技术领域本发明属于生物医药领域，涉及苄氟噻嗪的新用途，具体涉及一种苄氟噻嗪的药物组合物及其对肝癌的治疗作用。
背景技术：
苄氟噻嗪即3-苄基-6-三氟甲基-7-磺酰氨基-3,4-二氢-2H-1,2,4-苯并噻二嗪-1,1-二氧化物。功效主治：1、水肿性疾病，排泄体内过多的钠和水，减少细胞外液容量，消除水肿。常见的包括充血性心力衰竭、肝硬化腹水、肾病综合症、急慢性肾炎水肿、慢性肾功能衰竭早期、肾上腺质皮质激素和雌激素治疗所致的钠、水潴留。2、高血压。可单独或与其他降压药联合应用。主要用于治疗原发性高血压。3、中枢性或肾性尿崩症。4、肾石症。主要用于预防含钙盐成分形成的结石。药理作用：1、对水、电解质排泄的影响。①利尿作用，尿钠、钾、氯、磷和镁等离子排泄增加，而对尿钙排泄减少。本类药物作用机制主要抑制远端小管前段和近端小管(作用较轻)对氯化钠的重吸收，从而增加远端小管和集合管的Na+-K+交换，K+分泌增多。其作用机制尚未完全明了。本类药物都能不同程度地抑制碳酸酐酶活性，故能解释其对近端小管的作用。本类药还能抑制磷酸二酯酶活性，减少肾小管对脂肪酸的摄取和线粒体氧耗，从而抑制肾小管对Na+、Cl-的主动重吸收。②降压作用。除利尿排钠作用外，可能还有肾外作用机制参与降压，可能是增加胃肠道对Na+的排泄。2、对肾血流动力学和肾小球滤过功能的影响。由于肾小管对水、Na+重吸收减少，肾小管内压力升高，以及流经远曲小管的水和Na+增多，刺激致密斑通过管-球反射，使肾内肾素、血管紧张素分泌增加，引起肾血管收缩，肾血流量下降，肾小球入球和出球小动脉收缩，肾小球滤过率也下降。肾血流量和肾小球滤过率下降，以及对亨氏袢无作用，是本类药物利尿作用远不如袢利尿药的主要原因。肝癌是常见的恶性肿瘤之一，临床上发现的肝癌大部分是中晚期。迄今为止，尚未见苄氟噻嗪的药物组合物与肝癌的相关性报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种苄氟噻嗪的药物组合物，该药物组合物中含有苄氟噻嗪和一种从草本中分离得到的结构新颖的天然产物，苄氟噻嗪和该天然产物可以协同防治肝癌。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，一种苄氟噻嗪的药物组合物，包括苄氟噻嗪、如上所述的化合物(Ⅰ)和药学上可以接受的载体。如上所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将党参的干燥根粉碎，用80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇取物用D101型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用70％乙醇洗脱10个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为60:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10～15个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。如上所述的化合物(Ⅰ)在制备防治肝癌的药物中的应用。如上所述的苄氟噻嗪的药物组合物在制备防治肝癌的药物中的应用。本发明的优点：本发明提供的苄氟噻嗪的药物组合物中含有苄氟噻嗪和一种从党参中分离得到的结构新颖的天然产物，苄氟噻嗪和该天然产物单独作用时，对肝癌的防治效果一般；二者联合作用时，对肝癌的防治效果显著提高，可以开发成防治肝癌的药物。本发明与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证分离方法：(a)将党参的干燥根(2kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(15L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用70％乙醇洗脱10个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为60:1(10个柱体积)、30:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和5:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1(10个柱体积)、5:1(8个柱体积)和2:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10～15个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(175mg，HPLC归一化纯度大于98％)。