本发明涉及包含神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)的分泌蛋白质组作为有效成分的用于治疗缺血性疾病或神经炎症疾病的组合物。
背景技术：
干细胞因其多分化能而被视为多种疾病的有希望的治疗候选物质。例如，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)具有可容易地获得及分离、促进血管生成、抑制炎症的许多营养因子等特性(非专利文献1)。间充质干细胞的这些特性被适用于治疗人类疾病的研究中。根据最近的研究，间充质干细胞在许多动物模型及人体临床治疗(专利文献2、专利文献3)中起到组织恢复的作用。在一些报道中提及了间充质干细胞在体外分化为包括神经细胞及星形胶质细胞(astrocyte)(非专利文献3)的神经系列的分化能力，但未提及这些被分化的细胞在体内起到哪些功能的明确证据。间充质干细胞的有益的效果为上述间充质干细胞被旁分泌(paracrine)机制诱导，而不是细胞替代，由此，间充质干细胞的移植(transplantation)可具有临时且有限的效果，而不是长时间持续的改善(非专利文献5)。
相反地，胚胎干细胞(embryonicstemcells，escs)可分化为来源于3个胚芽层(embryonicgermlayer)的所有特定细胞形态，并且具有强大的自我再生能力。值得注意的是，来源于胚胎干细胞的神经前体细胞(neuralprecursorcells，npcs)优选分化为包括神经细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞(oligodendrocyte)的神经系列的特定形态的细胞，因此可视为用于脑组织恢复的细胞源(cellsource)。这些细胞还分泌促进内源性神经前体细胞的生存及增殖的一些因子(非专利文献6)。但是，仍然未提及分化于胚胎干细胞的神经前体细胞或者神经前体细胞的培养液在完成疾病模型移植后如何起到改善功能的作用的内容。
逆分化干细胞是指通过基因导入/转录因子导入、化合物(chemical)处理、生长因子处理等的多种方式，通过逆分化过程将未保留多能性(pluripotency)的体细胞诱导成具有多能性的细胞，还被称为诱导多能干细胞(诱导多能干细胞：inducedpluripotentstemcell)(非专利文献7)。与胚胎干细胞进行比较，它们细胞在细胞的形态，培养方式，增殖速度，基因表达、染色体突变形态，多能性、在免疫缺陷小鼠中的形成畸胎瘤的能力等中呈现非常高的类似性。上述诱导多能干细胞的分化能力和胚胎干细胞类似，但是不知从诱导多能干细胞分化的npc或npc的培养液在疾病模型中怎样贡献于移植后功能的改善。
在本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部引入本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。
现有技术文献
非专利文献
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3.kopen,g.c.,prockop,d.j.,&phinney,d.g.(1999).marrowstromalcellsmigratethroughoutforebrainandcerebellum,andtheydifferentiateintoastrocytesafterinjectionintoneonatalmousebrains.proceedingsofthenationalacademyofsciences,96,10711-10716.
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7.takahashi,k.,tanabe,k.,ohnuki,m.,narita,m.,ichisaka,t.,tomoda,k.,andyamanaka,s.(2007).inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.cell131:861-872.
技术实现要素：
技术问题
本发明人为了开发缺血性疾病或神经炎症性疾病的根本的治疗方法而努力研究。其结果，确认了如下：作为不同于干细胞移植的接近方式，通过给药至神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)分泌蛋白质组(secretome)的病变部位来减少缺血性损伤部位并恢复神经功能，从而可有效地治疗缺血性疾病和因炎症而产生的神经损伤疾病等的退行性神经系统疾病，由此完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供用于治疗缺血性疾病或神经炎症疾病的组合物。
本发明的另一目的在于，提供缺血性疾病或神经炎症性疾病的预防或治疗方法。
根据如下的发明的详细说明、权利要求及附图进一步明确本发明的还有一目的及优点。
解决问题的方案
根据本发明的一实施方式，本发明提供包含神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)的分泌蛋白质组作为有效成分的用于治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物。
本发明者为了开发缺血性疾病和神经炎症性疾病的根本的治疗方法而努力研究。其结果，确认了如下：作为不同于干细胞移植的接近方式，通过给药至神经前体细胞分泌蛋白质组(secretome)的病变部位来减少缺血性损伤部位并恢复神经功能，从而可有效地治疗缺血性疾病和因炎症而产生的神经损伤疾病等的退行性神经系统疾病。
在本说明书所使用的术语“神经前体细胞的分泌蛋白质组”(secretome)是指在培养神经前体细胞的过程中从神经前体细胞分泌至外部(培养基)的蛋白质的集合体。
根据本发明的一实例，从多能性(万能)干细胞分化用于制备本发明的分泌蛋白质组的神经前体细胞。
在本说明书所使用的术语“干细胞”是在分化(differentiation)为形成组织的各细胞之前的步骤的未分化细胞的总称，具有根据特定分化刺激(环境)而能够分化为特定细胞的能力。不同于停止细胞分裂的已完成分化的细胞，干细胞的特征在于，可通过细胞分裂而生成(self-renewal)与自身相同的细胞，并具有如下的分化可塑性(plasticity)，即，若施加分化刺激，则分化为特定细胞，并且这种分化还可根据其它环境或其它分化刺激而分化为多种细胞。
在本发明所使用的干细胞为如下的多能干细胞(pluripotentstemcell)，即，可在体外无限增殖，并且可分化为来源于3种种类的所有胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的多种细胞。更具体地，上述多能干细胞为胚胎干细胞(embryonicstemcells)、诱导多能干细胞(ipscs，inducedpluripotentstemcells)、胚胎生殖细胞(embryonicgermcells)或胚胎癌细胞(embryoniccarcinomacells)。
胚胎干细胞来源于胚盘胞的内细胞团(icm)，胚胎生殖细胞来源于5～10周龄的生殖嵴(gonadalridge)的原始生殖细胞。
诱导多能干细胞为通过插入从非多分化能细胞(例如，体细胞)赋予多能性的特定遗传基因来人工制备的多能干细胞中的一种。诱导多能干细胞在干细胞遗传基因及蛋白质表达、染色体甲基化、倍增时间(doublingtime)、胚体形成、畸胎瘤形成、生存性嵌合体形成、杂交性及分化性等方面与多能干细胞(例如，胚胎干细胞)相同。
根据本发明的一实例，上述神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)为将多能性(万能)干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导多能干细胞)分化诱导为神经类细胞来形成的神经丛(neuralrosette)步骤前后的神经前体细胞。
