盐酸芬戈莫德在制备治疗系统性红斑狼疮脑病药物中的应用的制作方法

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及盐酸芬戈莫德在制备治疗系统性红斑狼疮脑病药物中的应用。

背景技术：

系统性红斑狼疮脑病（neuropsychiatric syndromes of systemic lupus erythematosus, NP-SLE）是SLE最严重的并发症，死亡率较高，是狼疮危象的主要死亡原因之一。NP-SLE的治疗包括对原发病的治疗以及对症治疗。对原发病的治疗一般采用鞘内注射地塞米松和甲氨蝶呤，这种治疗方法虽然可有效缓解症状，控制脑病的病情，但给药方法不够便捷，并且作为一种创伤性的治疗手段，存在一定手术风险，且不能预防性用药。因此，寻找一种同样具有疗效，但给药更方便，并能一定程度预防SLE患者发生脑病的药物势在必行。盐酸芬戈莫德FTY720是近年来新发现的一种新型免疫抑制剂，美国FDA已批准将其用于多发性硬化的治疗。近年来也有报道FTY720在治疗B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠狼疮肾炎中具有疗效，但其对狼疮脑病的治疗尚未见报道。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供一种盐酸芬戈莫德在制备治疗系统性红斑狼疮脑病药物中的应用，FTY720在改善B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠行为学症状方面的用药方案，可用于治疗系统性红斑狼疮脑病。

技术方案：盐酸芬戈莫德（FTY720）在制备治疗系统性红斑狼疮脑病药物中的应用。

治疗系统性红斑狼疮脑病药物，有效成分为盐酸芬戈莫德（FTY720）。

盐酸芬戈莫德（FTY720）在制备预防系统性红斑狼疮脑病药物中的应用。

预防系统性红斑狼疮脑病药物，有效成分为盐酸芬戈莫德（FTY720）。

有益效果：盐酸芬戈莫德（FTY720）可显著改善B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠的行为学症状，减少脑组织中神经元凋亡的数量，减轻脑组织炎症因子表达水平，减少脑中炎性细胞浸润，能保护血脑屏障完整性。本发明所用FTY720可口服给药，疗效显著，与传统的鞘内注射治疗方式相比，给药方式更为便捷，且不存在手术风险。

附图说明

图1为 FTY720对B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠摄食、饮水和行为学症状的改善示意图。 A图代表的是在摄食实验中，B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠摄食量降低，经过FTY720治疗后，摄食量回升；B图代表的是在饮水实验中，B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠饮水量降低，经过FTY720治疗后，饮水量有所回升；C图代表的是在悬尾实验中，B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠的平均静止时间较正常对照组显著增加，提示其具有抑郁倾向，而FTY720治疗后，小鼠的静止时间较未治疗组显著减少；D图是在旷场实验中，B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠自发活动的总距离显著低于正常对照组，提示其具有抑郁倾向，而FTY720治疗后，小鼠自发活动的总距离较未治疗组显著增加；E图代表的是在旷场实验中，B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠在中央区活动的总距离较正常对照组增加，行为异常，而FTY720治疗后，小鼠在中央区活动的总距离较未治疗组减少； F图代表的是在旷场实验中，B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠在中央区活动的总时间较正常对照组增加，提示其行为异常，而FTY720治疗后，小鼠在中央区活动的总时间较未治疗组减少。

图2为 FTY720减少B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中皮质、海马及杏仁核神经元的退行性凋亡示意图。 A图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠皮质、海马区和杏仁核区神经元凋亡均增加，而FTY720治疗后，小鼠脑组织皮质、海马区和杏仁核区神经元凋亡减少，与未治疗组相比显著改善；B图是皮质区神经元凋亡量化图，C图是海马区神经元凋亡量化图，D图是杏仁核区神经元凋亡量化图。

图3为 FTY720对B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中炎性因子表达的影响示意图。 A图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中TNF-α蛋白水平较正常对照组显著升高，而FTY720治疗后，小鼠脑组织TNF-α蛋白水平较未治疗组明显降低； B图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中IL-6蛋白水平较正常对照组显著升高，而FTY720治疗后，小鼠脑组织IL-6蛋白水平较未治疗组明显降低；C图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中IL-1β蛋白水平较正常对照组显著升高，而FTY720治疗后，小鼠脑组织IL-1β蛋白水平较未治疗组明显降低；D图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中TNF-α mRNA水平较正常对照组显著升高，而FTY720治疗后，小鼠脑组织TNF-α mRNA水平较未治疗组明显降低；E图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中IL-6 mRNA水平较正常对照组显著升高，而FTY720治疗后，小鼠脑组织IL-6 mRNA水平较未治疗组明显降低； F图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中IL-1β mRNA水平较正常对照组显著升高，而FTY720治疗后，小鼠脑组织IL-1β mRNA水平较未治疗组明显降低。

