用于从自体生理流体产生增强的抗炎/抗分解代谢剂和再生剂的方法和组合物与流程

本申请一般性地涉及医学，更具体地涉及可用于治疗受损和/或受伤的结缔组织，包括慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂(腱炎)，软骨撕裂，慢性退行性关节病况例如骨关节炎以及慢性炎性皮肤病包括特应性皮炎和慢性伤口，的方法和组合物。

背景技术：

骨关节炎(“oa”)是以软骨损伤和滑膜炎症为特征的退行性关节疾病。以前的数据指分子炎症级联的变化，其导致软骨大分子的破坏和不可逆的形态变化¹。相当多的证据表明，il-1，肿瘤坏死因子-α，il-6,8和金属蛋白酶是主要的分解代谢和促炎分子，在骨关节炎的发病机理中起主要作用。这些细胞因子由活化的滑膜细胞，单核细胞或关节软骨本身产生，并且它们的分解代谢效应可以被抑制性细胞因子例如il-4,10,13和il-1ra1成功阻断。

类似的炎症和分解代谢途径参与慢性肌腱炎²和慢性肌肉撕裂愈合失败³的发病机制。肌腱细胞通过产生增加水平的il-1,6，金属蛋白酶(mmp)和其他分解代谢分子而受到持续损伤²。促炎性细胞因子il-1和tnf-α也参与慢性肌炎的发病机制³。特应性皮炎(湿疹)被认为是最常见的复发性炎症皮肤病况。慢性伤口(包括糖尿病伤口)是由于循环不良，神经病变，免疫障碍和全身性疾病的并发症，年龄和反复创伤而在三个月内不愈合的伤口。所有提到的病况的特征在于通过细胞因子干扰细胞信号传导和形成真皮皮肤层的最大组分的细胞外基质(ecm)的丧失。靶向特别的炎症和分解代谢分子途径可以对炎性病理学具有有益的治疗效果。这种效果可以通过使用治疗活性蛋白质来实现。目前，制药工业采用用于重组蛋白生产的高成本分子遗传技术，例如胰岛素，干扰素，凝血因子等。然而，这些重组蛋白生成方法包括在细菌细胞中表达人基因。包括糖基化的翻译后蛋白修饰的模式可以不同于人中天然存在的那些。这可能导致产品在人类环境中的不稳定性，降低生物功能或免疫应答激发。此外，最终重组产物的成本极高。

技术实现要素：

描述了用于治疗受损和/或受伤的结缔组织，慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性关节病况例如骨关节炎和皮肤炎症性病症的生物活性组合物。还描述了制备该组合物的方法。该组合物包括抗炎组分/抗分解代谢组分。抗炎组分也是抗分解代谢组分。为了本发明的目的，术语抗炎组分和抗分解代谢组分可以互换使用。所述组合物还可以包括包含自体富含血小板血浆(prp)的再生组分。尽管大多数prp制备方案包括导致从血小板立即释放生长因子和细胞因子的活化步骤，但是本发明提供未活化的prp组分用于未来通过周围组织缓慢活化注射组合物的用途。

抗炎/抗分解代谢组分优选包含il-1ra，即含有自体血清的il-1受体拮抗剂。此外，抗炎/抗分解代谢组分优选包含增加水平的金属蛋白酶组织抑制剂(timp)。

根据一个方面，提供了制备用于治疗哺乳动物的受损和/或受伤的结缔组织，慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性关节病况和皮肤炎症性病症的自体组合物的方法，其包括以下步骤：

a)制备自体组合物的包含timp和il-1ra的抗炎/抗分解代谢组分，制备抗炎/抗分解代谢组分的步骤包括以下步骤：i)从所述哺乳动物收集自体生理流体，优选血液；ii)将所述血液递送到管；iii)在约37℃至约39℃的温度下孵育所述血液约24小时；iv)离心血液以将血液分离成上清液组分和细胞部分；和v)收集上清液组分；

b)制备所述自体组合物的再生组分，其包括以下步骤：i)从所述哺乳动物收集血液；ii)将血液递送到存在约4％柠檬酸钠的管中；iv)离心全血以分离富含血小板的血浆组分；和v)收集富含血小板的血浆组分；和

c)将抗炎/抗分解代谢组分的上清液组分与富含血小板的血浆组分混合，以提供自体组合物。

为了本公开的目的，术语柠檬酸钠和柠檬酸可以互换使用。

根据另一方面，提供了产生用于治疗哺乳动物的受损和/或受伤的结缔组织，慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性关节病况和皮肤炎症性病症的自体组合物的方法，其包括以下步骤：

a)制备自体组合物的包含timp和il-1ra的抗炎/抗分解代谢组分，制备抗炎/抗分解代谢组分的步骤包括以下步骤：i)从哺乳动物收集血液；ii)将所述血液递送到包括柠檬酸钠的管中；iii)在约37℃至约39℃的温度下孵育所述血液约24小时；iv)离心血液以将血液分离成上清液组分和细胞部分；和v)收集上清液组分；

b)制备所述自体组合物的再生组分，其包括以下步骤：i)从所述哺乳动物收集血液；ii)将血液递送到存在约4％柠檬酸钠的管中；iv)离心全血以分离富含血小板的血浆组分；和v)收集富含血小板的血浆组分；以及

c)将抗炎/抗分解代谢组分的上清液组分与富含血小板的血浆组分混合以提供自体组合物。

根据另一方面，提供了制备用于治疗哺乳动物的受损和/或受伤的结缔组织，慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性关节病况和皮肤炎症性病症的自体组合物的方法，其包括以下步骤：

i)从哺乳动物收集血液；ii)向管中加入柠檬酸钠；iii)将所述血液递送到所述管中；iv)在约37℃至约39℃的温度下孵育所述血液约24小时；v)离心所述血液以将所述血液分离成上清液组分和细胞部分；和vi)收集上清液组分。

