一种口服重组融合蛋白tat-map30及制备方法和应用的制作方法

一种口服重组融合蛋白tat-map30及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30及制备方法和应用，利用基因工程技术将穿膜肽TAT和苦瓜素MP30结合，转化大肠杆菌，获得了一株可生产TAT-MAP30融合蛋白的基因工程菌，CCTCC?NO:M2013546。获得的TAT-MAP30融合蛋白具有快速穿过中肠细胞膜的能力，能降低机体生物屏障、物理屏障和化学屏障对蛋白的损失，可作为口服药物用于脊椎动物和无脊椎动物抗细菌、抗病毒的预防和治疗，该融合蛋白的表达量高，易纯化，具有重要的应用前景和实际意义。
【专利说明】—种口服重组融合蛋白TAT-MAP30及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因生物工程【技术领域】，具体涉及一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30，还涉及一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30的制备方法，还涉及一种能表达口服重组融合蛋白TAT-MAP30的基因工程菌株，以及一种口服重组融合蛋白TAT-MAP30的在抗菌、抗病毒中应用。
【背景技术】
[0002]MAP30 蛋白
[0003]MAP30 蛋白(mordtca ant1-HIV protein of 30)共由 286 个氨基酸组成。其基因组由858个碱基构成，其中，包含一个独立的ORF阅读框，无内含子。前23个氨基酸为引导肽，在成熟的发挥功能的MAP30蛋白中没有检测到引导肽序列。
[0004]目前，MAP30蛋白能使细菌、病毒、肿瘤细胞的核糖体失活的具体机制尚未得到清晰阐述，但是研究推测，MAP30蛋白的作用机制主要是通过改变DNA的拓扑结构而使核糖体失活，比如对超螺旋DNA的切割作用，将其变为缺口环状及线状DNA，以阻碍蛋白质的合成。
[0005]苦瓜蛋白MAP30的生物学活性较多，主要包括以下几方面:抗病毒作用，对艾滋病毒、流感病毒、乙脑病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、肝炎病毒、柯萨奇病毒等均有抑制作用；抗肿瘤作用，对中枢神经系统肿瘤，黑色素瘤等均有抑制生长作用；降血糖作用，苦瓜素对于自发性高血糖小鼠，以及诱发性高血糖大鼠均能够起到促进胰岛素分泌，降低血糖浓度，推迟口服蔗糖后血糖升高时间和降低血糖最高峰值的作用；抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有一定的抑菌效果；抗生育作用；免疫原性等。MAP30蛋白的功效很多，还有待进一步探索。
[0006]TAT的研究背景
[0007]近年来发现有一些小分子的多肽可以介导外源物质穿过细胞膜，这种小分子多肽被称之为细胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPP)。许多CPP都是来源于某些直接与宿主细胞相互作用的病毒结构蛋白的蛋白转导结构域(protein transductiondomains, PTD)。现在研究最多、应用范围最广的细胞穿膜肽(Trans-activatingtranscriptional activator, Tat)。Tat蛋白中存在3个功能结构域,分别是:位于N-端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Schwarze发现位于Tat蛋白中第47_57位之间的11个氨基酸YGRKKRRQRRR不仅能够独立穿过细胞膜，而且其穿膜效率比全长的Tat蛋白还要高。这段多肽即是TAT穿膜肽。
[0008]不管是单独的TAT穿膜肽，或者是携带其他大分子物质如蛋白质、寡聚核苷酸或脂质体等，在穿膜时都可以表现出较高的穿膜活性。在携带外源物质穿膜时，TAT介导的穿膜似乎与其要携带的分子大小无关，100KD的蛋白质、40nm大小的纳米颗粒、甚至200nm大小的脂质体都可以经TAT运载入细胞内。而且，以这种方式运输到细胞内的脂质体甚至可以在进入细胞内Ih后仍然可保持结构的完整性。相反的，没有与TAT穿膜肽连接的物质在与细胞共同孵育时均不能够进入细胞内。