图4 为FTY720能够显著减少B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中中性粒细胞的浸润。A图代表的是通过髓过氧化物酶(MPO)对皮质、海马区和杏仁核区域中性粒细胞进行特异性染色；B图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织皮质区中性粒细胞增多，FTY720治疗后能够显著减少B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织皮质区中性粒细胞的浸润；C图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织海马区中性粒细胞增多，FTY720治疗后能够显著减少B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织海马区中性粒细胞的浸润；D图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织杏仁核区中性粒细胞增多，FTY720治疗后能够减少B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织杏仁核区中性粒细胞的浸润。

图5 为FTY720对B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织血脑屏障完整性具有保护作用示意图。A图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织白蛋白的表达水平较正常对照组显著升高，FTY720治疗后，白蛋白的表达水平较未治疗组显著下降；B图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织纤连蛋白表达水平较正常对照组显著升高，FTY720治疗后，纤连蛋白表达水平较未治疗组显著下降；C图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达水平较正常对照组显著升高，FTY720治疗后，MMP2、MMP9的表达水平较未治疗组显著下降；D图代表的是B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达水平较正常对照组显著升高，FTY720治疗后，ICAM-1、VCAM-1的表达水平较未治疗组显著下降。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

FTY720治疗改善B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠的行为学实验

1、方法：实验所需药品来源：FTY720购自Cayman Chemical公司，小鼠行为学实验采用旷场实验、悬尾实验和摄食实验。取8周龄左右的C57BL/6雌性小鼠及B6.MRL-Fas(lpr)/J雌性小鼠，分为3组：C57BL/6组、B6.MRL-Fas(lpr)/J组、B6.MRL-Fas(lpr)/J+FTY720组。其中B6.MRL-Fas(lpr)/J+FTY720组的给药方法为：从B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠8周龄开始给予1mg/kg/day FTY720灌胃，每周三次，其余两组用生理盐水代替，至20周左右进行摄食实验、饮水实验、悬尾实验和旷场实验，实验结果用SPSS统计软件分析。

2、结果：见图1，FTY720治疗后，B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠在旷场中的自发活动总距离增加，在中央区活动的距离减少，提示FTY720改善了B6.MRL-Fas(lpr)/J的异常行为学症状；在悬尾实验中平均不动时间减少，提示FTY720改善了B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠的抑郁症状。

3、步骤说明：

摄食、饮水实验

a.每只小鼠单独放在一个鼠笼里，将称重后的鼠粮、饮用水添加到鼠笼。

b.一周后，对鼠粮、饮用水进行称重，记录在鼠笼标签上。

悬尾实验

a.小鼠结束旷场实验后第二天进行悬尾实验，提前1小时转移至实验室内适应环境。

b. 用胶带将鼠尾连接到实验架上，将小鼠倒悬在隔音箱中。

c. 使用WinFast PVR软件拍摄小鼠6分钟内活动录像。

d. 使用TopScanLite软件分析录像并统计小鼠6分钟内的不动时间。

旷场实验

a. 小鼠周龄在20周左右时，提前1小时转移到实验室内适应环境。

b. 将小鼠放置在长20cm，宽20cm，高35cm的正方形塑料盒内，使用WinFast PVR软件拍摄小鼠6分钟内的活动录像。

c. 使用TopScanLite软件分析录像并统计小鼠总活动距离，小鼠在中央区的活动时间与活动距离，以及小鼠进入中央区的次数。

实施例2

FTY720对B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中神经元凋亡的影响

1、方法：实验所需的药品来源：神经元凋亡试剂盒Fluoro-Jade B购自ATT Bioquest公司。小鼠按实施例1中所述分组，至20周时处死取脑组织，进行神经元凋亡染色并在荧光显微镜下观察（见步骤说明）。

2、结果：见图2，FTY720治疗后，虽然小鼠脑组织海马区神经元凋亡数量有所减少，但是与未治疗组相比并没有显著差异，而杏仁核区神经元凋亡数量与未治疗组相比显著减少。

3、步骤说明：Fluoro-Jade B染色

a. 小鼠在20周龄时麻醉，四肢固定于平板上，打开胸腔，暴露心脏，心室灌注300mL 10%福尔马林（0.1M）至组织发白。

b. 取出脑组织，将其置于含20%蔗糖的10%福尔马林溶液中固定过夜。

c. 使用冰冻切片机将脑组织切成25μm厚的薄片。

d. 将切片用2%的凝胶包埋，在切片加热器上50℃烘干半小时。

e. 将切片浸泡于含有1% NaOH的80%酒精溶液中放置5分钟，然后70%酒精2分钟，最后双蒸水中2分钟。

f. 用双蒸水配制0.01%的Fluoro-Jade B母液，然后用0.1%乙酸配制0.0004%的Fluoro-Jade B染色液。

g. 将切片置于染色液中染色20分钟，用双蒸水清洗3次，每次1分钟。

h. 将切片烘干，用荧光显微镜观察海马区及杏仁核区神经元染色情况，拍摄照片，用ImageJ软件对照片进行量化。

实施例3

FTY720对B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中炎性因子的影响

1、方法：实验中所需试剂盒来源：TNF-α及IL-6 ELISA试剂盒购自美国BD公司，小鼠按实施例1中所述分组，至20周时取脑组织用于炎性因子检测。将小鼠麻醉后固定于平板上，打开胸腔，暴露心脏，用PBS进行心室灌注至组织发白，取小鼠脑组织，加入500μL PBS，匀浆后12000rpm离心5分钟，取上清进行ELISA实验。