根据另一方面，提供了通过本公开的方法产生的用于治疗哺乳动物中受损和/或受伤的结缔组织，慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性关节病况和皮肤炎症性病症的自体组合物。

根据另一方面，提供了用于在哺乳动物中治疗受损的和/或受伤的结缔组织，慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性关节病况和皮肤炎症性病症的自体组合物，所述组合物包含抗炎/抗分解代谢组分，优选包括柠檬酸钠，所述抗炎/抗分解代谢组分包含timp和il-1ra。所述组合物还包含包含富含血小板血浆的再生组分。

根据另一方面，提供了用于在哺乳动物中治疗受损的和/或受伤的结缔组织，慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性关节病况和皮肤炎症性病症的自体组合物，所述组合物包含抗炎/抗分解代谢组分，所述抗炎/抗分解代谢组分包含从哺乳动物的自体血液获得的上清液组分，所述抗炎/抗分解代谢组分包括il-1ra和timp，所述组合物还包含包含从所述哺乳动物获得的富含血小板的血浆的再生组分。所述抗炎/抗分解代谢组分优选包括柠檬酸钠。最优选地，所述柠檬酸钠是4％的柠檬酸钠溶液。

根据另一方面，提供了本发明的自体组合物用于在哺乳动物中治疗受损和/或受伤的结缔组织，慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性关节病况和皮肤炎症性病症的用途。

根据另一方面，提供了在哺乳动物中治疗受损和/或受伤的结缔组织，慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性关节病况和皮肤炎症性病症的的方法，其包括以下步骤：

从哺乳动物收集血液；

将血液递送至管中；

在约37℃至约39℃的温度下孵育所述血液约24小时；

离心所述血液以将所述血液分离成上清液组分和细胞部分；和

收集上清液组分；和

制备所述自体组合物的再生组分，其包括以下步骤：

从哺乳动物收集血液；

将血液递送至存在约4％柠檬酸的管中；

离心所述血液以从全血中分离富含血小板的血浆组分；

收集富含血小板的血浆组分；和

将上清液组分与富含血小板的血浆组分混合以提供自体组合物；和

向所述哺乳动物施用所述自体组合物。

根据另一方面，提供了治疗哺乳动物的受损和/或受伤的结缔组织，慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性关节病况和皮肤炎症性病症的方法，其包括以下步骤：

从哺乳动物收集血液；

向管中加入柠檬酸钠；

将血液递送到所述管；

在约37℃至约39℃的温度下孵育所述血液约24小时；

离心所述血液以将所述血液分离成上清液组分和细胞部分；

收集上清液组分；

制备所述自体组合物的再生组分，其包括以下步骤：

从哺乳动物收集血液；

将血液递送到存在柠檬酸的管中；

离心所述血液以从全血中分离富含血小板的血浆组分；

收集富含血小板的血浆组分；

将上清液组分与富含血小板的血浆组分混合以提供自体组合物；和

向所述哺乳动物施用所述自体组合物。

根据另一方面，提供了治疗哺乳动物的受损和/或受伤的结缔组织，慢性肌腱变性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性关节病况和皮肤炎症性病症的方法，其包括以下步骤：

从哺乳动物收集血液；

将血液递送至存在约4％柠檬酸钠的管中；

在约37℃至约39℃的温度下孵育所述血液约24小时；

离心所述血液以将所述血液分离成上清液组分和细胞部分；

收集上清液组分；和

向所述哺乳动物施用所述上清液组分。

本文所述的组合物和方法适于施用于人。它们也适用于广泛的兽医应用，包括治疗马，狗和骆驼。

本公开提供了用于治疗人类的退行性关节疾病和用于兽医应用包括马，狗和骆驼的替代产品，其相对安全有效，稳定，再生和成本有效。

附图说明

图1是以pg/ml的il-1ra浓度相对于时间的图，其显示在不同时间点，不同孵育条件(包括静止和摇动)的人血清样品中il-1ra拮抗剂蛋白水平的比较。

图2是以pg/ml的il-1ra浓度相对于时间的图，其显示在空气，ca⁺⁺(在磷酸盐缓冲盐水pbs中)和不同浓度血清存在下、在不同时间点的人血清样品中il-1ra拮抗剂蛋白水平的比较。