[0009]TAT穿膜肽的序列中由于有6个精氨酸和2个赖氨酸残基，因此是带有高度正电荷的多肽。以不带电荷的丙氨酸替代其中的任何一个碱性氨基酸残基都会使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸残基时穿膜活性则不会发生改变。这说明TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，因此推测这些正电荷很可能是能够与真核细胞的细胞膜发生强的静电作用，从而介导了穿膜过程。对TAT穿膜肽的亲和性分析发现，它能够与许多细胞膜表面的阴离子通过静电作用强烈地结合，与之结合的细胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸丰富的多肽可以穿过细胞膜，而其他氨基酸如赖氨酸、组氨酸等丰富的多肽却不具有此功能。然而，由精氨酸组成的支链聚合物与直链聚合物具有同样的穿膜效率。此外，研究发现TAT穿膜肽不会因为手性结构的改变而影响其穿膜活性，其手性分子与自然结构具有相同的穿膜活性。这说明这种细胞穿膜肽很可能不依赖于特定的结合位点。然而，多肽的长度是影响穿膜效率的重要因素。穿膜效率与精氨酸的个数有关，含有6个或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5个精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15个氨基酸时，穿膜效率会随着多肽大小的增加而增强。大于15个氨基酸的多肽虽然也可具有穿膜活性，但其效率却会明显减小。
[0010]尽管对于TAT穿膜肽的穿膜功能研究的比较多，但是到目前为止，关于TAT穿膜肽进入细胞的分子机制还没有完全研究清楚。早期研究认为是通过直接转运机制穿过细胞膜，且是不依赖于能量的，但最近的研究也有与这一观点不同的结果。尽管其进入细胞的机制还没有完全研究透彻，但TAT穿膜肽的应用已经十分广泛。
[0011]金黄色葡萄球菌
[0012]金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus)是人类的一种重要病原菌,隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus),是革兰氏阳性菌的代表,可引起许多严重感染,随着抗生素的滥用，耐药菌也越来越多，开发新的抗菌药物迫在眉睫。
[0013]金黄色葡萄球菌毒力较强，可以通过侵袭性和毒素性两种方式引起宿主疾病:一是在动物机体内扩散和增殖；二是产生外毒素和其他有害物质。金黄色葡萄球菌的毒力因子有表面结构蛋白、酶类和毒素三种。
[0014]金黄色葡萄球菌导致的侵袭性疾病，主要是引发机体局部(一般在皮肤中发生)或全身性的化脓性感染。局部感染分为两种:①包括毛囊炎、伤口化脓、疖等病变的皮肤性化脓感染；②包括气管炎、肺炎、骨髓炎、脓胸等病变的个别器官感染。全身性感染主要是由于金黄色葡萄球菌及其毒素侵入了血液，导致机体的脓毒血症、菌血症和败血症。由其引起的毒素性疾病主要是外毒素造成的，主要包括食物中毒(在夏季高发)、烫伤样皮肤综合症和毒性休克综合症。
[0015]金黄色葡萄球菌，属于革兰氏染色阳性菌，球形，显微镜下可见其排列呈葡萄串状，单个细菌较小，直径约为Ium左右。金黄色葡萄球菌结构比较简单，没有芽孢和鞭毛，一般情况下无荚膜，但在体外培养时有时可观察到在菌体外层有粘液物质，发挥着同荚膜同样的保护性作用。在陈旧培养物中，在某些化学物质如氨苄西林存在时，或在细菌生长处于衰亡期时，此时镜检可发现金黄色葡萄球菌呈缺壁的L型，没有规则形态。
[0016]金黄色葡萄球菌对环境的抵抗能力较强，可以承受一定的干燥、高热和盐度。有实验表明，在干燥的浓汁中保存了 2—3月的细菌仍然有活性。利用高温的方法杀死金黄色葡萄球菌，必须使其在60°C中保持I小时，或80°C中保持30分钟。金黄色葡萄球菌有一定的渗透压抵抗力，可以在NaCL浓度为100— 150g/L的培养基中繁殖。
[0017]正因为以上特点，金黄色葡萄球菌感染和污染已经成为了一个世界性的难题。尤其是目前抗生素的滥用，导致耐药菌株越来越多，金黄色葡萄球菌中已经出现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MARSA)，又名Il超级细菌一，一般抗生素(除了万古霉素)对此种菌株都无效果。因此，开发新的抗菌药物势在必行。