2、结果：见图3， B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织存在炎症状态，脑组织中TNF-α及IL-6水平较C57BL/6小鼠显著升高，而FTY720治疗后脑组织中TNF-α及IL-6水平均较未治疗组显著降低。

3、步骤说明：

ELISA法检测脑组织中TNF-α水平

a. 将捕获抗体用包被缓冲液按体积比1:250稀释，每孔加100μL稀释后的捕获抗体，封板，4℃包被过夜。将包被液吸去，用洗液洗3次，并将板倒扣于吸水纸上吸干残留洗液。

b. 用至少200μL/孔检测稀释液封闭，室温孵育1小时。按上述方法洗涤3次。

c. 每孔加入100μL标准品、样品及对照，室温孵育2小时。按上述方法洗涤5次。

d. 用检测稀释液按体积比1:250稀释检测抗体，每孔加入100μL稀释后的检测抗体，室温孵育1小时。按上述方法洗涤5次。

e. 用检测稀释液按体积比1:250稀释酶反应物，每孔加入100μL稀释后的酶反应物，室温孵育30分钟。按上述方法洗涤7次。

f. 每孔加入100μL TMB酶底物溶液，室温避光孵育30分钟。

g. 每孔加入50μL 终止液终止反应。30分钟内在波长450nm处读板。

ELISA法检测脑组织中IL-6水平

a. 每孔加100μL用包被缓冲液稀释后的捕获抗体，封板，4℃包被过夜。将包被液吸去，用洗液洗3次，并将板倒扣于吸水纸上吸干残留洗液。

b. 每孔至少加入200μL检测稀释液封闭，室温孵育1小时。按上述方法洗涤3次。

c. 每孔加入100μL标准品、样品及对照，室温孵育2小时。按上述方法洗涤5次。

d. 每孔加入100μL工作检测液（检测抗体+SAv-HRP），室温孵育1小时。按上述方法洗涤7次。

e. 每孔加入100μL酶底物溶液，室温避光孵育30分钟。

f. 每孔加入50μL 终止液终止反应。30分钟内在波长450nm处读板。

实施例4

FTY720能够显著减少B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织中中性粒细胞的浸润

1、方法：小鼠按实施例1中所述分组，至20周时将小鼠麻醉，心室以4%甲醛灌注后取脑组织进行切片，通过MPO染色标记中性粒细胞。

2、结果：见图4， B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织存在炎症状态，皮质、海马区及脉络丛区域中，观察到大量浸润的中性粒细胞，而在FTY720灌胃处理B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织皮质、海马区及脉络丛区域中，观察到较少浸润的中性粒细胞。

实施例5

FTY720对B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠血脑屏障完整性具有保护作用

1、方法：小鼠按实施例1中所述分组，至20周时将小鼠麻醉，心室灌注PBS去除循环血液，取脑组织研磨提取蛋白并以Western Blot检测小鼠脑组织中白蛋白水平。

2、结果：见图5，B6.MRL-Fas(lpr)/J小鼠脑组织白蛋白，粘附分子ICAM-1、VCAM-1，基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达水平较正常对照组显著升高，FTY720治疗后，上述蛋白的表达水平较未治疗组显著下降。

3、步骤说明：

Western Blot方法检测脑中白蛋白，黏附分子和基质金属蛋白酶的表达水平

1)配制SDS-PAGE凝胶，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%。

2)向内槽中加入新鲜的电泳缓冲液，每个样品加入蛋白10 μg，将所有样品上样体积用1×上样缓冲液调至相同，短时离心，加样。

3)80 V恒定电压下电泳约30 min，直至样品到达浓缩胶底部并在此压成一条细线，然后105V恒定电压电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。

4)将PVDF膜剪成所需大小，放置于甲醇中浸泡5 min，配制转膜缓冲液。

5)电泳结束，取出凝胶，按照转膜“三明治”顺序依次放好滤纸，凝胶，PVDF膜，如此制成转印夹。

6)按照正确方向将转印夹放入转印装置中，向电泳槽中倒入转膜缓冲液。

7)135 mV恒定电流条件下转印2 h左右。

8)转印结束，将PVDF膜放入封闭液中，室温封闭1-2 h。

9)根据抗体效价用封闭液稀释抗体，将封闭后的杂交膜放入杂交袋，加入1 mL稀释后的一抗溶液，封口机封口，标记，4℃孵育过夜。

10)一抗孵育结束，PBST洗涤三次，每次10 min左右。

11)将杂交膜放入新的杂交袋，加入1 mL稀释后的二抗溶液，室温孵育2 小时。

12)PBST洗涤三次，每次10 min左右，化学发光凝胶成像系统检测。

综上所述，FTY720治疗与狼疮脑病的传统治疗方式相比存在一定优势，其口服给药的方式大大方便了患者，不存在鞘内注射这种创伤性治疗方式的风险，且早期给药可以预防狼疮脑病的发生。