图3a和3b是患者在治疗前(3a)和正常后处理条件(3b)下的右侧椎旁区域的多普勒超声图像。

图4a和4b是多普勒超声图像，其显示以过度充血(a，治疗前状态)为特征的慢性阿基里斯肌腱变性，其作为自体组合物治疗(b，治疗后成像)的结果而被解决。

图5是显示在孵育24小时之前和之后timp1，timp2和timp4的浓度水平的平均值的图。

图6是显示在8名患者中在注射之前和之后根据视觉模拟量表(“vas”)量表的膝关节疼痛的平均基线的图。

图7是显示8名患者中根据膝盖疼痛，僵硬和日常活动能力的平均水平的womac指数的点值的图。

图8显示了提供第一次，第二次和第三次注射后以及两个月和三个月随访之后的平均结果的分类的图形形式的结果。

图9是显示在24小时孵育之前和之后人血清样品中pgdf的平均浓度水平之间的比较的图。

图10是显示在37℃孵育24h之前(基线水平)和之后人血清样品中mmp2，mmp3，mmp7，mmp9和mmp13蛋白水平的比较的图。

图11是显示在柠檬酸钠存在下在37℃孵育24小时之前(基线水平)和之后人血清样品中mmp2，mmp3，mmp7，mmp9和mmp13蛋白水平的比较的图。

图12是显示来自图11的mmp9数据的图。

图13是显示在37℃下孵育24小时之前(基线水平)和之后的人血清样品中，活化的prp中和最终组合物中的il-1β水平的比较的图。

图14是显示在37℃下孵育24小时之前(基线水平)和之后的人血清样品中，活化的prp中和最终组合物中的tnf-α水平的比较的图。

图15是显示在37℃下孵育24小时之前(基线水平)和之后的人血清样品中，活化的prp中和最终组合物中的timp2水平的比较的图。

图16是显示在37℃下孵育24小时之前(基线水平)和之后的人血清样品中，活化的prp中和最终产物中的il-1ra水平的比较的图。

图17是显示在37℃下孵育24小时之前(基线水平)和之后的人血清样品中，活化的prp中和最终组合物中的pdgf水平的比较的图。

图18a是显示在17名测试患者中根据平均疼痛水平的womac指数的点值的图。提供了ca-和ca+组的基线和注射后1个月的值。

图18b是显示在17名测试患者中根据平均僵硬水平的womac指数的点值的图。提供了ca-和ca+组的基线和注射后1个月的值。

图18c是显示在17名测试患者中根据日常活动能力的平均水平的womac指数的点值的图。提供了ca-和ca+组的基线和注射后1个月的值。

图18d是显示在17名测试患者中视觉模拟疼痛量表(vas)的统计分析的图。提供了ca-和ca+组的基线和注射后1个月的值。

图19a是在用本公开的方法治疗之前患有银屑病的患者的手臂上的皮肤的照片。

图19b是在用本公开的方法治疗后三个月患有银屑病的患者手臂上的皮肤的照片。

具体实施方式

本公开涉及一种组合物，其包含自体抗炎/抗分解代谢组分和优选地自体富含血小板的血浆组分，其具有由具有协同抗炎/抗分解代谢、增殖、组织重塑和再生效应的生物活性蛋白富集的血清。

这样的组合物通常包括以下治疗活性蛋白：il-1ra⁶，il-4⁷，il-10^8,9，il-13¹⁰，pdgf¹¹，tgf-β^10,11和vegf^12,13,14,16。

il-1ra是由单核细胞，脂肪细胞和上皮细胞分泌的。该蛋白质的治疗有效浓度通过在约37℃下孵育人单核细胞约24h来获得¹⁷。il-4,10,13，pdgf，tgf-β是血小板和颗粒的内容，并且在prp组分中递送。il-4,10,13来自白细胞。pdgf由血小板产生，tgf-b由血小板和一些t细胞释放。利用所述蛋白质的协同效应导致产生有效的生物活性自体产物。因此，作为再生生物因子和抗炎细胞因子和生长因子来源的新鲜制备的prp和包含培养的自体血清作为il-1抑制剂来源的抗炎组分的组合提供了用于治疗退行性病况如骨关节炎，慢性肌腱变性和慢性肌肉撕裂以及皮肤炎症性病症的强大的和成本有效的自体治疗剂。

如本文所用，“治疗”包括姑息治疗，其中受试者的疼痛和/或炎症减轻。

令人惊奇的是，产生本文的抗炎/抗分解代谢组分的方法除了产生il-1ra之外，还导致产生增加水平的金属蛋白酶组织抑制剂(timp)。基质金属蛋白酶mmp在活性状态下被认为可引起关节破坏。timp中和活性mmp，从而提供与il-1ra协同的额外的抗分解代谢益处。

还令人惊奇的是，在制备本文的抗炎/抗分解代谢组分时，在约37℃至约39℃的温度下孵育患者血液约24小时之前加入柠檬酸钠可防止对关节具有分解代谢作用的病理学分子试剂诸如mmp9，il-1β和tnf-α的水平增加，但是不会导致抗分解代谢和再生剂如timp，il-1ra和pdgf的水平显著降低。

所述的用于产生治疗骨关节炎，慢性肌腱变性和慢性肌肉撕裂以及皮肤炎症性病症的自体组合物的方法优选包括通过无菌技术收集哺乳动物的自体生理流体，优选血液的步骤。优选地，哺乳动物是人。然而，本发明的组合物和方法也适用于广泛的兽医应用，例如用于治疗马，狗和骆驼。

静脉穿刺部位和收集管的表面可以用2％的碘酊溶液清洁。在开始对该部位进行任何清洁之前，可以询问患者对碘的任何过敏。管盖用70％的酒精溶液清洁，以避免血液收集前可能的污染。

组合物优选通过在优选约37℃至约39℃的温度下培养自体生理流体，优选血液来制备。然而，本领域技术人员将理解，血液可以在该范围之外的温度下孵育，例如约37℃至约40℃，并具有可接受的结果。最优选地，温度在37℃和38℃之间。将血液优选孵育约24小时以进行il-1ra细胞外富集并优选用于产生timp。优选地，将柠檬酸钠，优选以4％的浓度加入无菌玻璃管或聚苯乙烯管中，在孵育前将收集血液于其中。在特别优选的实施方案中，孵育可以在无添加剂的无菌玻璃管(coviden)或聚苯乙烯(bd)真空管(vacutainertube)中进行。在一个实施方案中进一步提供了在摇床平台(24rpm)上或在静态条件下孵育自体生理流体，优选血液。优选地，在静态条件下进行孵育，如图1所示。

优选地，血液的孵育在0.64-0.72mmca⁺⁺的存在下进行，以促进il-1ra产生¹⁵。在特别优选的实施方案中，以下是可能且有利的：通过在孵育前直接使用无菌注射器和针头将含有0.64-0.72mmca⁺⁺的无菌氯化钙溶液加入到具有血液的管中，以用所述溶液按1:9的比例稀释孵育的血液(1cc氯化钙溶液对9cc全血)(图2)。可以将等量的无菌空气加入到含有血液的无菌管中，以将血液暴露于大气空气中，用于增加il-1ra的产生(图2)。在特别优选的实施方案中，在孵育前，直接使用无菌注射器和针头使空气通过0.22μmmillexgp过滤器到达具有血液的管中。