根据本发明的一实例，上述神经前体细胞为多聚唾液酸神经细胞粘附分子(poly-sialylatedneuralcelladhesionmolecule)-阳性神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)。
根据本发明的另一实例，上述神经前体细胞为多聚唾液酸神经细胞黏附分子(psa-ncam，poly-sialylatedneuralcelladhesionmolecule)-阴性神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)。
上述多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性或阴性神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)可利用抗多聚唾液酸神经细胞粘附分子-抗体从神经丛分离，上述神经丛通过神经分化刺激由多能干细胞分化而成。上述术语“神经丛(neuralrosette)”是指人类胚胎干细胞的神经分化过程的初始步骤的神经干细胞，神经丛具有圆柱形的放射形态。上述神经丛由表达pax6及sox1等的初始神经外胚层(neuroectodermal)标记的细胞形成，并且可分化为神经细胞及神经胶质细胞。
上述神经分化刺激可通过本技术领域的常规实施方法实现分化，例如，可通过无血清培养基(tropepevetal.，neuron.30:6578(2001))，成纤维细胞生长因子(fgfs，fibroblastgrowthfactors)、细胞外因子(wnt)及视黄酸(ra，retinoicacid)等的成形素(morphogens)的处理(yingqletal.natbiotechnol.21:183186(2003))实现分化，但并不限定于此。
上述抗体可使用多克隆抗体或单克隆抗体。针对多聚唾液酸神经细胞粘附分子的抗体可通过本技术领域的常规实施方式制备，例如，可通过融合方法(kohlerandmilstein，europeanjournalofimmunology，6:511-519(1976))、重组dna方法(美国专利第4，816，56号)或噬菌体抗体库方法(clacksonetal，nature，352:624-628(1991)及marksetal，j.mol.biol.，222:58，1-597(1991))制备。针对抗体制备的普通过程已详细记载于harlow，e.andlane，d.，usingantibodies:alaboratorymanual，coldspringharborpress，newyork，1999；zola，h.，monoclonalantibodies:amanualoftechniques，crcpress，inc.，bocaraton，florida，1984；及coligan，currentprotocolsinimmunology，wiley/greene，ny，1991，上述文献作为参考引用在本说明书。例如，用于生成单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备可通过融合非凋亡化细胞株和抗体生成淋巴细胞来实现，在此过程中所需要的技术已被本发明所述技术领域的普通技术人员所公知，并且可容易实现。多克隆抗体可通过如下的方法实现，即，向适合的动物注射多聚唾液酸神经细胞粘附分子抗原，并从上述动物收集抗血清后，利用公知的亲和性(affinity)技术从抗血清分离抗体而获得。
在本说明书中，提及多聚唾液酸神经细胞粘附分子时所使用的术语“抗体”为针对多聚唾液酸神经细胞粘附分子的特异抗体，并与多聚唾液酸神经细胞粘附分子蛋白质特异性结合，不仅包括完整的抗体形态，还包括抗体分子的抗原结合片段。完成的抗体为具有2个整体长度的轻链及2个整体长度的重链的结构，各个轻链以二硫键的方式与重链相连接，抗体分子的抗原结合片段作为具有抗原结合功能的片段，包括fab、f(ab')、f(ab')2及fv。
为了分离利用抗体的多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞，可利用荧光激活细胞分选机(fluorescence-activatingcellsorters，facs)、磁性激活细胞分选机(magneticactivatedcellsorter，macs)及补体介导溶解(complement-mediatedlysis)方法。
根据本发明的一实例，上述分泌蛋白质组呈包含于在动物细胞培养基中培养神经前体细胞来获得的细胞培养液中的形态。即，在本发明的组合物可包含含有神经前体细胞的分泌蛋白质组的神经前体细胞的培养液。
根据本发明的一实例，在包含its(胰岛素-转铁蛋白-硒)及碱性成纤维细胞生长因子(bfgf，basicfibroblastgrowthfactor)的无血清动物细胞培养基中培养神经前体细胞后，可通过去除细胞来获得上述神经前体细胞的细胞培养液。在上述培养的过程中可利用传代培养的神经前体细胞，例如，通过在添加有n2、b-27和/或gem21的含碱性成纤维细胞生长因子的动物细胞培养基进行传代培养(例如，4传代以上)而获得的神经前体细胞。
上述培养基中的细胞的去除可使用离心分离、过滤等的普通的细胞分离方法实施。
只要是在培养神经前体细胞的过程中使用的普通培养基，则不对上述动物细胞培养基进行限制，例如可使用dmem/f12。
根据本发明的一实例，上述神经前体细胞由人类诱导多能干细胞分化而成，上述神经前体细胞的分泌蛋白质组包括如下的蛋白质：聚集蛋白(agrin)、膜联蛋白a5(annexina5)、基础免疫球蛋白(bsg，basigin)、二聚糖(biglycan)、钙调蛋白-3(calponin-3)、类共激活蛋白(coactosin-likeprotein)、丝切蛋白-1(cofilin-1)、胶原蛋白α-2、滞蛋白-3(cullin-3)、消去蛋白(destrin)、营养不良蛋白聚糖(dystroglycan)、肝配蛋白-b2(ephrin-b2)、输出蛋白-2(exportin-2)、埃兹蛋白(ezrin)、纤维连接蛋白、纤蛋白-1(fibulin-1)、卷曲相关(frizzled-related)蛋白质、半乳糖凝集素-3结合蛋白(galectin-3bindingprotein)、颗粒体蛋白(granulins)、生长/分化因子11(growh/differentiationfactor11)、触珠蛋白(haptoglobin)、血液结合素(hemopexin)、高速泳动族蛋白(highmobilitygroupprotein)b2、角蛋白(hornerin)、输入蛋白-9(importin-9)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin-likegrwothfactor-bindingprotein2)、狼疮la蛋白(lupuslaprotein)、巨噬细胞移动抑制因子(macrophagemigrationinhibitoryfactor)、中期因子(midkine)、膜突蛋白(moesin)、神经毡蛋白2(neuropilin2)、多效蛋白(pleiotrophin)、抑制蛋白-1(profilin-1)、dj-1蛋白(proteindj-1)、根蛋白(radixin)、分泌型卷曲相关蛋白-2(secretedfrizzled-relatedprotein-2)、胞裂蛋白-11(septin-11)、踝蛋白-1(talin-1)、睾丸蛋白聚糖(testican)、促胸腺生成素(thymopoietin)、转胶蛋白-3(transgelin-3)及波形蛋白(vimentin)。
