一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂及其制备方法
【专利摘要】一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂，包括蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酸和胆固醇，其中蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酸和胆固醇的摩尔比为：10～25∶50～70∶1～15∶5～25，优选为15～20∶55～65∶5～10∶10～20，更优选为17∶60∶8∶15。其通过先制备纳米级脂质体超声造影剂，再采用异型双功能交联剂交联法进行IL-8单克隆抗体与自制纳米级脂质体的偶联，从而制备得出靶向性纳米级脂质体超声造影剂。为靶向性纳米级脂质体造影技术早期诊断和治疗与IL-8高表达相关疾病提供方法学和物质基础。
【专利说明】一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米材料制备领域，具体涉及一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来随着超声造影剂制作工艺的优化和分子化学的发展，超声造影剂的制备已 经走入了一个多样化的时代。就目前制备超声造影剂的膜材料来说，可分为非离子表面活 性剂类、蛋白质类、脂质类和高分子多聚体类，其中脂质类是目前较为常用的膜材料，相国 内外的研究已经证实脂质是一类稳定的膜材料，而且脂膜的弹性好、变形性好，一方面比起 白蛋白膜来说，具有更好的稳定性及回声特性；另一方面在声场作用下，微泡能够有规律的 膨大和缩小，此外，在超声辐射力的驱动下微泡在血液中的流动缓慢、相互吸引并向管壁移 动，可使更多大于管壁孔径、具有更大回声特性的微泡透过血管壁。
[0003] 根据造影剂的大小可将造影剂分为微米级造影剂和纳米级造影剂，一般来说，我 们通过激光扫描法、电子显微镜法、库尔特粒度分析法来分析造影剂微粒的大小。微米级造 影剂因其内径较大，不能透过血管，属于血池显像，限制了其对血管外疾病的诊断和治疗。 纳米级造影剂是指颗粒直径在纳米尺度范围内的造影剂，粒径小于l〇〇〇nm(l μ m)。纳米级 造影剂较常规造影剂有极强的穿透力，可以通过血管内皮间隙进入组织间隙，使血管外靶 组织显像成为可能，从而超越常规造影剂仅能发生血池内显像的局限性，推动超声分子显 像与靶向治疗向血管外领域拓展。Oeffinger等证实纳米级微泡超声造影剂用于超声造影 增强是完全可行的。此外，物质的尺寸减少到纳米级后，分子特性会发生很大改变，表现出 许多特有的性质，如表面积大、表面活性中心多、表面反应活性高、强烈的吸附能力以及不 易受体内和细胞内各种酶的降解等，这都为其在生物医学领域的研究应用中开辟了新的道 路，但因其在体内的稳定性、反射性及封包率等问题，目前仍在实验阶段。
[0004] 脂质体作为造影剂时，经静脉注射进入人体后，易先被富含网状内皮细胞的组织， 如肝、脾及骨髓等所摄取，即脂质体具有一定的靶向性，但这属于被动靶向，其特异性和靶 向性均较差，无法满足靶向性超声造影技术的要求。通常，我们会通过对脂质体进行一些 特殊处理，在其表面装配具有靶向性的配体（如单克隆抗体）来实现的脂质体造影剂在体 内的高特异性和靶向性。本发明用不同脂类作为膜材料，使用冷冻干燥-超声法成功制备 了纳米级脂质体超声造影剂，并使用异型双功能交联剂交联法成功将IL-8单克隆抗体偶 联于自制纳米级脂质体超声造影剂上，为靶向性纳米级脂质体造影技术早期诊断和治疗与 IL-8高表达相关疾病提供方法学和物质基础。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种可以靶向显影，用于疾病早起诊断和治疗的纳米级超声造影 齐U，同时还提供了其制备方法。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现：
[0007] -种靶向性纳米级脂质体超声造影剂，包括蛋黄卵磷脂（EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆 碱（DSPC)、棕榈酸和胆固醇（CH)，其中蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酸和胆固醇 的摩尔比为：1〇?25 : 50?70 : 1?15 : 5?25,优选的，蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂 酰胆碱、棕榈酸和胆固醇的摩尔比为：15?20 : 55?65 : 5?10 : 10?20,最优选的 蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酸和胆固醇的摩尔比为17 : 60 : 8 : 15。