[0018]对虾白班综合征病毒(WSSV)
[0019]20世纪80年代以来,世界对虾养殖业高速发展，随着对虾养殖业规模化的生产，以及环境的日益破坏，其病害问题越来越突出，已经成为阻碍养殖业发展的重要因素。我国已经成为对虾和小龙虾养殖业大国。1993-1994年我国对虾病毒爆发流行,产量急剧减少，给我国对虾养殖业造成数十亿元的经济损失。其中主要包括以下几种病毒:对虾白斑综合症病毒(WSSV);桃拉综合症病毒(TSV)和黄头症病毒(YHV)。其中WSSV是对虾养殖业危害严重的病原体之一。
[0020]虫下白斑综合症病毒(WhiteSpot Syndrome Virus，WSSV)自1992年首次在台湾爆发以来，先后分别在日本、东南亚、北美等国家爆发，在全球范围内对虾养殖业造成了巨大的经济损失。19 95年，联合国粮油组织(FA0)，国际兽药局(OIE)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。为了进一步控制该病原生物的感染，近年来各国专家学者们对白斑综合症病毒进行了深入研究，探讨了其形态结构、基因组成、分类学、感染宿主以及与病毒感染相关的蛋白。为防治WSSV感染提供了重要的理论依据。
[0021]WSSV是一种有囊膜的环状双链DNA病毒，其形态学与杆状病毒相似，呈长杆状，具有双层囊膜。完整的病毒粒子主要包括囊膜、核衣壳及病毒核心三部分。病毒经负染后在电子显微镜下可以观察到在囊膜一端延伸出尾状结构。在不同的分离株中，有囊膜包裹的病毒其长度约210-380nm，直径约70_167nm。除去囊膜的核衣壳部分，其长度约180_420nm，直径约54-85nm。自WSSV在全世界范围内爆发以来，ICTV现将WSSV列为新建的线头病毒科(Nimaviridae)、白斑病毒属(Whispovirus)的代表种。
[0022]WSSV有较广的宿主范围，除了可以感染虾、蟹类等甲壳动物外，桡足类及部分节肢动物也可以成为该病毒的传播者及携带者。许多十足目的甲壳动物都是WSSV的感染宿主。VP28蛋白最早是由van Hulten发现的，对VP28蛋白的结构分析可以发现，VP28蛋白的结构中存在5个潜在的N-糖基化位点，2个潜在的O-糖基化位点及9个可能的磷酸化位点。同时，在蛋白的N-端存在强疏水区，且这个区域中包含一个理论上的跨膜结构域。van Hulten第一次利用VP28蛋白的抗体中和实验证明了该蛋白与WSSV感染的早期过程有关(van Hulten, M.C.ff., ffitteveldt, J., Snippe, Μ., Vlak, J.M..White spot syndromevirus envelope protein VP28is involved in the systemic infection of shrimp[J].Virology, 2001b, 285:228 - 233.)。在 van Hulten 的研究基础上，Yi 进一步研究了 VP28蛋白在WSSV感染过程中的具体作用，通过抗体中和实验、VP28蛋白的体外结合实验、VP28蛋白及WSSV与对虾血细胞结合的竞争ELISA等，进一步证明了 VP28蛋白参与WSSV对虾细胞的吸附及侵入过程(Yi, G., Wang, Z., Qi, Y., Yao, L., Qian, J., Hu, L..VP28of whitespot syndrome virus is involved in the attachment and penetration into shrimpcells [J].J.Biochem.Mol.Biol, 2004，37:726 - 734.) ?近年来研究发现能够与 VP28 蛋白相互作用的宿主细胞表面蛋白主要有PmRab7、HSP70 (heat shock cognate protein70)、STAT(signal transducer and activator of transcription)。近年来各国学者一直致力于对WSSV流行病学及致病机理的研究，以寻找防治WSSV感染的措施和方法。目前防治方法主要有利用免疫增强剂来调节增加对虾的抗病毒感染能力、利用中和抗体中和作用来阻断WSSV的感染、利用RNA干扰使特定基因沉默以减弱WSSV的感染、利用疫苗使对虾体内产生抗病的免疫效应。