miR-885-5p、miR-224-5p在药物制备中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，特别涉及miR-885-5p、miR-224-5p在药物制备中的应用。本发明验证了在体外高度炎症环境下，Graves眼病的主要致病细胞眶后成纤维细胞直接对糖皮质激素产生抵抗，而miR-885-5p和miR-224-5p能增加眶后成纤维细胞中糖皮质激素受体的蛋白水平，恢复眶后成纤维细胞对糖皮质激素的敏感性，提高糖皮质激素对Graves眼病的治疗效果，为临床上治疗Graves眼病提供了理论依据和实验数据。基线血清miR-885-5p、miR-224-5p、TRAb和眼裂宽度一起构成的模型可以有效预测对于糖皮质激素治疗不敏感的患者。
【专利说明】m i R-885-5p、m i R-224-5p在药物制备中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，特别涉及miR-885-5p、miR-224-5p在药物制备中的应 用。
【背景技术】
[0002] Graves眼病（G0)是Graves病（⑶）最为突出的甲状腺外病变，2013年Tanda等 人根据EUG0G0标准在346例甲亢初发患者中发现26%的⑶患者起病时就伴有G0。眶后 成纤维细胞（0F)是G0的致病抗原载体和效应细胞。和其他部位的成纤维细胞不同，除了 0F特异性表达的IGFR-1R等抗原外，0F还表达甲状腺细胞特异表达分子，例如TSHR、Tg、 ΤΡ0和NIS，被称为甲状腺在眼眶的模拟重建。由此GD患者循环内针对甲状腺的抗体也打 击0F，再加上其他针对0F的抗体，刺激其增殖、向脂肪分化、以及大量分泌炎症因子和糖胺 聚糖（GAG)。其分泌的可溶性细胞间粘附因子-l(sICAM-l)召募和活化淋巴细胞，促进抗原 提呈，活化的淋巴细胞进一步促进0F分泌炎症因子，使活动期炎症反应加剧。而以透明质 酸（HA)为主的GAG在框后大量聚集，因为其亲水性，渗透压作用吸收水分导致球后组织水 肿、眼外肌水肿麻痹导致眼球突出和复视，眼内压增高压迫视神经，眶内压增高压迫静脉回 流使睑结膜水肿、纤维化，造成眼睑挛缩，导致斜视和暴露性角膜炎，甚至失明，极大降低患 者的生活质量。因此，抑制眶后成纤维细胞的大量分泌炎症因子及大量增殖成为治疗G0的 关键点。
[0003] 静脉糖皮质激素（GC)是目前治疗活动性中重度G0的一线用药。GC通过糖皮质 激素受体（GR)介导的转录抑制作用直接抑制0F细胞众多炎症因子、粘附因子以及HA的合 成，同时，也直接或间接抑制T细胞的活化、Thl/Th2的平衡、巨噬细胞的活化等免疫细胞从 而压制炎症反应。经过随机临床对照试验有效性和安全性的比较（静脉有效率77% Vs 口 服有效率51 % )，静脉GC疗效优于口服、静脉、球后注射等其他用药途径。然而，静脉GC治 疗的应答有较大的个体差异：75-80 %的患者可以获得较满意的临床缓解，6. 5 %患者有新 发疾病，0. 6%患者死亡。严重副作用如诱发心血管疾病和肝功能损伤等主要和患者的既往 病史或治疗剂量有关。因而阐明GC耐药机理，发现耐药标记物，从而预先对患者进行评估， 预测激素疗效尤为重要。
[0004] 近年来，多项研究提示microRNA(miRNA)下调GC通路重要的基因从而影响GC疗 效。败血症患者对GC的应答被miR-124介导的GRa下调所减弱；Neuroscreen细胞中， miR-124a和miR-18不仅下调了 GR蛋白水平，也影响了 GR下游的转录事件。然而，G0患者 中miRNA是否参与GC耐药，以及其如何通过致病细胞0F参与对GC抵抗尚无研究。
[0005] 本研究首先构建0F的GC耐药细胞模型，发现并证实调控0F耐药的miRNAs，最后 分析上述miRNAs对于GC耐药的预测价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是对Graves眼病的主要致病细胞眶后成纤维细胞直接对静脉糖皮 质激素抗药性的研究，而miR-885-5p和miR-224-5p能恢复其敏感性，提高静脉糖皮质激素 对Graves眼病的治疗效果，为临床上治疗Graves眼病提供了理论依据和实验数据。
[0007] 本发明涉及miR-885-5p、miR-224-5p在制备治疗Graves眼病药物中的应用。
[0008] 本发明还涉及miR-885-5p、miR-224-5p在制备恢复静脉糖皮质激素敏感性药物 中的应用。
[0009] 本发明还涉及miR-885-5p、miR-224-5p在制备增加静脉糖皮质激素中糖皮质激 素受体的蛋白水平药物中的应用。
[0010] 本研究中，我们发现眶后成纤维细胞（0F)在体外高炎症因子环境刺激下对静脉 糖皮质激素（GC)耐药，而miR-885-5p和miR-224-5p能增加0F中糖皮质激素受体（GR)的 蛋白水平并提高0F对GC的敏感性。在Graves眼病（G0)患者中血清低水平的miR-885-5p 是GC不敏感的独立危险因素，而基线血清miR-885-5p、miR-224-5p、TRAb和眼裂宽度组合 起来可以成功预测GC不敏感，阴性预测值高达100%。