[0008] -种靶向性纳米级脂质体超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：1)纳米级脂质 体超声造影剂，2)靶向性纳米级脂质体超声造影剂的制备。
[0009] 所述的步骤1具体为：
[0010] a.按照比例称取蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和棕榈酸混合放置于 试管中；
[0011] b.向上述混合物中加入氯仿溶液，混合物与氯仿溶液的质量体积比为lml/mg，使 用漩涡混合器振动Imin后使其完全溶解，将此混合液放入-80°C冰箱冷冻36h。
[0012] c.将冷冻成固体的脂质体混合物放入冻干机中真空干燥处理6h，去除三氯甲烷， 成均匀稳定的脂质膜。
[0013] d.在所得脂质膜中加入一定量的去离子水（lOml/mg)，然后将其放入温育箱中温 育30min使脂质膜充分溶解于去离子水中，用超声波破碎仪对此混悬液进行超声处理。
[0014] e.等体积甘露醇混入脂质体混悬液中，用_196°C液氮将其速冻成固体，然后放入 冻干机中冻干24h形成脂质微粒冻干粉，以备下一步使用。
[0015] f.将脂质体冻干粉中加入磷酸缓冲液，震荡摇匀既得纳米级脂质体超声造影剂
[0016] 所述的步骤2具体为：
[0017] a.取适量的鼠抗人IL-8单克隆抗体，溶于pH7. 4的磷酸缓冲溶液中，加入异型双 功能交联剂溶液，置于4°C冰箱中反应60min进行反应；
[0018] b.将反应混合物加入离心管中离心洗涤去除剩余异型双功能交联剂，在得到的带 批陡二硫基的单克隆抗体带批陡二硫基的单克隆抗体溶液中加入过量的二硫苏糖醇（DTT) 醋酸溶液，置于4°C冰箱中反应30min后再次离心洗涤以除去剩余的二硫苏糖醇（DTT)，最 后得到带巯基的抗体溶液。
[0019] C.取适量步骤（1)中自制的纳米级脂质体超声造影剂悬液，加入适量异型双功能 交联剂溶液，置于4°C冰箱反应60min，pH7. 4磷酸盐缓冲溶液洗涤，得到带吡啶二硫基的微 泡悬液，立即与人带巯基的抗体溶液混合，反应后经PH7. 4磷酸缓冲液再次洗涤，最终得到 与IL-8单克隆抗体偶联的纳米级脂质体超声造影剂。
[0020] d.所述的磷酸缓冲溶液以1 : 15(容积比）的比例加入20mmol/L的异型双功能 交联剂溶液。
[0021] 本发明的有益效果为采用不同的脂质体做为膜材料，成功制备了纳米级脂质体超 声造影剂，使用异型双功能交联剂成功将IL-8单克隆抗体偶联于自制纳米级脂质体超声 造影剂上，为靶向性纳米级脂质体造影技术早期诊断和治疗与IL-8高表达相关疾病提供 方法学和物质基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1是胆固醇含量脂质体复水后静置不同时间兔左心腔造影时超声均值的比较；
[0023] 图2是胆固醇含量脂质体复水后静置不同时间行兔左心腔造影时峰值强度的比 较；
[0024] 图3是DSPC含量脂质体复水后静置不同时间行兔左心腔造影时超声均值的比 较；
[0025] 图4是DSPC含量脂质体复水后静置不同时间行兔左心腔造影时峰值强度的比 较；
[0026] 图5是冻干前后脂质体复水后静置不同时间行兔左心腔造影时超声均值的比较；
[0027] 图6是冻干前后脂质体复水后静置不同时间行兔左心腔造影时峰值强度的比较；
[0028] 图7是冻干前后脂质体常温下放置不同时间后再复水时行兔左心腔造影时超声 均值的比较；
[0029] 图8是自制脂质体与SonoVue微泡冻干粉复水后静置不同时间行兔左心腔造影时 超声均值的比较；
[0030] 图9是自制脂质体与SonoVue微泡冻干粉复水后静置不同时间行兔左心腔造影时 峰值强度的比较。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0032] 实施例1 一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂通过以下方法制备：
[0033] 将准备好的脂质体膜材料放入50ml试管中混合，其中脂质体膜材料的摩尔比为 蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酸和胆固醇的摩尔比为17 : 60 : 8 : 15,加入 15ml氯仿，使用旋涡混合器振动Imin后使其完全溶解，将此混合液放入-80°C冰箱冷冻36 小时。将冷冻成固体的脂质体混合物放入冻干机中真空干燥处理6h，去除三氯甲烷，成均 匀稳定的脂质膜。在存有脂质膜的试管中加入一定量的去离子水（l〇ml/mg)，然后将其放 入温育箱中温育30min (调节温度）使脂质膜充分溶解于去离子水中，用超声波破碎仪（调 节超声方式和时间）对此混悬液进行超声处理。最后，将脂质体混悬液分装到4支试管中， 即9ml/支，等体积甘露醇混入脂质体混悬液中，用-196°C液氮将其速冻成固体，然后放入 冻干机中冻干24h形成脂质微粒冻干粉，以备下一步使用。