根据本发明的一实例，上述神经前体细胞由人类胚胎干细胞分化而成，上述神经前体细胞的分泌蛋白质组包括如下的蛋白质：聚集蛋白(agrin)、膜联蛋白a2(annexina2)、吸引素(attractin)、二聚糖(biglycan)、血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin)、丝切蛋白-1(cofilin-1)、胶原蛋白α-1、冠蛋白-1x(coronin-1x)、皮西丁蛋白(dermicidin)、真皮乳头衍生蛋白12(derp12)、肝配蛋白-b3、外生骨疣样蛋白-2(exostosin-2)、埃兹蛋白(ezrin)、明胶-3结合蛋白、颗粒体蛋白(granulins)、生长分化因子11(growh/differentiationfactor11)、触珠蛋白(haptoglobin)、血液结合素(hemopexin)、高速泳动族蛋白b2、角蛋白(hornerin)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin-likegrwothfactor-bindingprotein2)、狼疮la蛋白、中期因子(midkine)、膜突蛋白(moesin)、复合型表皮生长因子样结构域蛋白8(multipleepidermalgrowthfactor-likedomainsprotein8)、巢蛋白-1(nidogen-1)、胸腺旁腺素(parathymosin)、抑制蛋白-2(profilin-2)、dj-1蛋白(proteindj-1)、分泌型卷曲相关蛋白-2、分泌粒蛋白(secretogranin)、踝蛋白-1(talin-1)、胸腺素β-4(thymosinbeta-4)、转化生长因子β诱导蛋白ig-h3(tgfbi，transforminggrwowthfactor-beta-inducedproteinig-h3)、转胶蛋白(transgelin)及波形蛋白(vimentin)。
在本说明书所使用的术语“治疗”是指：(a)抑制疾病、病症或症状的发展；(b)减轻疾病、病症或症状；或者(c)去除疾病、病症或症状。本发明的组合物起到抑制、去除或减轻缺血性疾病或神经炎症性疾病的症状的发展的作用。并且，本发明的组合物因其本身的特性还可作为缺血性疾病或神经炎症性疾病的治疗用组合物，并且还可以与其它抗缺血/抗炎症组合物同时给药而作为针对这些疾病的治疗辅助剂。在此，在本说明书使用的术语“治疗”或“治疗剂”包括“治疗辅助”或“治疗辅助剂”的意识。
在本说明书所使用的术语“缺血性疾病”是指如下的疾病，即，因伴随血管损伤的血液渗漏(bloodleakage)、栓塞(embolism)或梗塞(infarction)等而减少血流量，因而使血液供给被切断的组织坏死。
根据本发明的一实例，可通过本发明的组合物治疗的缺血性疾病选自由缺血性心脏疾病、心肌梗死、心绞痛、下肢动脉缺血性疾病、四肢远端缺血性疾病及缺血性脑血管疾病组成的组中。
在本说明书所使用的术语“缺血性心脏疾病”是指因向心脏供给血液的冠状动脉损伤、冠状动脉狭窄或被阻塞而减少流向心脏肌肉的血流并由此产生的疾病。更具体地，可通过本发明的组合物治疗的缺血性心脏疾病选自由心绞痛、心肌梗死症及心脏衰竭组成的组中。
在本说明书所使用的术语“缺血性脑血管疾病”是指因脑血管损伤、脑血管狭窄或被阻塞而使无法接受血流的脑组织损伤的疾病。更具体地，上述缺血性脑血管疾病为缺血性脑卒中。
在本说明书所使用的术语“神经炎症性疾病”是指因炎症反应而产生的神经组织的损伤所导致的疾病，更具体地，是指因炎症反应而产生的神经损伤性疾病及退行性神经类疾病。
根据本发明的一实例，可通过本发明的组合物治疗的神经炎症性疾病选自由阿耳茨海默氏病、帕金森病、亨丁顿舞蹈症、肌肉萎缩症、克雅氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、弥漫性路易体病、白质脑炎、颞叶癫痫及炎症性脊髓损伤组成的组中。在本发明中脊髓损伤以均包含炎症性脊髓损伤及外伤性脊髓损伤的意义来使用。
根据本发明的一例，在将来源于人类胚胎干细胞(esc)及来源于诱导多能干细胞(ipsc)的神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)的分泌蛋白质组给药到脑卒中实验模型(大脑中动脉闭塞(pmcao)模型)的情况下，当单次给药及多次给药时，与磷酸盐缓冲盐水组相比均显著诱发ed-1阳性细胞及gfap阳性细胞的减少(参照图8a～图8b及图9a～图9b)。即，分泌蛋白质组减少炎症反应，非激活(减少)小胶质细胞(microglialcell)(图8a～图8b)，非激活星形胶质细胞(astrocyte)(图9a～图9b)。
并且，本发明的分泌蛋白质组使由dcx基因表达的双皮质素(doublecortin)的表达增加，并增加阳性神经前体细胞(惨遭图10)。双皮质素为神经元迁移蛋白(neuronalmigrationprotein)。这种结果示出因给药分泌蛋白质组，在脑组织中活动了内源性神经干细胞(endogenousneuralstemcell)。
本发明的分泌蛋白质组增加α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)阳性血管的频度，这是指增加了新生血管(参照图11)。
如上所述的抗炎症、内源性干细胞的活动及新生血管的增加效果暗示本发明的来源于神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)分泌蛋白质组具有神经保护作用(neuroprotectiveeffect)功能。即本发明的神经前体细胞来源分泌蛋白质组呈现如上所述的效果，从而活动与神经炎症性疾病有关的治疗。
另一方面，本发明的多能性干细胞来源神经前体细胞的分泌蛋白质组具有与脊髓损伤有关的治疗效果。根据本发明的一实施例，在利用脊髓损伤模型的bbb测试(bbbtest)中，在来源于多能性干细胞(胚胎干细胞)的神经前体细胞的分泌蛋白质组注射组(injection)中，呈现优秀的行为恢复(参照图12)。认为诱导多能干细胞(诱导多能干细胞)在干细胞遗传基因及蛋白质表达、染色体甲基化、倍增时间(doublingtime)、胚体形成、畸胎瘤形成、生存性嵌合体形成、杂交性及分化性等方面与多能干细胞(例如，胚胎干细胞)相同，因此还具有如上述的与脊髓损伤有关的治疗效果。
在本说明书所使用的术语“给药”或“进行给药”是指，通过向对象体直接给药本发明的组合物的治疗有效量而在对象体的体内形成相同的量。并且，术语“进行给药”包括向病变部位注射本发明的有效成分(多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞或神经前体细胞的分泌蛋白质组)，因此术语“进行给药”和“进行注射”为相同的意识。
组合物的“治疗有效量”是指为了向待给药组合物的个体提供治疗效果或预防效果而所需的充分的提取物的含量，并且上述“治疗有效量”包括“预防有效量”。在本说明书所使用的术语“个体”无限制地包括人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴、黑猩猩、狒狒或猕猴。具体地，本发明的个体为人类。
本发明的组合物被制备为药物组合物的情况下，本发明的药物组合物包括药学上可接受的载体。包含在本发明的药物组合物的药学上可接受的载体作为制剂时通常利用的，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、半乳糖凝集素、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、食盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs，phosphatebufferedsaline)或培养基等，但并不限定于此。