目前已经研究证明能够增强对虾抗WSSV感染能力的免疫增强剂主要有脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)、葡聚糖(Glucan)、肽聚糖(Peptidoglycan，PG)等。Westenberg研究了序列特异性及非特异性的siRNA对斑节对奸(Penaeus monodon)抗 WSSV 感染的保护作用(Westenberg, M.，Heinhuisj B.，Zuidemaj D.，Vlakj J.M.siRNAinjection induces sequence-1ndependent protection in Penaeus monodon againstwhite spot syndrome virus[J].Virus Res，2009，114:133 - 139)。Namikoshi 的研究中以福尔马林作为灭活剂制备灭活疫苗，在肌肉注射福尔马林灭活的WSSV病毒10天后，进行病毒攻击实验，结果发现灭活的WSSV可以在虾体内产生保护作用，这表明一些囊膜蛋白能够在虾体内诱导产生免疫应答并保护虾抵抗WSSV的感染(Namikoshi A, WuJLjYamashita TjNishizawa TjNishioka TjArmoto Mj et al.Vaccination trialswith Penaeus japonicus to induce resistance to white spot syndrome virus[J].Aquaculture, 2004, 229:25 - 35) 0然而这种作用十分有限，在注射灭活WSSV病毒20天后就完全失去了保护作用。Zhu研究的灭活疫苗是以二乙烯亚胺(Binary ethylenimine,ΒΕΙ)作为灭活剂的。BEI是由2-氯乙胺盐酸盐经环化作用而形成的，它可以使核苷酸烷基化，但是在较低的浓度(lmmol/L)下不会使蛋白分子受到破坏，因而以BEI作为灭活剂时WSSV的囊膜蛋白可以保持完整，能够在虾体内诱导产生免疫应答并保护虾抵抗WSSV 的感染(Fei Zhuj Huahua Duj Zh1-Guo Miaoj Ha1-Zhi Quanj Z1-Rong Xu.Protectionof Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using inactivatedWSSV[J].Fish&Shellfish Immunology.2009，26:685 - 690)。Witteveldt 利用原核表达载体在大肠杆菌中分别对VP28及VP19蛋白进行重组表达，且重组蛋白N-端与麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein，MBP)融合表达。分别将纯化的VP28及VP19蛋白通过肌肉注射到对虾体内，同时分别以只注射MBP和生理盐水的对虾组作为对照。在肌肉注射后第2天及第25天分别进行病毒攻击实验，结果发现与对照组相比，VP28及VP19蛋白注射组存在较高的相对存活率。因此认为对虾对WSSV的结构蛋白存在一定的免疫应答，可以提高对虫下抗 WSSV 感染的能力(Jeroen Witteveldtj Just M.Vlakj Marielle C.W., van Hulten.Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSVsubunit vaccine [J].Fis h&Shellf ish Immunology.2004，16:571-579) ? Du 利用昆虫细胞表达系统来表达重组的VP28蛋白，重组蛋白经肌肉注射进入鳌虾体内。并注射后第10天进行病毒攻击实验，结果发现昆虫细胞表达的重组蛋白对鳌虾有较好的保护作用，与对照组相比，其相对致死率已经达到了 92% (Huahua Duj Zirong Xuj Xiaofeng Wuj Weifen Li, WeiDa1.1ncreased resistance to white spot syndrome virus in Procambarus clarkii byinjection of envelope protein VP28expressed using recombinantbaculovirus [J].Aquaculture.2006, 260:39 - 43)。