优选地，在孵育之前，以9.5份全血(9.5cc)：0.5(0.5cc)优选4％柠檬酸钠的比例，将柠檬酸钠加入到血液中。4％柠檬酸盐优选为4％柠檬酸钠溶液。百分之四的柠檬酸钠溶液可容易地商购获得。

然后使孵育的血液进行离心以从细胞部分分离上清液组分。离心在约4000-10000rpm下进行约10-20分钟。优选地，以4000rpm进行离心10分钟。

下一步涉及吸出上清液并将其分成等分试样，以便将来使用无菌技术进行处理。该程序在无菌环境(具有hepa过滤器的层流罩)中进行。通过无菌注射器和针头小心地抽取含有生物活性剂的3cc上清液层。通过在约-20℃冷冻等分试样并在约-70℃下储存长达6个月或长达一年，可实现含有il-1ra的产物的长期储存。

然后，包含prp的再生组分的制备包括将血液抽入真空管。这优选在4％柠檬酸存在下进行。优选地，在9.5份全血(9.5cc)：0.5(0.5cc)的4％柠檬酸比率下。然后将血液在约7500rpm下进行离心优选约30秒以分离prp部分。在优选的实施方案中，将离心参数用于prp制备，作为用于骨关节炎和慢性肌腱变性治疗和皮肤病症的最终产品的一部分。在无菌条件下通过无菌注射器和针头吸取prp部分。在用于治疗慢性撕裂的特别优选的实施方案中，将白细胞血沉棕黄层部分加入到prp中作为另外的vegf源，以促进受影响部位中的新血管发育。在如上所述的全血离心之后通过无菌注射器和针头手动收集或使用市售的harvestsmartprep系统收集血沉棕黄层和血浆。包含prp的再生组分不进行冷冻或其它储存。在将再生组分与抗炎/抗分解代谢组分混合后，迅速将自体组合物施用给患者。

将含有包含il-1ra和优选地timp的抗炎/抗分解代谢组分的血液与包含prp部分的再生组分优选地以1:1的比例接触，以获得最终产物。

注射该产品用于将来由肌腱衍生的胶原蛋白¹⁸和组织来源的凝血酶的缓慢激活。

借助于以下说明性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1-比较不同培养条件下细胞外il-1ra的产生

如图1所示，比较不同时间点暴露于孵育条件(包括静止与摇动孵育)的人血清样品中il-1ra拮抗剂蛋白的水平。il-1ra由活化的血液单核细胞，巨噬细胞分泌。这种活化通过使用搅拌过程使血细胞与收集管的内表面之间接触来实现。通过增加暴露于细胞组分的内表面面积，可以使细胞活化过程和生物活性分子分泌最大化。

通过静脉穿刺在无菌条件下将来自10个健康的男性和女性志愿者供体(21至60岁)的外周血收集至无菌的10ml玻璃管中。根据没有孵育步骤的标准程序(对照样品)操作一个管。将样品在37℃下在摇动平台(24rpm)上搅拌和不搅拌下孵育3.5小时，7小时和24小时。将孵育的样品以4,000rpm离心10分钟，然后过滤，并根据制造方案(可从互联网上bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10014905.pdf获得)将il-1ra的最终浓度与未处理的对照样品的那些(0h)进行比较。单因素方差分析显示仅在孵育24小时后血清中il-1ra浓度显着增加；在3.5h和7h孵育的样品中没有观察到显着的il-1ra浓度增加。另外，在静止和摇动孵育条件之间没有观察到显着差异。使用magpixluminex^tm技术评价il-1ra浓度。

图2显示暴露于以下孵育条件下的人血清样品中il-1ra拮抗剂蛋白水平的比较：在空气，ca⁺⁺(磷酸盐缓冲盐水，pbs)和不同浓度的血清存在下孵育24小时。单向anova检验显示，除了在50％稀释的血液中培养以外，在所有所述条件下孵育24小时后，血清中il-1ra产生显着增加。

实施例2-诊断患有骨关节炎和慢性肌腱变性并用自体组合物治疗的患者的案例报告

方法和材料：

对于本文的每个患者，包含il-1ra和timp的自体组合物的抗炎/抗分解代谢组分通过以下步骤制备：从患者收集血液；将血液输送至管中；在约37℃至约39℃的温度下孵育所述血液约24小时；离心所述血液以将所述血液分离成上清液组分和细胞部分；以及收集抗炎组分的上清液组分。同样，自体组合物的再生组分通过以下步骤制备：从患者收集血液；将血液输送到存在约4％柠檬酸的管中；离心所述血液以从全血成分中分离富含血小板的血浆成分；收集富含血小板的血浆成分；以及将抗炎/抗分解代谢组分的上清液组分与富血小板血浆组分混合以提供自体组合物。然后向患者施用自体组合物。

案例1：s，61岁

诊断：患者报告了双侧起病隐匿的膝盖疼痛，其开始于几年前，并且在前6个月内加强。膝盖的mri显示膝盖的严重oa：内侧间室的严重的软骨病，涉及右膝关节的右侧和股骨髁的全层软骨损失的增加，以及涉及内侧股骨滑车的后侧的全层软骨损失与右膝的潜在水肿。一年前，患者服用了可的松注射液，其提供了1个月的缓解。体检：膝关节活动范围(rom)是完全的，所有韧带均正常，少量双侧积液神经血管检查(smallbilateraleffusionneurovascularexam)正常。vas为60。

治疗：将患者的局部自体组合物双侧注射到患者的膝盖三次，相隔一周。

结果：在首次双侧局部自体组合物注射后，患者报告显着改善，vas为3。在第三次注射时，rom是完全的，所有韧带均正常，无关节线疼痛，无积液。患者报告强烈疼痛减轻，vas为10，患者返回身体活动。三个月后，随访检查显示患者无疼痛。