除了上述成分以外，本发明的药物组合物还可包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。适合的药学上可接受的载体及制剂详细地记载于remington'spharmaceuticalsciences(19thed.，1995)。
本发明的药物组合物可实施口服或非口服给药，具体地，可以是非口服给药，更具体地，可以是肌肉内(intramuscular)给药、脑室内(intracerebroventricular)给药、伤口(损伤)部位给药、脊髓或脊髓腔(intrathecal)给药或血管内(intravascular)给药。在血管内给药的情况下，可给药到动脉或静脉内。
本发明的药物组合物的适合的给药量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性等的因素开多种处方。
本发明的药剂学组合物可通过一次或多次来给药。例如，能够以依次或分割的容量向人类或其他动物多次给药。单一给药组合物可通过包含规定范围的量或相当于其一部分的含量来填充一日用量。即，本发明的治疗组合物能够以给药一次或多次的方式给药或以隔着规定时间的间隔(小时(hours)、天(day)、周(week)等)给药一次或多次的方式给药。
在本说明书中所使用的术语“用于一次给药”是指包含一次给药用量的分泌蛋白质组的组合物或以一次给药的形态给药的组合物的用途，“用于多次给药”是指包含多次给药用量的分泌蛋白质组的组合物或以多次给药的形态给药的组合物的用途。
根据本发明的一例，在向脑卒中动物模型给药一次本发明的来源于神经前体细胞(neuralprecursorcell，npc)的分泌蛋白质组的情况下，呈现缺血性病变部位减少，改善行为的效果(参照图1至图4)。
另一方面，在向脑卒中动物模型给药多次本发明的来源于神经前体细胞(neuralprecursorcell，npc)的分泌蛋白质组的情况下，还呈现缺血性病变部位减少，改善行为的效果(参照图6a至图6i及图7)。尤其，确认了如下：与单次给药相比，多次给药对行为改善发挥更高的治疗效果(图6a至图6i)、抗炎症效果也呈现得更高(参照图8a至图8b及图9a至图9b)，分泌蛋白质组的反复给药还显著增加内源性神经干细胞及新生血管的数量。
本发明的药物组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法并利用药学上可接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而可制备成单位容量形态或者以填充于大型容器内的方式制备。此时，剂型可以为油介质或水介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳液形态，并且还可以为浸膏剂、粉剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，而且还包括分散剂或稳定剂。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供缺血性疾病或神经炎症性疾病的预防或治疗方法，上述缺血性疾病或神经炎症性疾病的预防或治疗方法包括将包含(a)来源于神经前体细胞的分泌蛋白质组的治疗学有效量；以及(b)药剂学上接受的载体的组合物给药到对象的步骤。
本发明的方法利用上述的本发明的组合物，因此为了避免本说明书的过度复杂，省略它们之间的共同的记载内容。
发明的效果
对本发明的特征及优点进行概括如下。
(i)本发明提供包含神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)的分泌蛋白质组作为有效成分的用于治疗缺血性疾病或神经炎症疾病的组合物。
(ii)本发明的神经前体细胞的分泌蛋白质组因抗炎症、新生血管再生、内源性干细胞活动及增殖等作用，不仅减少缺血性损伤部位，而且恢复神经功能，可用作如因缺血性疾病和炎症所产生的神经损伤疾病等退行性神经类疾病的治疗剂。
(iii)并且，在多次给药的情况下，本发明的神经前体细胞的分泌蛋白质组的行为改善效果非常优秀于一次性给药。
附图说明
图1示出磷酸盐缓冲盐水对照组、培养基对照组及来源于人类胚胎干细胞(胚胎干细胞)的神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc；)的分泌蛋白质组处理组的缺血性病变部位的大小。
图2示出磷酸盐缓冲盐水(pbs)对照组、培养基对照组及分泌蛋白质组处理组的体重变化。
图3a、图3b、图3c、图3d示出磷酸盐缓冲盐水对照组、培养基对照组及分泌蛋白质组处理组的行为分析结果。图3a示出平衡木试验结果，图3b示出抓握牵引试验结果，图3c示出前肢踩空试验结果，图3d示出各单位时间的行为活跃度的线截面(linecross)结果。
图4为示出磷酸盐缓冲盐水对照组、培养基对照组及分泌蛋白质组处理组的综合行动神经改善效果(改良神经功能评分)分析结果。
在图1至图4中，*p值(value)<0.05，**p值<0.01。
图5表示用于确认来源于人类诱导多能干细胞(诱导多能干细胞)-来源于神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)分泌蛋白质组的多次给药效果的实验时间表。为了确认基于来源于神经前体细胞的分泌蛋白质组的存在于脑组织的内源性神经干细胞(enogenousneurlastemcell)的活动(mobilization)，注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(brdu)。
图6a至图6i表示来源于多能干细胞-来源于神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)分泌蛋白质组的单次给药相对(vs.)4次给药的实验结果。6a示出改良神经功能评分(mnss，modifiedneuralsibiarityscore)；6b示出上体姿态(torsotwisting)检测(左侧)；6c示出上体姿态(torsotwisting)检测(右侧)；6d示出前肢踩空试验(foot-faulttest)；6e示出线截面(linecross)检测；6f示出站立(rearing)检测；6g，平衡木(beambalance)检测；6h示出抓握牵引试验(prehensiletractiontest)；图6i示出对照组及分泌蛋白质组处理组的体重变化。站立是指实验动物利用后脚站立抬起前脚的姿势，是在正常的动物中探索好奇心时的普通行为，以每单位时间的次数来表示。
在图6a至图6i中白色：对照组、黑色：培养基对照组、黄色：分泌蛋白质组1次处理组(secretome-s)、红色：分泌蛋白质组4次处理组(secretome-m)、*p值(pvalue)＜0.05、**p值＜0.01、***p＜0.001。
图7示出磷酸盐缓冲盐水对照组、培养基对照组、分泌蛋白质组单次处理组(secretome-s)及分泌蛋白质组的多次处理组(secretome-m)的缺血性病变部位的大小。
图8a至图8b示出来源于神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)的分泌蛋白质组的反复给药(secretome-m)诱发显著减少ed-1阳性细胞的减少。比例尺：200μm、*p＜0.001。
图9a至图9b示出来源于神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)的分泌蛋白质组的反复给药(secretome-m)诱发显著减少胶质纤维酸性蛋白(gfap)细胞阳性细胞的减少。比例尺：200μm、*p＜0.05以及***p＜0.001。
图10示出因来源于神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)的分泌蛋白质组的反复给药(secretome-m)引起的在大鼠脑组织中的内源性神经干细胞(endogenousneuralstemcell)的活动。比例尺：500μm。