结构确证：HR-ESI-MS显示[M+H]+为m/z265.1755，结合核磁特征可得分子式为C16H24O3，不饱和度为5。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，500MHz)：H-3(2.62，m)，H-4(2.76，m，2H)，H-5a(2.02，m)，H-5b(1.41，m)，H-6(2.44，m)，H-7(3.23，d，J＝8.2Hz)，H-10a(2.36，d，J＝12.3Hz)，H-10b(2.11，d，J＝12.3Hz)，H-11a(4.33，m)，H-11b(4.21，m)，H-12(4.85，d，J＝4.7Hz)，H-13(0.93，d，J＝7.2Hz)，H-14(0.95，s)，H-15(1.06，s)，12-OMe(3.35，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，125MHz)：125.6(C，1-C)，133.5(C，2-C)46.8(CH，3-C)，24.7(CH2，4-C)，38.2(CH2，5-C)，24.8(CH，6-C)，56.2(CH，7-C)，212.4(C，8-C)，48.1(C，9-C)，29.6(CH2，10-C)，68.4(CH2，11-C)，105.9(CH，12-C)，16.2(CH3，13-C)，20.2(CH3，14-C)，26.4(CH3，15-C)，54.9(CH3，12-OMe)。红外波谱表明该化合物含有羰基(1748cm-1)。13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示有16个碳信号，包括四个甲基(一个甲氧基)，四个亚甲基(一个连氧碳)，四个次甲基(一个连氧碳)，以及四个季碳(两个烯烃碳和一个羰基碳)，以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为三环结构。1HNMR谱结合HSQC谱显示三个甲基质子信号δH0.93(3H，d，J＝7.2Hz)、0.95(3H，s)、1.06(3H，s)，一个甲氧基质子信号δH3.35(3H，s)，三组亚甲基质子信号δH2.76(2H，m)、2.02(1H，m)与1.41(1H，m)、2.36(1H，d，J＝12.3Hz)与2.11(1H，d，J＝12.3Hz)，一组连氧亚甲基质子信号4.33(1H，m)与4.21(1H，m)，三个次甲基质子信号δH2.62(1H，m)、2.44(1H，m)、3.23(1H，d，J＝8.2Hz)，一个连氧次甲基质子信号δH4.85(1H，d，J＝4.7Hz)。1H-1HCOSY谱中存在H-12/H-3/H2-4/H2-5/H-6/H3-13和H-6/H-7相关信号，同时HMBC谱中显示有H2-4与C-2，H-6与C-1，H-7与C-2，H2-10与C-1、C-2、C-8和C-14，H2-11与C-2、C-3和C-12，H-12与C-2和C-11，H3-13与C-5和C-7，H3-14与C-8、C-9和C-10，H3-15与C-9和C-10，12-OMe与C-12相关信号，通过上述NMR谱中的相关信息可以构建该化合物的连接方式，并且上述波谱数据表明该化合物为tremulane型倍半萜。HMBC谱中质子信号δH3.34与C-12的相关性表明C-12位连有一个甲氧基并形成缩醛结构。在tremulane型倍半萜中，H-6与H-7位一般为β构型，H3-14构型通常处是β位，H3-15构型为α位，在该化合物的NOE试验中体现的H-7与H3-14相关信号符合tremulane型倍半萜的构型关系。此外，NOESY谱中H-3与H3-13的相关信号暗示H-3为α构型。立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值一致。该化合物的化学式及碳原子编号如下：实施例2：对裸鼠肝癌移植瘤模型的防治作用1、材料和方法1.1细胞及动物实验室符合DB44/61-94清洁级标准(许可证号：粤监证字(2004C075号)。人肝癌细胞株Bel-7402来源于广州医学院微生物免疫学教研室。裸鼠(BALB/C-nu/nu)由南方医科大学实验动物中心(许可证号2014A078)提供，雄性，鼠龄4-6周，体质量20-25g，平均(23.28±1.62)饲养于SPF环境中。