[0034] 采用异型双功能交联剂交联法进行IL-8单克隆抗体与自制纳米级脂质体的偶 联：①取适量的鼠抗人IL-8单克隆抗体，溶于pH7. 4的磷酸缓冲溶液中，以1 : 15 (容积 比）的比例加入20mmol/L的异型双功能交联剂溶液，置于4°C冰箱中反应60min进行反应； 将反应混合物加入50ml离心管中离心洗漆5次（5000r/min，IOmin/次）去除剩余异型双 功能交联剂，在得到的带吡啶二硫基的单克隆抗体（McAb-PDP)溶液中加入过量的二硫苏 糖醇（DTT)醋酸溶液，置于4°C冰箱中反应30min后再次离心洗涤3次，以除去剩余的二硫 苏糖醇（DTT)，最后得到带巯基的抗体（McAb-PDP-SH)溶液。②取适量自制纳米级脂质体 超声造影剂悬液，加入适量异型双功能交联剂溶液，置于4°C冰箱反应60min，pH7. 4磷酸 盐缓冲溶液洗涤，得到带吡啶二硫基的微泡悬液，立即与人McAb-PDP-SH溶液混合，反应后 经pH7. 4磷酸缓冲液再次洗涤，最终得到与IL-8单克隆抗体偶联的纳米级脂质体超声造影 剂。
[0035] 实施例2
[0036] -种靶向性纳米级脂质体超声造影剂，其制备方法同实施例1，不同之处在于蛋黄 卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和棕榈酸组成，其中蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆 碱、棕榈酸和胆固醇的摩尔比为：1〇 : 70 : 1 : 20。
[0037] 实施例3
[0038] -种靶向性纳米级脂质体超声造影剂，其制备方法同实施例1，不同之处在于蛋黄 卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和棕榈酸组成，其中蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆 碱、棕榈酸和胆固醇的摩尔比为：15 : 50 : 10 : 5。
[0039] 实施例4
[0040] 一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂，其制备方法同实施例1，不同之处在于蛋黄 卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和棕榈酸组成，其中蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆 碱、棕榈酸和胆固醇的摩尔比为：25 : 55 : 5 : 25。
[0041] 实施例5
[0042] 一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂，其制备方法同实施例1，不同之处在于蛋黄 卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和棕榈酸组成，其中蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆 碱、棕榈酸和胆固醇的摩尔比为：20 : 65 : 15 : 10。
[0043] 实施例6最佳制备工艺参数的确定
[0044] 试验方法：
[0045] 1)不同水化温度对脂质体物理性质的影响
[0046] 采用最佳膜材料配比，超声条件（100%功率超声，持续作用5min)相同的情况下， 对不同水化温度（35°C、45°C、55°C、65°C、75°C )进行单因素试验，测定不同水化温度下制 备的脂质体的平均粒径、浓度、半衰期，确定最佳水化温度。
[0047] 2)不同超声条件对脂质体物理性质的影响
[0048] 采用最佳膜材料配比，水化温度相同（采用最佳水化温度），分别对不同超声方 式（持续式、脉冲式ls/ls)、超声时间（lmin、3min、5min、10min)及超声功率（20%、50%、 100%、150% )进行试验，测定不同超声条件下制备的脂质体的平均粒径、浓度，确定最佳 超声条件。
[0049] 3)脂质体造影剂体外血液学性质的检测
[0050] 取Iml自制脂质体悬液（最佳膜材料配比、最佳制备工艺参数下制备而得），使用 冰点渗透压仪测定脂质体悬液的渗透压，确定其渗透压范围。
[0051] 4)考察冻干前后脂质体性质的变化
[0052] 以最佳膜材料配比、最佳制备工艺参数下制备而得的脂质体为研究对象，测定冻 干前后脂质体平均粒径、浓度、半衰期、渗透压、Zeta电位，探讨冻干对脂质体性质的影响。
[0053] 结果分析：
[0054] 通过单因素试验优化得到的纳米级脂质体超声造影剂的最佳膜材料组成为：卵磷 脂（EPC):二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC):棕榈酸：胆固醇（CH) = 17 : 60 : 8 : 15 (mol)。 经优化得到的最佳制备工艺参数为：水化温度55°C，水化时间30min，100%功率超声，脉冲 (ls/ls)作用5min。在此条件下制备得到的脂质体平均粒径为690±92nm、浓度4. 12X107 ml、半衰期I. 25h、Zeta电位-32. 04mV、渗透压范围为278?310m0sm/kgH20。兔左心腔造 影研究后经Qlab8. 0软件分析得出自制纳米级脂质体超声造影剂能有效显影，且在体内显 影时间较长，脂质体冻干粉于常温下放置1月后再复水仍具有反射性。造影过程及造影后 1月内兔子无死亡现象，证明自制脂质体超声造影剂相对安全。