图11示出来源于神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)的分泌蛋白质组的反复给药(secretome-m)显著增加α-平滑肌肌动蛋白阳性血管的数量。*p＜0.005。
图12示出在脊髓损伤模型中将bbb测试(bbbtest)进行8周以上，来与无处理对照组进行比较时，在分泌蛋白质组注射组(injection)中呈现优秀的行为恢复(p＜0.05)。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，这些实施例仅用于更具体地说明本发明，并且根据本发明的主旨，本发明的保护范围并不限定于这些实施例。
实施例
实验材料及实验方法
来源于人类胚胎干细胞或来源于人类诱导多能干细胞的npc及多聚唾液酸神经细胞黏附分子-阳性npc细胞的获得
人类细胞的使用受到医学研究伦理审查委员会(institutionalreviewboard，irbno.4-2008-0643)的批准。为了神经诱导，在没有碱性成纤维细胞生长因子的人类胚胎干细胞培养基(invitrogen)上，在包含5μm的游离碱(sigma,st.louis，mo)及5～10μm的sb431542(calbiochem，sandiego，ca)的悬浮液培养来源于人类胚胎干细胞和ipsc的各类胚体(embryoidbodies，ebs)4日后，在投入20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子的1xn2(invitrogen)培养基中5日左右吸附于包被基质胶的培养皿(bdbiosciences，bedford，ma)(kim，d.s.，lee，d.r.，kim，h.s.，etal.(2012).highlypureandexpandablepsa-ncam-positiveneuralprecursorsfromhumanescandipsc-derivedneuralrosettes.plosone，7，e39715)。利用玻璃吸管从周边的扁平细胞小心地分离出现在所吸附的eb菌落的中心的神经丛。在涂敷有基质胶的培养皿使小丛块进行煮沸，并在投入1xn2、1xb27(invitrogen)的dmem/f12进行培养(kim，d.s.，lee，j.s.，leem，j.w.，etal.(2010).robustenhancementofneuraldifferentiationfromhumanesandipscellsregardlessoftheirinnatedifferenceindifferentiationpropensity.stemcellreviewsandreports，6，270-281)。
在获得由80～90％合流的被扩增的神经丛形成的神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)后，在10μm的y27632(sigma)暴露1小时，来防止在进行磁性激活细胞分选机步骤之前发生细胞凋亡的现象。在利用accutase(invitrogen)完成分离后，在包含1％的牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲盐水使细胞(～1×108cells)成块，并与结合有微珠(miltenyibiotec)的抗多聚唾液酸神经细胞粘附分子抗体以同在4℃的温度下培养15分钟。在集中清洗完毕后，将细胞悬浮液放入免疫磁珠分选机(masc，magneticactivatedcellsorting)，并用管洗脱残留在色谱柱的标记阳性的细胞。将所分离的多聚唾液酸神经细胞黏附分子-阳性神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)以4～5×105cells/cm2的浓度重新放置于添加有n2b27培养基或20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子的nbg培养基(补充1×n2、0.5×b27及0.5×g21)(geminibio-products，westsacramento，ca)。培养培养基每天进行更换，细胞按2～3日进行传代培养。
在来源于人类多能性胚胎干细胞(胚胎干细胞)的神经前体细胞(npcs)中分泌蛋白质组(secretome)的分离
将从上述过程中获得的来源于人类多能性胚胎干细胞(胚胎干细胞)的神经前体细胞(多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞)放入基本培养液(dmem/f-12)，并投入n2(100x-最终浓度1x)、b-27(50x-最终浓度0.5x)及gem21(50x-最终浓度0.5x)的血清清除补充剂，添加碱性成纤维细胞生长因子(20ng/ml)，并在涂敷有基质胶(matrigel)的60mm培养皿反复培养4传代以上，在完成扩增后，在8～10个培养皿培养至填满约90％的细胞。在去除培养液后，以磷酸缓冲溶液清洗3次，向无血清基础培养液(dmem/f12)仅添加its(100x-最终浓度1x)和碱性成纤维细胞生长因子(20ng/ml)，并培养24小时。在对照组中，在无细胞的培养皿投入相同量的相同构成的培养液(向基础培养液添加相同量的its和碱性成纤维细胞生长因子)，在培养基培养24小时后，将回收的作为对照组使用。收集所有培养液进行离心分离(在800g进行30分钟)，在去除细胞的碎渣等后，立即冷冻于-70℃的冷冻箱，需要时通过解冻来使用。
在来源于人类多能性诱导多能干细胞(诱导多能干细胞)的神经前体细胞(npcs)中分泌蛋白质组(secretome)的分离
将p0的来源于人类诱导多能干细胞(ipsc)的神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)放入dmem/f-12的基本培养液，并投入n2、b-27及gem21的血清清除补充剂，添加碱性成纤维细胞生长因子，并在涂敷有基质胶的100mm培养皿反复培养p4传代，培养至填满约90％以上的细胞。在去除培养液后，以磷酸缓冲溶液清洗1次，来利用accutase酶从培养皿中分离细胞，然后利用磷酸盐缓冲盐水清洗2～3次。然后在不包含酚红的dmem基本培养液中仅添加胰岛素-转铁蛋白-硒(its)来以浮游状态培养24小时。作为培养液的对照组，在相同量的基本培养基中添加相同量的胰岛素-转铁蛋白-硒来在培养基中培养24小时而使用。收集所有细胞浮游的培养液进行离心分离(在1000g进行20分钟)，在去除细胞的碎渣等后，立即冷冻于-70℃的冷冻箱，需要时通过解冻来使用。
细胞的培养条件如下。
(1)细胞的基本培养条件-dmem/f-12、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20ng/ml、n2100x-最终浓度1x、b-2750x-最终浓度0.5x、gem2150x-最终浓度0.5x
(2)分泌蛋白质组(secretome)获得用培养条件-dmem/无酚红(phenolredfree)、胰岛素-转铁蛋白-硒100x-最终浓度1x
脑卒中模型的制备
为了检测对因局部脑缺血而产生的神经细胞损伤的神经细胞保护效果，而使用所应用的血管内缝合法(intraluminalsuturemethod)。作为zialonga(zealonga，etal，stroke.，1989，20，84-91)开发的方法的局部脑缺血模型与其他模型不同地具有临床上类似的优点。由于这些理由成为适合于针对缺血-再灌注(ischemia-reperfusion)的机理研究或者筛选多种药物的效果的模型。由于这些理由成为适合于针对缺血-再灌注(ischemia-reperfusion)的机理研究或者筛选多种药物的效果的模型。除了上述优点之外，还具有如下优点：利用探针可观察暂时性地闭塞大脑中动脉(middlecerebralartery)来再灌注的损伤和永久性地闭塞来持续的细胞损伤。根据脑血流量确定缺血性中心部(ischemiccore)和缺血性半影区(ischemicpenumbra)的差异，前者小于15％，后者小于40％。若闭塞10-20分钟，则在中心部中细胞散发性地死亡，若诱发1小时，则产生中心部位(core)，并使脑组织损伤变大，弱诱发2～3小时，则受到与永久性闭塞相似的损伤。