Xu利用杆状病毒(HyNPV)表达系统在家蚕体内分别表达重组的VP28及VP19蛋白，并将带有重组蛋白的家蚕匀浆液包裹虾饲料，连续投喂克氏原鳌虾30天。投喂结束后即进行病毒攻击，结果发现与对照组相比，VP28蛋白组及VP19蛋白组的相对存活率分别为94.7%和89.5%。这说明与肌肉注射相比，口服的亚单位疫苗同样可以对克氏原鳌奸产生保护作用(Zirong Xu a, Huahua Du, YaxiangXu,Jianyi Sun, Jian Shen.Crayfish Procambarus clarkii protected against whitespot syndrome virus by oral administration of viral proteins expressed insilkworms [J].Aquaculture.2006:253, 179 - 183)。Xu 利用毕赤酵母(Pichia pastoris)对VP28及VP19蛋白进行真核表达，并将表达的重组蛋白经虾饲料包裹后投喂克氏原鳌虾。连续投喂25天后，分别在结束投喂后的第3天及第21天进行病毒攻击实验，结果发现与对照组相比，VP28及VP19蛋白投喂组存在较高的相对存活率。Fu利用枯草芽孢杆菌高效地分泌表达重组的VP28蛋白，并将表达的重组蛋白经虾饲料包裹后投喂中国对虾，连续投喂20天后，分别于第3天、14天、28天进行病毒攻击，结果发现与对照组相比，蛋白投喂组的相对存活率达到了 83.3%。近年来开始有学者致力于研究口服的DNA疫苗。Rajesh (S.Rajesh Kumar, C.Venkatesan, M.Sarathi, V.Sarathbabu, John Thomas, Κ.Anver Basha, A.S.Sahul Hameed.0ral delivery of DNA construct using chitosannanoparticles to protect the shrimp from white spot syndrome virus (WSSV)[J].Fish&Shellfish Immunology.2009, 26:6429 - 437.)以壳聚糖纳米颗粒作为转运载体，将带有vp28基因的DNA疫苗包裹在其中，并通过口服的方式免疫对虾。在免疫后第7、
15、30天分别进行病毒攻击实验，并得到了较好的保护效果，相对存活率分别为85%、65%、50%。Ning (Jian-Fang Ning, Wei Zhu,Jin-Ping Xu,Cong-Yi Zheng, Xiao-Lin Meng.0ral delivery of DNA vaccine encoding VP28against white spot syndrome virus incrayfish by attenuated Salmonella typhimurium.Vaccine[J].2009, 27:1127 - 1135)以减毒的沙门氏菌作为转运载体，将带有vp28基因的真核表达载体pcDNA3.1转化入减毒的沙门氏菌中，并将重组菌以口服的方式免疫克氏原鳌虾。在免疫后第7、15、25天分别进行病毒攻击实验，结果得到的相对存活率分别为88.3%,66.7%和56.7%。
[0023]综上所述，关于利用苦瓜素抗医学病毒的研究已有许多报道，但利用TAT携带MAP30跨膜进入体内抗病毒还未见报道，若MAP30不能进入动物体内，也就很难达到控制和治疗动物病毒病的目的。而通过注射的方法，尤其是像水产动物，要想达到群体预防和治疗的目的，注射的方法显然是不可能实现的。

【发明内容】

[0024]本发明的目的是提供了一种TAT-MAP30融合蛋白，其序列为SEQ ID N0.2所示。将TAT与MAP30融合表达，获得的TAT-MAP30融合蛋白快速穿过中肠细胞膜，减少机体生物屏障、物理屏障和化学屏障对蛋白的损失.可作为口服药物用于脊椎动物和无脊椎动物抗细菌、抗病毒的预防和治疗。