[0055] 经玻片凝集实验和免疫荧光实验证明异型双功能交联剂交联法能成功将IL-8偶 联于自制脂质体超声造影剂上，偶联IL-8单克隆抗体后的脂质体平均粒径为692±81nm、 浓度为3. 05X 109/ml、Zeta电位为-32. 02mV、渗透压为275?314m0sm/kgH20,与偶联前脂 质体相比无明显变化；同样经兔左心腔造影研究证明偶联后的脂质体超声造影剂仍能有效 显影，且相对安全。
[0056] 实施例7不同胆固醇含量对脂质体造影强度的影响
[0057] 表1不同胆固醇（CH)含量的脂质体复水后Omin兔左心腔造影的视觉分析
[0058]
【权利要求】
1. 一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂，包括蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈 酸和胆固醇，其特征在于：所述的蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酸和胆固醇的摩 尔比为：1〇?25 : 50?70 : 1?15 : 5?25。
2. 根据权利要求1所述的一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂，其特征在于：所述的 蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酸和胆固醇的摩尔比为：15?20 : 55?65 : 5? 10 : 10 ?20。
3. 根据权利要求2所述的一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂，其特征在于：所述的 蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酸和胆固醇的摩尔比为17 : 60 : 8 : 15。
4. 权利要求1?3任一项所述的一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂的制备方法，其 特征为包括以下步骤：1)纳米级脂质体超声造影剂；2)靶向性纳米级脂质体超声造影剂的 制备。
5. 根据权利要求3所述的一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂的制备方法，其特征在 于：所述的步骤⑴具体为： a. 按照比例称取蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和棕榈酸混合放置于试管 中； b. 向上述混合物中加入氯仿溶液，混合物与氯仿溶液的质量体积比为lml/mg，使用漩 涡混合器振动lmin后使其完全溶解，将此混合液放入-80°C冰箱冷冻36h ; c. 将冷冻成固体的脂质体混合物放入冻干机中真空干燥处理6h，去除三氯甲烷，成均 匀稳定的脂质膜； d. 在所得脂质膜中加入去离子水l〇ml/mg，然后将其放入温育箱中温育30min使脂质 膜充分溶解于去离子水中，用超声波破碎仪对此混悬液进行超声处理； e. 等体积甘露醇混入脂质体混悬液中，用_196°C液氮将其速冻成固体，然后放入冻干 机中冻干24h形成脂质微粒冻干粉，以备下一步使用； f. 将脂质体冻干粉中加入磷酸缓冲液，震荡摇匀既得纳米级脂质体超声造影剂。
6. 根据权利要求3所述的一种靶向性纳米级脂质体超声造影剂的制备方法，其特征在 于：所述的步骤2具体为： a. 取适量的鼠抗人IL-8单克隆抗体，溶于pH7. 4的磷酸缓冲溶液中，加入异型双功能 交联剂溶液，置于4°C冰箱中反应60min进行反应； b. 将反应混合物加入离心管中离心洗涤去除剩余异型双功能交联剂，在得到的带吡啶 二硫基的单克隆抗体溶液中加入过量的二硫苏糖醇醋酸溶液，置于4°C冰箱中反应30min 后再次离心洗涤以除去剩余的二硫苏糖醇，最后得到带巯基的抗体溶液； c. 取适量步骤（1)中自制的纳米级脂质体超声造影剂悬液，加入适量异型双功能交联 剂溶液，置于4°C冰箱反应60min，pH7. 4磷酸盐缓冲溶液洗涤，得到带吡啶二硫基的微泡悬 液，立即与带巯基的抗体溶液混合，反应后经PH7. 4磷酸缓冲液再次洗涤，最终得到与IL-8 单克隆抗体偶联的纳米级脂质体超声造影剂； d. 所述的磷酸缓冲溶液以容积比1 : 15的比例加入20mmol/L的异型双功能交联剂溶 液。
【文档编号】A61K47/48GK104258428SQ201410423845
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】陆永萍, 韦嘉, 李云燕, 徐丽荣, 汤跃跃, 黄燕玲, 杨薇, 张容亮 申请人:陆永萍