在循环一周后，使用呼吸麻醉机来对实验动物(雄性斯普拉-道来rat，体重250～300g)进行麻醉，作为麻醉剂使用异氟醚(isoflurane)。首先，在混合80％的n2o和20％的o2混合气中以5％的异氟醚对大白鼠诱导全身麻醉后，并以2～2.5％维持麻醉。为了制备脑卒中模型，在切开大白鼠的左侧颈部皮肤后，向内侧剥离颈及导出总动脉(commoncarotidartery)、外颈动脉(externalcarotidartery)及内颈动脉(internalcarotidartery)后，利用黑丝轻轻地扎住各个血管，并切断血流。切割一半程度的颈总动脉，通过切面对尼龙缝合线的末端进行烧烙，从而插入通过圆角处理来制备成0.40mm的25mm的4-0尼龙探针(probe)。将通过外颈动脉插入的尼龙探针经过内颈动脉插入并固定于大脑中动脉部位，在颈总动脉分枝插入约18～20mm程度后，堵住大脑中动脉的起始部，并用线固定，从而在永久关闭大脑中动脉后，重新缝合皮肤切开部位，并从麻醉中自然恢复。
在脑卒中模型通过脑动脉的分泌蛋白质组注射及行为实验：
a.来源于人类胚胎干细胞神经前体细胞(npc)的分泌蛋白质组注射
在诱发脑卒中1日后，对行为实验确立基线(baseline)，然后以与制备脑卒中模型相同的方式通过右侧外颈动脉向内颈动脉部位插入胰岛素针头，然后通过上述针头对分泌蛋白质组动脉注射0.2mg/kg(体积50μl)左右，对对照组给药相同体积的培养液或磷酸缓冲溶液(磷酸盐缓冲盐水)。在注射分泌蛋白质组液体后，观察动物的状态14日左右，在注射前检测1次体重，在注射后检测4次体重，并进行行为分析。
b.来源于人类诱导多能干细胞的神经前体细胞(npc)的分泌蛋白质组注射-多次给药
在诱发脑卒中1日后，对行为实验确立基线(baseline)，然后以与制备脑卒中模型相同的方式通过右侧外颈动脉向内颈动脉部位插入胰岛素针头，然后通过上述针头对分泌蛋白质组动脉注射0.7mg/kg(在300g的大鼠的情况下200μg，注射量而言，以与200μg体积相同的静脉注射(阴茎静脉(penilevein)给药))。在对照组中给药相同体积的培养液。与蛋白质分离相同，作为分泌蛋白质组的对照组，在相同量的基本培养基中以相同的量添加胰岛素-转铁蛋白-硒，来在培养器中培养24小时，然后作为对照组使用。在注射分泌蛋白质组液体后，观察动物的状态14日左右，在注射前检测1次(0天)，在注射后检测4次(3天、7天、10天及14天)体重，并进行行为分析。
c.行为实验
①上体姿态(torsotwisting)检测：为了试验被视为实验动物的大脑皮质和纹状体知觉的上体姿态，而检测不对称运动行为。
②平衡木(beambalance)检测：通过使实验动物在窄横梁上保持稳定的平衡姿态来评价总前庭运动功能(grossvestibulomotorfunction)。
③前肢踩空检测(foot-faulttest)：作为在运动过程中检测运动行为(motormovement)的调节(协同)和组合(综合)时使用的实验方法，踩空(foot-fault)是指动物的前爪或后爪未放错位置(misplace)或者爪子从栅板(gridbar)之间掉落的情况，踩空在撑场动物中不同寻常的对称。
④抓握牵引检测(prehensiletractiontest)：检测中的抓握牵引与否是通过实验动物可利用前爪挂在水平方向的绳索的能力来检测。抓握牵引试验是为了评价实验动物的肌肉强度而进行的。通过现有的方法进行上述试验。将铁棒(直径2cm，长度100cm)水平放置于海绵橡胶垫(厚度7.5cm)上方的70cm处。将实验动物的前爪放置于铁棒后，松开实验动物。使实验动物挂在铁棒5秒钟。通过计算掉下来所花费的时间和是否将后爪放在铁棒来如下的计算分数：0分-大鼠悬挂5秒钟且后爪没有掉下来，1分–大鼠悬挂5秒钟且后爪掉下来；2分-大鼠悬挂3～4秒钟，3分-大鼠悬挂0～2秒钟。
⑤旷场检测(open-fieldtest)：作为确认不同步行或多水准的检测，通过直接观察动物的行为模式和特性，来观察动物的活动性、情绪性及行为模式等。
⑥改良神经功能评分(modifiedneuralsibiarityscore)：作为通过上述的多种检测获得的运动、知觉、平衡、反应及情绪实验值的综合成绩，根据如下的基准计算分数(按每个个体合算分数来检测改良神经功能评分)。
-旷场检测(检测动物的情绪性、活动性、行为模式等)
无动作：3
1～20次：2
21～30次：1
30次以上：0
-抓握牵引检测(体力检测)
0～5秒：3
6～10秒：2
11～20秒：1
21秒以上：0
-平衡木检测(平衡知觉检测)
0分：1＝稳定的姿势
2＝抓住横梁的侧面略有晃动的程度
1分：3＝1只以上的爪子从横梁掉落的情况
4＝试图保持平衡而掉落的情况
2分：5＝未保持平衡，倒挂在横梁而掉落的情况
6＝在横梁上完全无法保持平衡而掉落的情况
-前肢踩空检测(运动协调能力)
0～5次：0
6～10次：1
11～20次：2
21次以上：3
-上体姿态检测(不对称运动行为)
0次：2
1～4次：1
5次以上：0
在诱发脑缺血14日后，以舒泰对大白鼠进行麻醉，并进行剖胸，然后，切开右心耳，并向左心室注入针头后，以利用泵向心脏灌注磷酸缓冲溶液的方式去除血液，并取出脑组织。以前囟(bregma)为基准将用于制备样品的组织切片包埋于石蜡，为了确认损伤的脑组织，而将脑组织切片染色于苏木精，在完成脱水后进行固定，利用数码相机拍摄幻灯片后，存储在电脑。使用图像分析程序(imagej)以如下的数学式1计算脑梗塞比率(％)。
数学式1
脑梗塞比率(％)＝(正常左半球的面积-脑梗塞部位的正常组织的面积)/正常左半球的面积×100
免疫组织化学分析及定量化
用4％的甲醛固定脑组织24小时左右，并用磷酸盐缓冲盐水清洗。为了制备石蜡截面，在递增乙醇对组织进行脱水，并包埋在石蜡。在显微镜用薄片切片机上以4mm厚度层切割包埋在石蜡的脑，在二甲苯进行10分钟脫石蜡化后，在递增酒精进行再水化。向截面处理1小时的10mm的柠檬酸后，添加含有磷酸盐缓冲盐水及0.5％的氚核x-100的5％的牛血清白蛋白溶液。然后，在4℃的温度下与与ed-1(abcam)(1：100)、双皮质素(dcx；abcam,1：100)、胶质纤维酸性蛋白(gfap；millipore,1：100)及α-平滑肌肌动蛋白(asma；abcam,1：100)有关的第一次抗体共同培养脑切片15～17小时。与第一次抗体共同培养过夜后，用磷酸盐缓冲盐水清洗切片，将切片与被荧光标记的作为第二次抗体(
分泌蛋白质组分析(secretomics)
在来源于人类胚胎干细胞的神经前体细胞的分泌蛋白质组和来源于人类ipsc的神经前体细胞的分泌蛋白质组中，分别以4～12％的梯度novexbis-tris凝胶(invitrogen)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)而完成分离后，以gelcordblue染色试剂(pierce)以无法看到蛋白质条带的方式对凝胶进行染色。按相同大小的10条带切割完成染色的凝胶，并以现有的方法胶内胰蛋白酶降解。
使用与纳米超高效(nanoultraperformance)液相色谱法(eksigenttechnologies)结合的lineartrapquadrupole(ltq)质谱仪(thermofinnigan)对通过胶内降解而制备的肽进行分析。具体地，将胰蛋白酶处理的肽适用于填有c18普通5微米大小的树脂的分析色谱柱(75微米×11cm)。在97％的溶液a(在蒸馏水添加0.1％的甲酸)使用60％的溶液b(向乙腈添加0.1％的甲酸)以流速为0.3微升/小时的条件进行分线性45分梯度。对所降解的肽离子以纳米电喷射离子(electrosprayionization，esi)源进行电动喷雾。在ms/ms谱中，按片段选择整个ms扫描，并以结果-依存扫描获得最多的5种谱。将针对动态排除的重复计数设定为1，将重复期间设定为30秒，将动态排除期间设定为180秒，将排除质量宽度设定为1.5da，将动作排除列表设定为50。