[0025]本发明的另一个目的在于提供了一种TAT-MAP30融合蛋白的制备方法，大肠埃希氏菌Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-TAT-MAP30, F^ompT hsdSB (rB_mB0 gal dcm(DE3)工程菌大量表达该融合蛋白，并使用镍柱纯化，方法简单，易行，适用于大规模生产。[0026]本发明的另一个目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，大肠埃希氏菌Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-TAT-MAP30,F^ompT hsdSB (rB_mB0 gal dcm(DE3)(以下简称为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) - pET28a-TAT-MAP30)；CCTCC N0:M2013546。该菌株可以表达TAT-MAP30融合蛋白。表达量大且可溶，易于工业化生产，成本低，安全性好。
[0027]本发明还有一个目的是提供了一种TAT-MAP30融合蛋白在制备抑制金黄色葡萄糖球菌生长药物中的应用，TAT-MAP30重组蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显，可有效避免金黄色葡萄糖球菌在临床上的耐药性。
[0028]本发明的最后一个目的在于提供了一种TAT-MAP30融合蛋白在制备抗对虾白斑综合征病毒药物中的应用。
[0029]为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施:
[0030]一种TAT-MAP30融合蛋白的制备方法:其步骤是:
[0031 ] 1.MAP30基因和TAT序列的制备:
[0032]人工合成MAP30基因和TAT序列，MAP30的核苷酸序列为SEQ ID N0.3所示，TAT核苷酸序列为SEQ ID N0.4所示。
[0033]2.TAT-MAP30融合基因的制备:
[0034]利用融合PCR 技术，在MAP30基因序列的3 ‘端加入TAT序列，实现了两段基因序列的融合。
[0035]3.TAT-MAP30融合基因表达载体的构建:
[0036]用EcoR I和XhoI对TAT-MAP30序列和质粒pET28a(+)进行双酶切，并用T4连接酶连接，得到重组质粒TAT-MAP30-pET28a(+)
[0037]4.大肠杆菌基因工程菌的制备:
[0038]重组质粒TAT-MAP30-pET28a (+)经 CaCl2 化学方法转化 BL21 (DE3)，经 PCR 鉴定，获得了基因工程表达菌 Escherichia coli BL21(DE3) - pET28a-TAT_MAP30。
[0039] 申请人:于2013年11月4日将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名:大肠埃希氏菌Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-MAP30, F^ompT hsdSBgal dcm(DE3)，CCTCC N0:M2013546。
[0040]通过上述方法获得了一种大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-MAP30。它具有如下特征:最适生长温度为37°C，菌落边缘整齐，表面有光泽、呈灰色。Escherichia coli BL21(DE3)以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区域整合于BL21的染色体上。
[0041]5.基因工程融合蛋白的制备:
[0042]5.1 发酵
[0043]①接种50ul Escherichia coli BL21 (DE3) - pET28a-TAT_MAP30 甘油菌种于20mlLB液体培养基中(Kan抗性)，37°C 200rpm培养过夜。
[0044]②第二天，按照4%的比例，即4ml发酵液于100ml培养基中(加IOOul浓度为Imol/ml的Kan)，于37°C 200rpm的条件下培养大约2小时左右。
[0045]③当菌液0D600约为0.6时，取出三角瓶冰浴10分钟，再加入20ul浓度为Imol/ml的IPTG，于18°C 200rpm的条件下诱导发酵20~24小时。
[0046]2.2提取可溶性重组融合蛋白
[0047]①将200mL Escherichia coli BL21 (DE3) - pET28a-TAT_MAP30 发酵液于室温8000rpm离心40分钟，收集湿菌体。