案例2：e，64岁

诊断：活跃的男性在左髋部出现vas60。日常活动疼痛和远距离行走的显着的损伤。mri显示双侧髋部轻度oa：双侧髋关节退行性变和髋臼唇退行性撕裂。物理治疗在疼痛缓解方面取得的成功有限。

治疗：超声引导为患者制备的局部自体组合物注射进入左髋x2，相隔一周。

结果：在首次注射局部自体组合物后，患者报告疼痛改善了85％(患者个人评估)。第二次注射局部自体组合物后，vas为10。五个月后vas也为10。

案例3：a，70岁

诊断：患有慢性疼痛(vas为6)的女性患者左膝压痛和肿胀。她在步行，站立和爬楼梯方面有很大困难。她去过一名物理治疗师(6次访问)，一名脊椎按摩师(6次访问)帮助她的膝盖疼痛，没有结果。mri显示左膝重度oa，由于内侧股骨髁和内侧胫骨平台的承重部分全层软骨损失导致内侧间室狭窄。

治疗：制备局部自体组合物并注射入左膝三次，相隔一周。

结果：用局部自体组合物治疗后5个月随访时：患者报告症状改善约80％，无肿胀；vas是20。

案例4：j，26岁，职业游泳者。

诊断：椎旁肌肉损伤后状态，慢性椎旁肌腱炎。患者抱怨椎旁肌肉疼痛。长期的物理治疗没有显示结果。后背rom是完全的，神经血管检查正常。在彩色多普勒图3a)中鉴定出右侧椎旁充血的区域，vas为80。

治疗：使用超声技术标记发炎区域，肌内注射自体组合物×4，相隔一周。

图3a和3b是多普勒超声图像，其在治疗前(图3a)和正常的治疗后状况下(图3b)显示右侧椎旁区域的充血。

结果：多普勒显示无炎症(图3b)，治疗后4个月vas是10。

案例5：s，18岁

诊断：右侧阿基里斯肌腱撕裂后的状态。患者抱怨阿基里斯肌腱插入疼痛：慢性阿基里斯肌腱炎和腱鞘炎。多普勒显示在该区域严重的腱内充血(图4a)。vas是60。

治疗：长期的物理治疗和脊椎按摩治疗没有显示任何积极的结果。制备自体组合物，并用超声波引导将其注射到肌腱中三次，相隔一周。

图4a和4b是显示以过度充血为特征的慢性阿基里斯肌腱变性(图4a，治疗前状态)的多普勒超声图像，其由自体组合物治疗解决(图4b，治疗后成像)。

结果：多普勒成像时没有显示充血(图4b)，注射后5个月随访评估vas为0。

实施例3-体外研究

通过静脉穿刺在无菌条件下将来自健康男性和女性志愿者供体(21至60岁)的外周血收集到10ml无菌玻璃管。根据标准程序操作一个管，不具有孵育步骤(对照样品)。将样品暴露于不同的孵育条件下，将来自每个样品的500μl血清用于测定。在4℃下将样品以10,000×g离心10分钟，然后分析以除去细胞碎片和聚集体。根据制造商的说明书(可在以下网址获得：bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10014905.pdf)在平底微量滴定板中进行使用magplex^tm珠粒的bioplexpro^tm人类细胞因子27-plex平板，人类timp磁性luminex^tm性能测定4-plex平板^tm(bio-rad实验室，加拿大，ltd)分析。

简言之，样品在样品稀释液中以1:4稀释。将标准品重构并以四倍稀释系列稀释。制备抗体偶联捕获珠粒并接种。在加入每个孔之前将珠粒溶液涡旋。洗涤板，手动进行所有洗涤步骤。首先，将洗涤溶液加入板中，随后用密封带覆盖。将板在振荡器上以1100rpm孵育30s，然后在300rpm下孵育1.5分钟。将板从振荡器中取出，并在磁体上孵育1分钟，然后弃去上清液。洗涤后，稀释的样品和标准品一式二份地加入孔中的珠粒。将板在振荡器上孵育30分钟，孵育和洗涤后，向每个孔中加入检测抗体30分钟。将板再次在振荡器上孵育，并且在另一洗涤步骤之后，向孔中加入链霉亲和素溶液10分钟。在最后的孵育步骤之后，将珠粒重新悬浮在测定缓冲液中，并使用xponenttm软件(luminexcorporation，austin，tx，usa)用magpixtm(luminexcorporation)读取该板。使用xponenttm软件分析结果。通过构建每个分析物的标准曲线来确定样品的绝对浓度。

统计分析：使用graphpadprism^tm版本5.01进行所有统计检验。使用方差分析(anova)与bonferroni验后检验进行统计学比较，以进行组间比较。分析实验数≥3，数据显示为平均值±s.e.m.，p<0.05。

图5是显示在37℃孵育24小时之前(基线水平)和之后人血清样品中timp1，timp2和timp4(mmps拮抗剂)蛋白水平的比较的图。双因素anova测试显示孵育后24小时timp1和timp2水平显着升高。

图9是显示未处理的人血清样品中pgdf的平均浓度水平与24小时孵育样品中pgdf的平均水平之间的比较的图。测试数据分析显示处理样品中pgdf蛋白浓度的统计学显着增加。使用magpixluminex^tm技术评估pdgf浓度。

实施例4–经膝骨关节炎关节疼痛治疗的患者的结果

8例患者接受膝骨关节炎关节疼痛症状治疗。根据实施例2中概述的程序，给予患者四次注射局部自体组合物，间隔一周。

患者在接受注射后用视觉模拟疼痛量表(vas)和西部安大略和麦克马斯特大学关节炎指数(womac)问卷调查进行评估，以评估髋关节和/或膝关节骨关节炎患者的疼痛，僵硬度和身体功能。womac问卷数据的分析显示，在长时间(多达3个月)内，患者的日常活动有统计学意义的显着改善，但是在疼痛和僵硬度参数方面没有统计学意义的显著改善但具有正面动态的改善，如图7所示。视觉模拟疼痛量表的统计学分析显示在第三次注射后疼痛显着减轻，如图6所示。