在ipi.humanv3.76数据库(89378项目)使用thermo-sequest算法(thermofinnigan)来检索肽及蛋白质的确认。在检索数据库后，利用scarffold2(proteomesoftware)确认完成确认的肽及蛋白质。在借助sequest检索出的肽中，选择具有0.95以上的肽预测(peptideprophet)的一组肽。并且，获得具有0.99以上的蛋白质预测(proteinprophet)盖然性及2个以上的固有肽的蛋白质列表。
脊椎损伤(spinalcordinjury：sci)模型制备、分泌物注射及行为恢复检测(bbbscoretest)
麻醉实验动物(雄性斯普拉-道来(sprague-dawley)大鼠、体重为250-300g)后进行去除脊椎骨椎板切除术(laminectomy))。利用nyu撞击器(nyuimpactor)，并利用10g的棒(rod)向露出的脊椎上掉下，从而诱发脊髓损伤(sci模型制备)。之后消毒好伤口后缝合皮肤。之后，以约3日的间隔再向静脉给药2次。注射分泌蛋白质组(secretome)后每1周进行bbb测试(bbbtest)。进行8周以上的bbb测试来与对照组进行比较。
统计分析
组之间的统计学显著水平利用适用tukey'scorrection的单向方差分析法(one-watanalysisofvariance，anova)来获得，将p值<0.05判定为统计学显著。
实验结果1：来源于人类胚胎干细胞(胚胎干细胞)的神经前体细胞的分泌蛋白质组
为了在脑卒中模型观察根据来源于人类胚胎干细胞神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)的分泌蛋白质组的疾病改善，而按如下的3个组进行了2周的实验。在诱发脑卒中24小时后，通过行为实验将确认完成疾病诱导的大白鼠随机分配成3个组后，向右侧外颈动脉注射分泌蛋白质组(0.2mg/kg，体积50μl)培养基或磷酸盐缓冲盐水。在注射各物质后，在3日、7日、10日及14日确认动物的状态和体重，并进行行为分析。
表1
缺血病变部位分析结果
在大白鼠中通过mcao的脑卒中的诱导引发了广泛的脑病变的损伤。在进过脑卒中诱导14日后，取出脑，并通过氯化三苯基四氮唑(ttc(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride))染色确认脑的损伤与否和损伤部位。ttc染色以与细胞内的正常线粒体氧化酶系统(mitochondrialoxidativeenzymesystem)发生反应的方式进行染色，若发生脑缺血损伤而损伤线粒体，则干扰氧化系统，从而未完成染色而显示白色，因此可区分脑的损伤部位。
如图1所示，因大脑中动脉闭塞而引发的损伤主要发生在右侧脑的皮质部位和纹状体部位(图1)。并且，神经前体细胞的分泌蛋白质组注射减少缺血性病变部位(infarctsize)。在磷酸盐缓冲盐水对照组损伤了将近右脑的60％，在培养基对照组损伤了46％左右，但分泌蛋白质组处理组的损伤部位为29％程度，与对照组相比，损伤部位明显减少了。
体重分析结果
由于脑卒中的诱发减少大白鼠的运动能力，而立即减少体重并持续到第7日，多种治疗剂通过运动能力的恢复诱导体重的增加。分泌蛋白质组的注射也与细胞移植相同地诱导体重增加(图2)。在神经损伤的恢复过程中最显著的现象为体重的恢复。与磷酸盐缓冲盐水对照组相比，分泌蛋白质组处理组出现明显的改善。
行为分析结果
与两个对照组相比，分泌蛋白质组处理组在平衡木试验中呈现统计学显著的行为改善效果，这种效果呈现从治疗3日开始发生改善等的即时性效果(图3a)。
并且，与两个对照组相比，在抓握牵引检测(prehensiletraction)中也从治疗(注射)7日开始呈现统计学显著的效果(图3b)。
而且，分泌蛋白质组注射呈现减少网兜中的失足(footfault)频度的效果(图3c)。在检测每单位时间的行为的活跃度的线截面(linecross)也呈现出改善趋势(图3d)。
综合行动神经改善效果(改良神经功能评分)分析结果
改良神经功能评分(modifiedneurologicalseverityscoretest)为用于检测神经学功能的结构表。按运动(肌肉状态)和知觉(mensory)(视觉、嗅觉及本体感觉(proprioceptive))项目进行评价。正常为0分，分数越高被判断为功能异常程度越严重。如图4所示，在改良神经功能评分的分析中，分泌蛋白质组处理组从治疗开始阶段呈现出明显高于磷酸盐缓冲盐水对照组和培养基对照组的治疗效果(行为改善)(图4)。
在改良神经功能评分检测中，在诱发脑缺血1日后，磷酸盐缓冲盐水对照组从平均5.4分变为14后的平均5.5分，由此可知，维持因脑卒中而产生的神经行为学障碍。在培养基对照组的情况下，临时性行为改善效果呈现在治疗后的第3日，但未发挥额外的改善效果。相反地，在分泌蛋白质组处理组的情况下，从治疗3日(改良神经功能评分4.5分)至10日(改良神经功能评分3分)呈现了持续的行为改善效果。
分泌蛋白质组分析结果
从来源于诱导多能干细胞的神经前体细胞获得的分泌蛋白质组包括聚集蛋白(agrin)、膜联蛋白a5(annexina5)、基础免疫球蛋白(bsg，basigin)、二聚糖(biglycan)、钙调蛋白-3(calponin-3)、类共激活蛋白(coactosin-likeprotein)、丝切蛋白-1(cofilin-1)、胶原蛋白α-2、滞蛋白-3(cullin-3)、消去蛋白(destrin)、营养不良蛋白聚糖(dystroglycan)、肝配蛋白-b2(ephrin-b2)、输出蛋白-2(exportin-2)、埃兹蛋白(ezrin)、纤维连接蛋白、纤蛋白-1(fibulin-1)、卷曲相关(frizzled-related)蛋白质、半乳糖凝集素-3结合蛋白(galectin-3bindingprotein)、颗粒体蛋白(granulins)、生长/分化因子11(growh/differentiationfactor11)、触珠蛋白(haptoglobin)、血液结合素(hemopexin)、高速泳动族蛋白(highmobilitygroupprotein)b2、角蛋白(hornerin)、输入蛋白-9(importin-9)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin-likegrwothfactor-bindingprotein2)、狼疮la蛋白(lupuslaprotein)、巨噬细胞移动抑制因子(macrophagemigrationinhibitoryfactor)、中期因子(midkine)、膜突蛋白(moesin)、神经毡蛋白2(neuropilin2)、多效蛋白(pleiotrophin)、抑制蛋白-1(profilin-1)、dj-1蛋白(proteindj-1)、根蛋白(radixin)、分泌型卷曲相关蛋白-2(secretedfrizzled-relatedprotein-2)、胞裂蛋白-11(septin-11)、踝蛋白-1(talin-1)、睾丸蛋白聚糖(testican)、促胸腺生成素(thymopoietin)、转胶蛋白-3(transgelin-3)及波形蛋白(vimentin)等的蛋白质。