[0011] 在体外实验中，0F在高浓度TNFa的刺激下，Dex对其分泌sICAM-1的抑制作用明 显下降，形成0F对GC的抵抗，模拟了临床上类似的现象。这一实验结果可以由炎症因子和 糖皮质激素之前相互抑制和调控的平衡来解释。本研究中血清miR-885-5p和miR-224-5p 可能被GO的致病细胞即OF摄取，从而介导对GC应答的调控。GC的抗炎作用主要是通过 GR对NF- κ B的转录抑制实现的。因此，我们在TNFa诱导下GC抵抗的0F模型的基础上， 进一步评估了 miRNA对于NF- κ B启动子活性、NF- κ B调控基因、以及对于GR表达的作用。 在GC抵抗的0F和293T细胞中过表达miR-885-5p和miR-224-5p恢复了 GC的转录抑制作 用。而这一过程可以用GR蛋白水平的增加来解释，且GR蛋白水平的增加并非由于其转录 水平的增加，而是由于GSK-3 β减少导致GR蛋白降解减少。
[0012] 我们发现对GC治疗不敏感的患者基线TRAb比敏感患者显著增高。然而，TRAb的 阴性预测值NPV仅达到55. 55%。眼裂宽度是另一个GC治疗不敏感的独立相关因素，该因 素用于预测时的NPV达到60. 86%。且这两项指标在糖皮质激素治疗后在两组患者间不存 在差异，提不它们不是决定疗效的因素。
[0013] 综上所述，本发明证实了体外高度炎症环境下，G0的主要致病细胞0F直接对GC治 疗产生耐药性，但患者体内的高水平的miR-885-5p、miR-224-5p可以恢复0F对GC的敏感。 而基线循环miR-885-5p、miR-224-5p加上TRAb和眼裂宽度作为标志物组合，可以预测G0 患者进行GC治疗的疗效（NPV = 100% )。这是首个利用循环microRNAs来评估GC疗效的 研究，并且首次提供了 GC治疗前有效的血清学信息。
[0014] 现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0015] 1、本发明验证了在体外高度炎症环境下，Graves眼病的主要致病细胞0F直接 对GC产生抵抗，而miR-885-5p和miR-224-5p可以恢复其敏感性；提高GC对G0的治疗 效果，为临床上治疗Graves眼病提供了理论依据和实验数据。2、基线血清miR-885-5p、 miR-224-5p、TRAb和眼裂宽度一起构成的模型可以有效预测对于糖皮质激素治疗不敏感的 患者。3、本发明研究发现了 miR-885-5p和miR-224-5p能增加0F中糖皮质激素受体（GR) 的蛋白水平并提高0F对GC的敏感性。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为差异microRNA在敏感组和抵抗组中的表达图（其中，A为miR-885-5p在 两组中有显者差异，B为miR -224-5p在两组中有显者差异，C为miR-155-5p在两组中差异 不显著）。
[0017] 图2为miR-885-5p和miR-224-5p对疗效相关细胞因子sICAM-1的抑制结果图。
[0018] 图 3 为 miR-885-5p 和 miR-224-5p 对 NF- κ B 的抑制结果图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
[0020] 实施例1
[0021] 1、原代0F细胞在高浓度炎症因子刺激下对糖皮质激素耐药的测试
[0022] 本发明将3名重度G0患者的原代0F细胞，利用在基础状态下及TNFa高低两个 浓度（5ng/ml和20ng/ml)的刺激来模拟局部不同程度的炎症环境，检测条件培养上清中 G0致病及疗效相关细胞因子sICAM-1的浓度。较之基础状态，5ng/mlTNFa的刺激可增加 sICAM-1的分泌，且20ng/ml不再显著增加 sICAM-1浓度。然而，经1 μ Μ地塞米松（Dex)处 理后，对于20ng/ml TNFa刺激下sICAM-1分泌的抑制作用从5ng/ml时的69%降低至28%， 提示出现对于Dex的抵抗。
[0023] 2、疗效相关miRNAs的验证
[0024] (1)、疗效相关miRNAs的筛选
[0025] 为了进一步探究原因我们选择了 GC疗效最显著的6例患者和7例无效患者，共 13例疗效有极端差异的患者基线血清样本用于PCR芯片（miScript PCRarray)筛选差异 microRNA。
[0026] miScript PCR array发现8个差异miRNA(p〈0. 05)。如表1所示，8个中的大部 分在抵抗患者里是下调的。其中差异倍数最大的分别是miR-885-5p6. 099倍（p = 0. 04)、 miR-224-5p5. 8893 倍（p = 0· 03)、miR-155-5p4. 7209 倍（p = 0· 03)。
[0027] 表1疗效相关差异microRNA的筛选
[0028]
【权利要求】
1. miR-885-5p、miR-224-5p在制备治疗Graves眼病药物中的应用。 2. miR-885-5p、miR-224-5p在制备恢复静脉糖皮质激素敏感性药物中的应用。 3. miR-885-5p、miR-224-5p在制备增加静脉糖皮质激素中糖皮质激素受体的蛋白水平 药物中的应用。
【文档编号】A61P27/02GK104056279SQ201410260381
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月12日 优先权日:2014年6月12日
【发明者】宁光, 沈力韵, 叶蕾, 王卫庆, 洪洁, 朱巍, 蔡洁, 黄凤娇 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院