图6是一个条形图，其显示根据8个患者的vas量表的平均基线和注射后关节疼痛的比较。结果显示疼痛平均减少统计学显着，效果稳定多达3个月。

图7是根据womac指数对8名患者的疼痛，僵硬度和日常活动能力平均水平的点值的图。提供了基线、注射后(注射后两个月和三个月)的数值。

图8显示了八名患者的曲线图形式的结果，其提供了在第一次，第二次，第三次注射后，在第四次注射后两个月和三个月的分类平均结果。

在图6-8中显示的结果是8名测试患者的平均结果。

实施例5-在孵育之前加入柠檬酸钠(ca)在制备抗炎/抗分解代谢组分中的作用

测试15名患者，以确定在血液孵育约24小时之前在患者血液中添加柠檬酸钠(ca)对抗炎组分中和最终产物中(其是抗炎组分和再生或prp组分的组合)的mmp(包括mmp9，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf)的水平的影响。

术语“血液”和“血清”在下面的讨论中可以互换使用。

方法和材料：

对于此处的每个患者，如下制备抗炎/抗分解代谢组分。从患者收集约9.5cc的血液。然后将约9.5cc血液递送到含有约0.5cc盐水溶液的第一管中。盐水溶液含有约0.9％的nacl。另外从患者收集约9.5cc血液，并递送至含有约0.5cc4％柠檬酸钠的第二管。收集血液后，将第一管和第二管在约37℃至约39℃的温度下孵育约24小时。然后将第一管和第二管离心以将每个管中的血液分离成上清液组分和细胞部分。分别收集第一管和第二管的上清液组分，以提供来自含有盐水的第一管的第一抗炎/抗分解代谢组分和来自含有柠檬酸钠的第二管的第二抗炎/抗分解代谢组分。对于每个患者，通过以下方式制备再生组分：从患者收集血液；将血液递送到存在约4％柠檬酸的管中；并离心血液以将富含血小板的血浆组分与全血组分分离。对于每个患者，收集富含血小板的血浆组分并分别与第一管和第二管的上清液组分混合以提供来自含有盐水的第一管的第一最终产物和来自含有柠檬酸钠的第二管的第二最终产物。

对于每个患者，在抽血后立即测量mmp2，mmp3，mmp7，mmp9，mmp13，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf的基线水平。对于15名患者中的每一名患者，在孵育后约24小时，在含有盐水和患者血液的第一管中测量了mmp9，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf的水平。类似地，对于15名患者中的每一个，在孵育后约24小时，在含有柠檬酸钠和患者血液的第二管中测量了mmp9，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf的水平。对于每个患者，将富含血小板的血浆组分与凝血酶混合，然后测量mmp9，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf的水平。对于每个患者，在第一和第二最终产物的每一个中测量了mmp9，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf的水平。在图10-17中以图形显示的测量结果表示所测试的十五名患者的平均值。

在测试的十五名患者中，在孵育0小时时天然血清(血液)中的il-1ra的平均水平测量为9±4pg/ml。在由抗炎/抗分解代谢组分与再生或prp组分组合产生的最终产物中，天然血清(血液)中il-1ra的平均测量值为920±80pg/ml。无论是向抗炎/抗分解代谢组分中加入柠檬酸钠，还是没有添加柠檬酸钠，都是这种情况。

在测试的十五名患者中，在孵育0小时时天然血清(血液)中pdgf的平均水平测量为1100±300pg/ml。在由抗炎/抗分解代谢组分与再生或prp组分组合产生的最终产物中，天然血清(血液)中pdgf的平均测量值为1920±380pg/ml。无论是向抗炎/抗分解代谢组分中加入柠檬酸钠，还是没有添加柠檬酸钠，都是这种情况。

在测试的十五名患者中，在孵育0小时时天然血清(血液)中的timp2的平均水平测量为1800±150pg/ml。在由抗炎/抗分解代谢组分与再生或prp组分组合产生的最终产品中，天然血清(血液)中timp2的平均测量值为5500±360pg/ml。无论是向抗炎/抗分解代谢组分中加入柠檬酸钠，还是没有添加柠檬酸钠，都是这种情况。

在这些图中，血清0h是收集后立即测量的患者血液中分析物水平的基线测量。血清24h+0.5cc盐水是在孵育24小时后与盐溶液混合的患者血液中分析物的水平。血清24h+0.5ccca是在孵育24小时后与4％柠檬酸钠溶液混合的患者血液中分析物的水平。prp+凝血酶是与作为凝血剂的凝血酶组合的prp组分中的分析物的水平。该测量显示prp组分中分析物的基线水平。prp+血清+凝血酶或prp+血清24h+凝血酶是由抗炎/抗分解代谢组分与再生或prp组分组合产生的最终产物中分析物的水平，其中抗炎/抗分解代谢组分仅用盐水制成，不含柠檬酸钠。prp+血清+ca+凝血酶或prp+血清24h+ca+凝血酶是由抗炎/抗分解代谢组分与再生或prp组分组合产生的最终产物中分析物的水平，其中抗炎/抗分解代谢组分用柠檬酸钠制备。