[0048]②用80mL Lysis Buffer重悬菌体,并将菌液转移至破碎杯中
[0049]③在低温高速离心机中，以4°C 1000Ormp的条件，将破碎液离心20分钟。
[0050]④收集上清，弃掉沉淀。
[0051]经镍柱纯化，透析，浓缩后即得一种TAT-MAP30融合蛋白，其序列为SEQ ID N0.2所示。
[0052]一种TAT-MAP30融合蛋白在制备抑制金黄色葡萄糖球菌生长药物中的应用，其应用过程是:
[0053]滤纸片法抑菌实验测定基因工程融合蛋白抑制金黄色葡萄球菌生长的情况以及MTT法测定TAT-MAP30对金黄色葡萄球菌的MIC值。
[0054]一种TAT-MAP30融合蛋白在制备抗对虾白斑综合征病毒药物中的应用，其应用过程是:
[0055]水产市场购买健康鳌虾(体重30g左右)，实验设有阳性对照，病毒自孵育阴性对照组和TAT-MAP30共孵育组3组处理，每组处理各设三个重复。各处理养殖盒贴上相应标签，具体实施方法如下:
[0056]第一组(阳性对照):每日分两餐喂食饲料，每盒每天共喂食4g饲料。两周后直接注射WSSV病毒
[0057]第二组(病毒自孵育阴性对照组):每日分两餐喂食饲料，每盒每天共喂食4g饲料。两周后每只螯虾注射于28°C水浴锅中孵育I小时的病毒悬液。
[0058]第三组(病毒与TAT-MAP30重组蛋白共孵育组):每日分两餐喂食饲料，每盒每天共喂食4g饲料。两周后每只螯虾注射病毒与TAT-MAP30重组蛋白共孵育于28°C水浴锅中I小时的病毒悬液。
[0059]检测鳌虾发病情况。
[0060]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0061]1.利用大肠杆菌表达TAT跨膜域和苦瓜蛋白MAP30的融合蛋白，意在治疗类似金黄色葡萄球菌等抗性菌感染以及病毒感染、肥胖症、糖尿病等等。该工程蛋白不仅可用于无脊椎动物而且还可用于脊椎动物。
[0062]2.利用TAT的蛋白转导功能，引导苦瓜蛋白MAP30快速跨过肠细胞膜，减少机体生物屏障、物理屏障和化学屏障对蛋白的损失，快速进入循环系统。在实际应用中，可以通过经口给药的方式代替注射给药，使此工程蛋白不仅可用于无脊椎动物(如水产动物)而且还可用于脊椎动物(如家禽、猪马牛羊及人药)。
[0063]3.本发明制得的融合重组蛋白在克氏螯虾上的急性毒性实验和慢性毒性实验，证明此蛋白对无脊椎动物是安全的。
[0064]4.TAT穿膜肽目前还没有直接应用于养殖业，尤其是水产养殖业。但其独特的穿膜效率十分具有吸引力。解决了使药物不经肌肉注射而直接进入循环系统中，使其具有实际操作的可行性。本发明公开了 TAT携带MAP30跨肠膜的实验过程，为其应用打下了理论基础，而且基因工程菌株的构建方法可以应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。
【专利附图】

【附图说明】
[0065]图1为一种重组质粒TAT-MAP30-pET_28a(+)构建过程示意图。
[0066]图2为一种TAT-MAP30PCR结果示意图。
[0067]图3为一种重组质粒TAT-MAP30_pET28a(+)双酶切鉴定图。
[0068]图4为一种重组蛋白TAT-MAP30诱导表达示意图。
[0069]泳道1:蛋白 Marker
[0070]泳道2: IPTG 诱导前的 TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液上清[0071 ]泳道 3: IPTG 诱导前的 TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液沉淀
[0072]泳道4 =IPTG 诱导后的 TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液上清
[0073]泳道5 =IPTG 诱导后的 TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液沉淀
[0074]泳道6 =IPTG诱导后的pET28a_BL21 (DE3)破碎液上清
[0075]泳道7 =IPTG诱导后的pET28a_BL21 (DE3)破碎液沉淀
[0076]泳道8:蛋白 Marker
