并酸性水洗脱液和水洗脱液，浓缩，得到酸性水和水洗脱合并浓缩液。以0.2mol.Ι^氨水洗脱液洗脱，弃去洗脱液，再以0.4mol -L-1氨水洗脱，收集0.4mol.I71氨水洗脱液。
[0048]取1.0kg聚酰胺，将阳离子树脂酸性水和水洗脱合并浓缩液上样，分别用水、30%乙醇和70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，70%乙醇洗脱液浓缩干燥，得黄酮提取物9.8g。经含量测定，测得提取物总黄酮含量为57.1%
[0049]取0.5kg中性氧化铝，将0.4mol.L-1氨水洗脱液浓缩至pH中性，上样，并用50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩干燥，得亚氨基糖提取物2.0g。经含量测定，提取物1-脱氧野尻霉素含量为22.4%，总亚氨基糖含量以1-脱氧野尻霉素计为53.8%。
[0050]产品实施例4:
[0051]取蚕沙1.0kg,加入8L水，加盐酸调节pH至1，80°C提取2个小时，提取液过滤，再加8L水，加盐酸调节pH至1，80°C提取2个小时，提取液过滤，合并两次提取液，浓缩。
[0052]取1.0kg的001X7阳离子交换树脂，将蚕沙提取浓缩液上样，先采用pH2盐酸水溶液洗脱，至洗脱液色浅，再以水洗脱至pH中性，合并酸性水洗脱液和水洗脱液，浓缩，得到酸性水和水洗脱合并浓缩液。以0.3mol.Ι^氨水洗脱液洗脱，弃去洗脱液，再以
0.4mol.L-1氨水洗脱，收集0.4mol.L-1氨水洗脱液。
[0053]取1.0kg聚酰胺，将阳离子树脂酸性水和水洗脱合并浓缩液上样，分别用水、30%乙醇和70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，70%乙醇洗脱液浓缩干燥，得黄酮提取物
9.6g。经含量测定，测得提取物总黄酮含量为58.7%
[0054]取1.0kg碱性氧化铝，将0.4mol.L-1氨水洗脱液浓缩至pH中性，上样，并用50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩干燥，得亚氨基糖提取物1.9g。经含量测定，提取物1-脱氧野尻霉素含量为24.1%，总亚氨基糖含量以1-脱氧野尻霉素计为54.1 %。
【权利要求】
1.一种从蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:该方法包括以下步骤:(1)用酸性水或酸性稀乙醇溶剂提取蚕沙，提取液过滤，浓缩；溶剂用量为蚕沙药材量的5-10倍；(2)取阳离子交换树脂，将步骤(1)中得到的浓缩液上样，用酸性水和水洗脱，收集酸性水和水洗脱液，洗脱液合并，浓缩，得到酸性水和水洗脱合并浓缩液。再用稀氨水溶液洗脱，收集稀氨水洗脱液；(3)将步骤(2)得到的酸性水和水洗脱浓缩液，通过聚酰胺层析柱纯化，上样，分别用水、乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩干燥，得黄酮提取物；(4)将步骤(2)所得的稀氨水洗脱液，浓缩至pH中性，通过氧化铝层析柱纯化，上样，并用乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥，得亚氨基糖提取物。
2.根据权利要求1所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤⑴所述酸性水或稀乙醇pH范围为1-4。
3.根据权利要求1所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤(1)中稀乙醇包括10-50%乙醇。
4.根据权利要求1所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤(2)所述的阳离子交换树脂为强酸型阳离子交换树脂，阳离子交换树脂脂型号可以为 D00U001X7,001X14.5。
5.根据权利要求1所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤⑵所述酸性水溶液pH范围为1-6。
6.根据权利要求1所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤⑵中稀氨水浓度为0.lmol.L_1-l.0mol.L'
7.根据权利要求1所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤(3)中乙醇浓度为10-90%。
8.根据权利要求1所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤(4)中氧化铝可以为碱性氧化铝、中性氧化铝或酸性氧化铝。
9.根据权利要求1所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤(4)中乙醇浓度为10-90%。
10.根据权利要求1至9任一所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤(1)中提取方法为每千克蚕沙加入5-10L pHl-4的盐酸或硫酸水溶液或PH1-4的10-30%的盐酸或硫酸乙醇溶液，80-100°C加热提取2_4个小时，合并提取液，提取液过滤，浓缩。
11.根据权利要求1至9任一所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤(2)中阳离子交换树脂与步骤(1)中蚕沙的重量比为1:1-1: 2，将步骤(1)中得到的提取浓缩液上样，先采用pH范围为1-3盐酸或硫酸水溶液洗脱，至洗脱液色浅，再以水洗脱至pH中性，合并酸性水和水洗脱液，浓缩，得到酸性水和水洗脱合并浓缩液。以0.1-0.3mol.L -1氨水洗脱液洗脱，弃去洗脱液，再以0.4-0.5mol.L 1氨水洗脱，收集0.4-0.5mol.L-1氨水洗 脱液。
12.根据权利要求1至9任一所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤(3)中取与步骤(1)中蚕沙的重量比为1:1-1:2的聚酰胺，将步骤(2)得到的酸性水和水洗脱合并浓缩液通过聚酰胺层析柱纯化，上样，分别用水、30%乙醇和70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，洗脱液浓缩干燥，得黄酮提取物。
13.根据权利要求1至9任一所述的蚕沙中同时制备亚氨基糖及黄酮提取物的方法，其特征在于:步骤⑷取与步骤⑴中蚕沙的重量比为1: 0.5-1: 2的碱性氧化铝或中性氧化铝，将步骤(2)所得的氨水洗脱液浓缩至pH中性，通过碱性氧化铝或中性氧化铝层析柱纯化，上样，并用50 %乙醇洗脱，收集50 %乙醇洗脱液，洗脱液浓缩干燥，得亚氨基糖提取 物。
【文档编号】A61K35/64GK103641771SQ201310713282
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】吕寒, 李维林, 陈剑, 马丽, 任冰如, 刘艳, 梁呈元 申请人:江苏省中国科学院植物研究所