1.2试剂与样品苄氟噻嗪购自中国药品生物制品检定所。化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1。苄氟噻嗪、化合物(Ⅰ)及其组合物先用少量DMSO超声溶解，再用纯化水溶解稀释灌胃。1.3小鼠分组及模型制备移植瘤裸鼠动物模型复制：将冻存于液氮罐中肝癌细胞株Bel-7402取出，复苏，体外培养于RPM11640中，加入体积分数为0.1的小牛血清，青霉素10万单位/L，链霉素100mg/L，单层培养于CO2恒温孵育箱内，细胞为上皮样贴壁生长，每两三天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。用体积分数为0.1的小牛血清的RPM11640培养液稀释细胞至含瘤1×1010L-1，在裸鼠左前上肢腋窝皮下接种0.2mL。分组：24只接种肝癌细胞株的裸鼠单纯随机分成正常对照组、苄氟噻嗪组(10mg·kg-1)、化合物(Ⅰ)组(10mg·kg-1)、苄氟噻嗪与化合物(Ⅰ)组合物组【5mg·kg-1苄氟噻嗪+5mg·kg-1化合物(Ⅰ)】，共4组。所有裸鼠自接种肝癌细胞株第3天起开始灌胃给药，正常对照组为等量生理盐水灌胃，隔日1次，灌胃20次。停药1周后，脱颈处死：完整取出瘤块，检测瘤体质量。按以下公式计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100％。1.4微血管密度的测定采用二步法染色：标本经甲醛固定后，进行3um连续切片：将石蜡切片脱蜡至水：高压煮沸抗原修复3min，体积分数为0.03的H2O2室温孵育10min，滴加兔抗人第Ⅷ因子相关抗体，4摄氏度过液，滴加1：200生物素标记的羊抗兔IgG，37摄氏度孵育30min，二氨基联苯胺显色5min，以0.01mol/L磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白对照，以血管瘤为阳性对照。微血管密度的测定参照Clinicalimportanceofthedeterminationoftumorangiogenesisinbreastcarcinoma：muchmorethananewprognostictool的方法。在低倍视野下检查微血管染色情况：以新生血管内皮染为棕黄色为阳性判定标准，取癌巢间质血管最多的视野，在200倍视野下，按双盲法由3位观察者分别计数3个视野：观察染成棕色的单个细胞和细胞丛，并以此作为一个血管：血管腔和腔内红细胞不作为计数，如有肌层的血管或管腔>50着者应排除，取3人计数平均值作为该例的微血管密度。1.5裸鼠生存质量评价通过裸鼠精神状态、活动状况、对刺激的反应、体质量下降幅度、食欲和尿、便6项指标的观察,评价裸鼠生存质量和药物毒副反应。1.6统计学分析由本课题组应用SPSS11.0软件进行统计学处理，肿瘤抑制率、微血管密度均值采用F分析进行组间比较，P<0.05为具有统计学意义。2、实验结果2.1对肝癌移植瘤裸鼠生存质量的影响治疗方案结束时：苄氟噻嗪与化合物(Ⅰ)组合物组6只裸鼠均存活：苄氟噻嗪组和化合物(Ⅰ)组有5只存活，正常对照组只有4只存活。所有死亡裸鼠均已解剖排除了由于实验操作不当致死的可能，裸鼠死亡是由肿瘤本身恶化或药物毒副反应所致。苄氟噻嗪与化合物(Ⅰ)组合物组裸鼠精神状态、活动状况、对刺激的反应、体质量下降幅度、食欲和尿便等未见明显异常：其次为化合物(Ⅰ)组，再次为苄氟噻嗪组，最次为正常对照组2.2对裸鼠肝癌移植瘤的抑制作用与正常对照组比较，苄氟噻嗪与化合物(Ⅰ)组合物组对肿瘤抑制作用明显较强，表现为平均瘤质量减少(P＜0.01)，肿瘤抑制率较高(P＜0.01)；与正常对照组比较，苄氟噻嗪组、化合物(Ⅰ)组平均瘤质量减少(P＜0.05)，肿瘤抑制率较高(P＜0.05)；裸鼠肝癌移植瘤的形成得到抑制。结果见表1。2.3对肿瘤血管形成的影响与正常对照组比较，苄氟噻嗪与化合物(Ⅰ)组合物组对肿瘤抑制作用明显较强，表现为微血管密度降低(P＜0.01)；与正常对照组比较，苄氟噻嗪组、化合物(Ⅰ)组微血管密度降低(P＜0.05)；裸鼠肿瘤血管的形成得到抑制。结果见表1。表1对裸鼠肝癌移植瘤和肿瘤血管形成的影响上述结果表明，苄氟噻嗪、化合物(Ⅰ)、苄氟噻嗪与化合物(Ⅰ)组合物均能显著抑制肝癌移植瘤的生长，而且，苄氟噻嗪与化合物(Ⅰ)组合物的抑制效果比苄氟噻嗪、化合物(Ⅰ)单独抑制效果更好，可以开发成防治肝癌的药物。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。