[0077]泳道9:乳糖自动诱导TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液上清
[0078]泳道10:乳糖自动诱导TAT-MAP30-pET28a-BL21 (DE3)破碎液沉淀
[0079]图5为一种TAT-MAP30重组蛋白对金黄色葡萄球菌的生长抑制实验。
[0080]图6为一种MTT法测重组蛋白TAT-MAP30对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度。
[0081]图7为一种ELISA检测螯虾血淋巴中TAT-MAP30重组蛋白示意图。
[0082]图8为一种重组融合蛋白TAT-MAP30抗WSSV的作用示意图。
【具体实施方式】
[0083]本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。
[0084]实施例1:
[0085]工程菌大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3) pET-28a-TAT_MAP30 的制备
[0086]1.MAP30基因和TAT序列的获得
[0087]人工合成MAP30基因的序列，其序列为SEQ ID N0.3所示。
[0088]TAT 序列根据根据 Dietz GP et al.Application of ablood-brain-barrier-penetrating form of GDNF in a mouse model for Parkinson'sdisease.Brain Res.2006Aprl2; 1082 (I):61-6.文献报道，委托生物公司合成TAT基因的全序列，并保存到T载体上，TAT序列为SEQ ID N0.4所示。
[0089]2.TAT-MAP30融合基因的获得
[0090]利用融合PCR技术，在MAP30基因序列的3 ‘端加入TAT序列，实现了两段基因序列的融合。为了通过重叠PCR技术，在MAP305 ‘端加入TAT，现设计引物如下:
[0091]
【权利要求】
1.一种合成的基因，其序列为SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其序列为SEQID N0.2所示。
3.含有权利要求1所述基因的基因工程菌:大肠杆菌coliBL21 (DE3)pET-28a-TAT-MAP30 ,Y— ompT hsdSB(rBmB) gal dcm (DE3) ； CCTCC NO: M2013546。
4.权利要求2所述蛋白的制备方法，其步骤为: 1)诱导 ①接种50ul重组基因工程菌于20mlKan抗性的LB液体培养基中，37°C 200rpm培养过夜； ②第二天，按照4%的比例，即4ml发酵液于100ml培养基中，该培养基中加有IOOul浓度为lmol/ml的Kan,于37°C 200rpm的条件下培养2小时； ③当菌液0D600约为0.6时，取出三角瓶冰浴10分钟，再加入20ul浓度为lmol/ml的IPTG，于18°C 200rpm的条件下诱导发酵20~24小时； 2)提取可溶性重组融合蛋白 ①将200mL重组基因工程菌发酵液于室温SOOOrpm离心40分钟，收集湿菌体； ②用80mLLysis Buffer重悬菌体,并将菌液转移至破碎杯中； ③在低温高速离心机中，以4°C1000Ormp的条件，将破碎液离心20分钟； ④收集上清，弃掉沉淀； 经镍柱纯化，透析，浓缩后即得一种TAT-MAP30融合蛋白，其序列为SEQ ID N0.2所示； 所述的重组基因工程菌为:大肠埃希氏菌Escherichia coli BL21 (DE3)pET-28a-TAT-MAP30, F- ompT hsdSB(rBmB)gal dcm (DE3) ；CCTCC NO: M2013546。
5.权利要求1所述的基因或权利要求2所述蛋白在制备抑制金黄色葡萄糖球菌生长药物中的应用。
6.权利要求1所述的基因或权利要求2所述蛋白在制备抗对虾白斑综合征病毒药物中的应用。
【文档编号】A61P31/04GK103789333SQ201410077176
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年3月5日 优先权日:2014年3月5日
【发明者】孟小林, 徐进平, 孟明翔, 王健, 潘娟 申请人:湖北肽洋红生物工程有限公司