在制备如实施例2的方法中所述的抗炎/抗分解代谢组分时，观察到该组分的产生导致孵育步骤后il-1ra(抗炎剂)，timp(抗分解代谢剂)和pdgf(再生剂)的水平增加。产生自体生物活性组合物的方法是基于活化血液单核细胞分泌阳性生物活性分子的能力。然而，现在已经确定，相同的免疫细胞在其活化时不选择性地产生病理分子试剂及其抑制剂。因此，自体生物活性组合物还含有升高浓度的分解代谢分子如mmp9。这通过在盐水存在24小时下将患者血液在约37℃至约39℃下孵育约24小时后制备的抗分解代谢组分中的四种mmp类型的定量测量来确认，如图10所示。尽管mmp2,3,7,13的浓度在孵育后没有发现显着改变，然而对于骨关节炎的发病机理最为关键mmp9的浓度显着增加，如图10所示。单因素anova检验显示在孵育后24小时mmp9水平有统计学意义的显著升高。

自体生物活性组合物中增加的mmp9浓度的存在可能导致在患者治疗过程中的不良反应表现。因此，期望选择性地消除该负面成分。抗凝剂柠檬酸钠的存在显着下调人血白细胞的mmp9释放¹⁹。在柠檬酸钠(ca)以9.5cc血液：0.5cc柠檬酸钠的比例存在下的人血液在约37℃至约39℃的温度下孵育24小时，发现强烈的动态变化，特别表现在mmp9分泌中，如图11和12中所示。特别地，在制备抗炎/抗分解代谢组分时添加柠檬酸钠显着降低了由抗炎/抗分解代谢组分与再生组分组合的最终产物(凝血酶活化的prp+24h血清)中的mmp9浓度。当在制备抗炎/抗分解代谢组分时加入柠檬酸钠，与基线水平(0h)相比，24h孵育后的mmp9水平没有变化。进行具有凝血酶的prp组分中的mmp9水平的测量，以显示prp组分中的mmp9的基线水平。该测定显示，在生成prp组分时不产生显着量的mmp9。

考虑到血液孵育过程导致促分解代谢分子mmp9的升高，在孵育的血清中和在由抗炎/抗分解代谢组分和再生组分的组合的最终产物(凝血酶激活的prp+孵育24小时的血清)中测试了其它病理分子试剂(即il-1β和tnf-α)的浓度。测试了柠檬酸钠对在孵育期间由活化白细胞释放的这些分子的影响。发现il-1β和tnf-α浓度在孵育时显着增加。如图13和14所示，通过在制备抗炎/抗分解代谢组分时添加柠檬酸钠可以有效阻止该影响。

参考图13，双因素anova检验显示，与先前的产品制备方法(prp+血清24h+盐水)相比，在柠檬酸钠存在下在约37℃至约39℃孵育24小时的血清中以及在最终产物(prp+血清24h+柠檬酸钠(ca)+凝血酶)中的il-1β浓度统计学显着地降低。如通篇所提及的，最终产物(prp+血清24h+ca+凝血酶)是抗炎/抗分解代谢组分和再生组分的组合。

参考图14，双因素anova检验显示，与以前的产品制备方法(prp+血清24h+盐水)相比，在柠檬酸钠存在下在约37℃至约39℃孵育24小时的血清中以及在最终产物(prp+血清24h+ca+凝血酶)中的tnf-α浓度统计学显着地降低。

为了评估在生物活性组合物制备过程中将柠檬酸钠添加到抗炎/抗分解代谢组分是否影响病理分子抑制剂，在类似的条件下测试timp，ii-1ra和pdgf浓度。没有观察到柠檬酸钠对timp，il-1ra和pdgf产生的负面影响，如图15,16和17所示。

参考图15，在37℃孵育24小时之前(基线水平)和之后进行人血清样品中，活化的prp和最终产物中timp2水平的比较。双因素anova检验显示，与之前的产品制备方法(prp+血清24h+盐水)相比，柠檬酸钠不降低在柠檬酸钠存在下的24小时孵育血清中和最终产物(prp+血清24h+ca+凝血酶)中的timp的浓度。

参考图16，双因素anova检验显示，与之前的产品制备方法(prp+serum24h+盐水)相比，柠檬酸钠不降低在柠檬酸钠存在下的24小时孵育血清中和最终产物(prp+血清24h+ca+凝血酶)中的il-1ra的浓度。

参考图17，双因素anova检验显示，与先前的产品制备方法(prp+血清24h+盐水)相比，柠檬酸钠不降低24小时孵育血清中以及最终产物(prp+血清24h+ca+凝血酶)中的pdgf浓度。

实施例6-患有膝骨关节炎关节疼痛的患者的治疗

根据本文所述的方法，对17例患者进行膝骨关节炎关节疼痛的症状治疗，如实施例2所述。两组患者每隔一周提供两次注射。第一组7名患者接受包含不存在柠檬酸钠(ca-)下制备的抗炎/抗分解代谢组分的产品。第二组10名患者接受包含存在柠檬酸钠(ca+)下制备的抗炎/抗分解代谢组分的产品。两种治疗方法并没有导致任何不良事件，并被发现是安全有效的。

患者接受西部安大略和麦克马斯特大学关节炎指数(womac)问卷调查，用于评估髋关节和/或膝关节骨关节炎患者的疼痛，僵硬度和身体功能。womac问卷数据的一个月注射后初步分析显示用含有柠檬酸盐(ca+)的抗炎/抗分解代谢组分治疗的患者的患者疼痛，僵硬度和日常活动具有统计学显着改善，分别如图18a，18b，18c所示。对于用不具有柠檬酸盐(ca-)的抗炎/抗分解代谢组分进行治疗的患者组，观察到所提及的参数的统计学上不显着但正面动态的改善，分别如图18a，18b和18c所示。视觉模拟疼痛量表(vas)的统计学分析显示，两组患者疼痛明显减轻，如图18d所示。

实施例7-慢性炎性皮肤疾病

在四周时间内对患有严重银屑病的59岁的女性患者进行实施例2的方法。通过将抗炎/抗分解代谢组分与富含血小板的血浆成分组合而产生的自体组合物在每周一次、四次分开注射自体组合物来施用给女性患者。治疗涉及整个病变部位的真皮内注射。治疗后4周观察到剧烈的视觉变化。结果在注射后三个月后稳定，具有消除银屑病的效果。图19是治疗前女性患者的手臂受影响区域的照片。图19b是第四次注射后三个月的女性患者手臂的受影响区域的照片。