从人类胚胎干细胞的神经前体细胞获得的分泌蛋白质组包括聚集蛋白(agrin)、膜联蛋白a2(annexina2)、吸引素(attractin)、二聚糖(biglycan)、血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin)、丝切蛋白-1(cofilin-1)、胶原蛋白α-1、冠蛋白-1x(coronin-1x)、皮西丁蛋白(dermicidin)、真皮乳头衍生蛋白12(derp12)、肝配蛋白-b3、外生骨疣样蛋白-2(exostosin-2)、埃兹蛋白(ezrin)、明胶-3结合蛋白、颗粒体蛋白(granulins)、生长分化因子11(growh/differentiationfactor11)、触珠蛋白(haptoglobin)、血液结合素(hemopexin)、高速泳动族蛋白b2、角蛋白(hornerin)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin-likegrwothfactor-bindingprotein2)、狼疮la蛋白、中期因子(midkine)、膜突蛋白(moesin)、复合型表皮生长因子样结构域蛋白8(multipleepidermalgrowthfactor-likedomainsprotein8)、巢蛋白-1(nidogen-1)、胸腺旁腺素(parathymosin)、抑制蛋白-2(profilin-2)、dj-1蛋白(proteindj-1)、分泌型卷曲相关蛋白-2、分泌粒蛋白(secretogranin)、踝蛋白-1(talin-1)、胸腺素β-4(thymosinbeta-4)、转化生长因子β诱导蛋白ig-h3(tgfbi，transforminggrwowthfactor-beta-inducedproteinig-h3)、转胶蛋白(transgelin)及波形蛋白(vimentin)等的蛋白质。
脊髓损伤治疗效果
制备脊椎损伤(spinalcordinjury：sci)模型，并分为5个位置直接向其损伤部分给药约30μl的来源于多能性干细胞(胚胎干细胞)的神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)的分泌蛋白质组(secretome)。之后，以隔约3天的间隔，以每次约200μg(200μl)的方式向静脉再给药两次分泌蛋白质组。针对于每周行为恢复根据脊椎损伤行为恢复测试方法进行评价。bbb试验法是在脊椎损伤研究人员中公知的试样法。进行8周以上的bbb测试，来与无处理对照组(control)进行比较时，在分泌蛋白质组注射组(injection)中示出优秀的行为恢复结果。
实验结果2：来源于人类诱导多能干细胞(诱导多能干细胞)的神经前体细胞的分泌蛋白质组+多次给药
为了在脑卒中模型中观察基于神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)分泌蛋白质组的单次及多次给药的疾病的改善，分为实行以下4个组进行2周的实验。实验时间表如图5。
表2
图6a至图6i表示来源于多能性诱导万能干细胞的神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)分泌蛋白质组的单次给药相对(vs.)4次给药的实验结果。可知几乎在全部条件下，分泌蛋白质组(secretome-m)4次处理组与其他组相比，发挥卓越的行为改善效果。即，确认了与单次给药组相比，多次给药组在行为改善中发挥显著的治疗效果。
体重分析结果
分泌蛋白质组单次处理组及分泌蛋白质组多次处理组与磷酸盐缓冲盐水对照组相比，在治疗第三天呈现显著的改善(图6i)。但是随着时间的经过组之间的体重差异失去了显著性。
行为分析结果
在上体姿态(torsotwisting)检测中，分泌蛋白质组多次处理组与其他组相比，在统计学上诱导了显著的作为脑损伤部位侧的左侧上体非对称运动的改善效果(图6b)。相反地，在作为非损伤侧的右侧上体非对称运动中，除了分泌蛋白质组多次给药组的10天之外未观察到统计学显著性(图6c)。
分泌蛋白质组反复给药呈现减少网兜中的失足(footfault)频度的倾向性，但是除了14天之外，与对照组未呈现统计学显著性(图6d)。在检测每单位时间的行为的活跃度的线截面(linecross)也由分泌蛋白质组的单次给药及多次给药呈现出改善趋势(图6e)。
在站立(rearing)分数中还确认了分泌蛋白质组的单次及反复给药与其他实验组相比诱导改善的倾向性(图6f)，在平衡木检测中，与两个对照组相比，分泌蛋白质组的多次给药在统计学上呈现显著的行为改善效果，这种效果呈现如治疗第三天呈现等及时的效果(图6g)。并且，还在抓握牵引检测(prehensiletraction)中，在治疗(注射)第七天与两个对照组相比呈现统计学上显著的效果(图6h)。
综合性行为神经改善效果(改良神经功能评分)分析结果
如图6a所示，在改良神经功能评分的分析中，分泌蛋白质组多次处理组从治疗初期开始呈现出明显高于磷酸盐缓冲盐水对照组和培养基对照组的治疗效果(行为改善)。分泌蛋白质组单次处理组也与对照组相比在实验期间发挥显著的治疗效力过，与培养基对照组相比呈现了优秀的行为改善效果。
缺血性病变部位分析结果
图7示出在大鼠脑中动脉闭塞(pmcao)模型中，经过14天的来源于神经前体细胞(neuralprecursorcell；npc)分泌蛋白质组的给药时对梗塞大小产生的大小。示出在磷酸盐缓冲盐水(control)、培养基对照组(blank)、来源于npc的分泌蛋白质组单次(secretome-s)或来源于神经前体细胞的分泌蛋白质组反复给药(secretome-m)的大鼠中，经过14天的治疗之后的典型的图像。示出在大鼠大脑中动脉闭塞模型中经过14天的来源于神经前体细胞的分泌蛋白质组的给药时对脑梗塞的大小产生的效果。当单次及多次给药时，与磷酸盐缓冲盐水组相比，均*p＜0.01。尤其，当多次给药分泌蛋白质组时，与培养基对照组(blank)相比确认了p＜0.05的显著的改善效果。
抗炎症效果-ed-1阳性细胞减少
图8a至图8b示出由来源于神经前体细胞的分泌蛋白质组的治疗同侧纹状体的ed-1阳性细胞的频度减少，并且分泌蛋白质组的反复给药显著诱发ed-1阳性细胞的减少。比例尺：200μm。在最少5个单独的显微镜区域下检测了ed-1阳性细胞的数量。以±标准误差表示检测值。当比较对照品(control)和分泌蛋白质组-反复给药组间时*p＜0.001。
抗炎症效果-胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的减少
图9a至图9b示出由来源于神经前体细胞的分泌蛋白质组的治疗同侧纹状体的胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的频度减少，并且分泌蛋白质组的反复给药显著诱发胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的减少。尤其，胶质纤维酸性蛋白的表达与培养基对照组(blank)相比，在分泌蛋白质组反复治疗组中还诱导了显著的减少。比例尺：200μm。在最少5个单独的显微镜区域下检测了胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的数量。以±标准误差表示检测值。当进行组之间的多重比较时时*p＜0.05及***p＜0.001。
内源性干细胞的活动效果
图10示出因分泌蛋白质组的反复给药引起的在大鼠脑组织中的内源性神经干细胞(endogenousneuralstemcell)的活动。在经过14天的分泌蛋白质组的给药后进行了试验。在大鼠的缺血性脑中观察到dcx(红色)阳性细胞。比例尺：500μm。
新生血管增加效果
图11示出因来源于神经前体细胞的分泌蛋白质组的治疗同侧纹状体的α-平滑肌肌动蛋白阳性血管的频度增加，并且分泌蛋白质组的反复给药显著增加血管的数量。在最少5个单独的显微镜区域下检测了α-平滑肌肌动蛋白阳性血管的数量。以±标准误差表示检测值。当比较对照品和分泌蛋白质组-反复给药(secretome-m)组间时，*p＜0.005。
如上所述地详细说明了本发明的特定部分，对于本发明所属领域的普通技术人员而言，这些具体技术仅是优选实例，本发明的范围并不限定于上述实例。因此，由所附的权利要求书和其等同替代物定义本发明的实际范围。