在制备抗炎/抗分解代谢组分时添加和不添加柠檬酸钠的情况下，对患有慢性炎性皮肤疾病如特应性皮炎和慢性伤口的受试者进行实施例2的方法。慢性炎性皮肤疾病的严重程度降低。

实施例8-马、狗和骆驼

在制备抗炎/抗分解代谢组分时添加和不添加柠檬酸钠的情况下，对具有受损和/受伤结缔组织的马、狗和骆驼进行实施例2的方法。与受损和/受伤结缔组织相关的疼痛的严重程度降低。

虽然已经参照说明性实施方案描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于这些精确实施方案。在不脱离本发明的范围的情况下，可以对上述本发明的具体实施方案进行许多修改，变化和改编。权利要求的范围不应受到实施例中阐述的优选实施方案的限制，而应当给出与整个描述一致的最广泛的解释。

参考文献

1.fernandesjc,martel-pelletierj,pelletierjp.theroleofcytokinesinosteoarthritispathophysiology.biorheology.2002；39(1-2):237-46.

2.fredbergu,stengaard-pedersenk.chronictendinopathytissuepathology,painmechanisms,andetiologywithaspecialfocusoninflammation.scandjmedscisports.2008feb；18(1):3-15.

3.loelli,lundbergie.canmuscleregenerationfailinchronicinflammation:aweaknessininflammatorymyopathies？jinternmed.2011mar；269(3):243-57.

4.ritae,mirza,miliem.fang,1williamj,timothyj.koh.blockinginterleukin-1βinducesahealing-associatedwoundmacrophagephenotypeandimproveshealingintype2diabetes.diabetes.2013jul；62(7):2579–2587.

5.emingsa,kriegt,davidsonjm.inflammationinwoundrepair:molecularandcellularmechanisms.jinvestdermatol.2007；127:514.

6.dinarelloca.interleukin-1,interleukin-1receptorsandinterleukin-1receptorantagonist.intrevimmunol.1998；16(5-6):457-99.

7.mosmanntr,cherwinskih,bondmw,giedlinma,coffmanrl.twotypesofmurinehelpertcellclone.i.definitionaccordingtoprofilesoflymphokineactivitiesandsecretedproteins.jimmunol.1986apr1；136(7):2348-57.

8.brandtzaegp1,osnesl,r,gb,westvikab,kierulfp.netinflammatorycapacityofhumansepticshockplasmaevaluatedbyamonocyte-basedtargetcellassay:identificationofinterleukin-10asamajorfunctionaldeactivatorofhumanmonocytes.jexpmed.1996jul1；184(1):51-60.

9.clarkecj1,halesa,hunta,foxwellbm.il-10-mediatedsuppressionoftnf-alphaproductionisindependentofitsabilitytoinhibitnfkappabactivity.eurjimmunol.1998may；28(5):1719-26.

10.dewaalmalefytr,figdorcg,huijbensr,mohan-petersons,bennettb,culpepperj,dangw,zurawskig,devriesje.effectsofil-13onphenotype,cytokineproduction,andcytotoxicfunctionofhumanmonocytes.comparisonwithil-4andmodulationbyifn-gammaoril-10.jimmunol.1993dec1；151(11):6370-81.

11.alvarezrh1,kantarjianhm,cortesje.biologyofplatelet-derivedgrowthfactoranditsinvolvementindisease.mayoclinproc.2006sep；81(9):1241-57.

12.robertsab,flanderskc,kondaiahp,thompsonnl,vanobberghen-schillinge,wakefieldl,rossip,decrom-bruggheb,heineui,spornmb:transforminggrowthfactorbeta:biochemistryandrolesinembryogenesis,tissuerepairandremodeling,andcarcinogenesis.recproghormres44:157–197,1988

13.robertsab,heineui,flanderskc,spornmb:tgf-beta:majorroleinregulationofextracellularmatrix.annnyacadsci."structure,molecularbiologyandpathologyofcollagen".580:225–232,1990.

14.gospodarowicz,d.,abraham,j.a.,andschilling,j.isolationandcharacterizationofavascularendothelialcellmitogenproducedbypituitary-derivedfolliculostellatecells.proc.natl.acad.sci.usa86,7311–7315,1989.

15.hiratah,nagakurat,tsujiim,moritaa,fujisawak,uchidaa.therelationshipofvegfandpge2expressiontoextracellularmatrixremodellingofthetenosynoviuminthecarpaltunnelsyndrome.jpathol.2004dec；204(5):605-12.

16.pengh,usasa,olshanskia,hoam,gearhartb,coopergm,huardj.vegfimproves,whereassflt1inhibits,bmp2-inducedboneformationandbonehealingthroughmodulationofangiogenesis.jboneminerres.2005nov；20(11):2017-27.

17.poutsiakadd,clarkbd,vanniere,dinarelloca.productionofinterleukin-1receptorantagonistandinterleukin-1betabyperipheralbloodmononuclearcellsisdifferentiallyregulated.blood.1991sep1；78(5):1275-81.

18.fufad,shealyb,jacobsonm,etal.activationofplatelet-richplasmausingsolubletypeicollagen.joralmaxillofacsurg2008；66:684–90

19.mannellof.serumorplasmasamples？the"cinderella"roleofbloodcollectionprocedures:preanalyticalmethodologicalissuesinfluencethereleaseandactivityofcirculatingmatrixmetalloproteinasesandtheirtissueinhibitors,hamperingdiagnostictruenessandleadingtomisinterpretation.arteriosclerthrombvascbiol.2008apr；28(4):611-4.

这些参考文献的内容通过引用并入本文。