一种小春花总黄酮的提取方法与流程

本发明涉及天然药物提取
技术领域：
，具体涉及一种小春花总黄酮的提取方法。
背景技术：
：小春花为阴地蕨科植物阴地蕨botrychiumternatum(thunb.)sw.、华东阴地蕨botrychiumjaponicum(prantl)underw.、薄叶阴地蕨botrychiumdaucifoliumwall.、绒毛阴地蕨botrychiaceaelanuginosumwall.、药用阴地蕨botrychiumofficinaleching、粗壮阴地蕨botrychiumrobustum(rupr.)underw.或蕨萁botrychiumvirginianum(l.)sw.的带根全草，别名：蛇不见、一朵云、黄连七、破天云等。小春花为浙江省习用药材，少数民族特色药材，也是著名的秦岭七药之一，具有清热解毒，滋补强肾，平肝熄风，止咳，止血，明目祛翳等功效。主要用于治疗肾亏、风热感冒、支气管哮喘、百日咳、头晕头痛、小儿高热惊搐、惊痫、瘰疬、火眼、目翳、毒蛇咬伤、狂犬咬伤、乳腺炎、腮腺炎以及辅助抗肿瘤。民间常以煎汤作为茶饮或与鸡、鸭、猪肉同炖，用以清热解毒、平肝止咳、滋补强壮。研究表明，小春花主要含有黄酮、氨基酸、挥发油等化学成分。发明人对小春花不同的提取部位进行了止咳平喘的药效学筛选，认为黄酮类成分为其良好生物活性的物质基础。小春花提取物的总黄酮中，含量最高的木犀草素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎以及保护神经系统的作用，其特有的阴地蕨素也被证实具有抗炎和抗氧化的作用。目前，对小春花进行提取的方法多停留在粗提物的提取，对于小春花总黄酮提取也多停留在得到总黄酮即可的程度，但是分离得到的总黄酮纯度较低，降低了小春花总黄酮的应用空间。而且现有的小春花总黄酮提取方法在纯化过程中不但会去除杂质，还会同时损失大量的小春花总黄酮，缺乏一种兼顾总黄酮提取效率以及纯度的小春花总黄酮提取方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种小春花总黄酮的提取方法，能够在维持高提取效率的同时提高小春花总黄酮的纯度。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种小春花总黄酮的提取方法，包括以下步骤：a、将小春花粉碎，得到小春花粗粉；b、采用乙醇水溶液作为提取溶剂，对所述步骤a得到的小春花粗粉进行回流提取，将得到的提取液浓缩，得到小春花乙醇提取稠膏；c、将所述步骤b得到的小春花乙醇提取稠膏用大孔吸附树脂柱和聚酰胺柱进行吸附和解吸附，得到小春花总黄酮；所述步骤c中，大孔吸附树脂柱吸附和聚酰胺柱吸附中分别依次采用水和乙醇水溶液洗脱。优选的，所述步骤a中粉碎的粒度不低于18目。优选的，所述步骤b中回流提取的次数为2～4次，每次提取2～3h。优选的，所述步骤b中小春花粗粉与每次提取的提取溶剂的质量比为1:5～10，所述回流提取用乙醇水溶液的体积浓度为70～90％。优选的，所述步骤b在回流提取前还包括：用所述乙醇水溶液浸泡步骤a得到的小春花粗粉0.5～2h。优选的，所述步骤c中洗脱用乙醇水溶液的体积浓度为50～90％。优选的，所述步骤c中的吸附为：依次进行大孔吸附树脂柱吸附和聚酰胺柱吸附。进一步优选的，所述步骤c中大孔吸附树脂柱吸附时，大孔吸附树脂柱为非极性大孔吸附树脂柱，洗脱用乙醇水溶液用量4～6bv。进一步优选的，所述步骤c采用聚酰胺柱吸附时，所述聚酰胺柱填充物的粒度为100～200目，所述洗脱用乙醇水溶液的体积浓度为70～80％。进一步优选的，所述步骤c中，大孔吸附树脂柱上样液总黄酮浓度为1.22～2.44mg/ml，聚酰胺柱上样液总黄酮浓度为0.59～2.36mg/ml。本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明采用大孔吸附树脂吸附和聚酰胺柱吸附的方式对小春花中的总黄酮进行提取并纯化，分离的小春花总黄酮得率可达到64.48％以上，得到的小春花总黄酮含量可达到56.92％以上，相对于现有技术相似得率情况下小春花总黄酮的含量低于8.5％，小春花总黄酮的含量提高了7倍以上。可见，本发明提供的小春花总黄酮提取方法能够在维持提取效率的情况下，显著提高小春花总黄酮提取物的含量。现有技术在对小春花总黄酮进行提取时往往难以兼顾提取效率和纯度，本发明的提取方法通过提取工艺参数和提取溶剂的合理搭配，在去除杂质的同时能够有效的减少小春花总黄酮在联用大孔吸附树脂吸附和聚酰胺柱吸附过程中的损失。附图说明图1为以木樨草素为对照品绘制的木樨草素浓度-吸光度标准曲线。具体实施方式本发明提供了一种小春花总黄酮的提取方法，包括以下步骤：a、将小春花粉碎，得到小春花粗粉；b、采用乙醇水溶液作为提取溶剂，对所述步骤a得到的小春花粗粉进行回流提取，将得到的提取液浓缩，得到小春花乙醇提取稠膏；c、将所述步骤b得到的小春花乙醇提取稠膏用大孔吸附树脂柱和聚酰胺柱进行吸附与解吸附，得到小春花总黄酮；所述步骤c中，大孔吸附树脂柱吸附和聚酰胺柱吸附中依次采用水和乙醇水溶液洗脱。在本发明中，小春花为阴地蕨科植物阴地蕨、华东阴地蕨、薄叶阴地蕨、绒毛阴地蕨、药用阴地蕨、粗壮阴地蕨或蕨萁的带根全草。本发明将小春花粉碎，得到小春花粗粉。在本发明中，所述小春花为小春花的全草，优选的在粉碎前将小春花全草去泥、洗净、干燥。在本发明中，所述干燥方式优选为晒干，所述干燥优选的干燥至小春花全草含水量低于10％。在本发明中，小春花粉碎的粒度优选不低于18目，更优选不低于35目，进一步优选的粉碎粒度为60～120目。本发明对所述粉碎的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的中药材粉碎的技术方案即可。所述粉碎后，本发明采用乙醇水溶液作为提取溶剂，对得到的小春花粗粉进行回流提取，得到提取液，具体的：将所述小春花粗粉与乙醇水溶液混合，进行回流提取。本发明在提取前优选用提取溶剂浸泡小春花粗粉至透心。在本发明中，所述浸泡时间优选为0.5～2h，更优选为浸泡1h。在本发明中，所述小春花粗粉与每次提取的乙醇水溶液质量比优选为1:5～10，更优选为1:6～8。在本发明中，所述作为提取溶剂的乙醇水溶液的体积浓度优选为70～90％，更优选为75～85％，最优选为80％。提取用乙醇水溶液浓度能够显著影响小春花总黄酮的提取得率，当乙醇水溶液的体积浓度为80％时提取效率最优。在本发明中，所述提取为回流提取。在本发明中，所述回流提取次数优选为2～4次，更优选为3次。在本发明中，每次回流提取时间的优选为2～3h，更优选为2h。本发明对所述回流提取设备没有任何限定，采用本领域技术人员熟知的回流提取设备即可。所述回流提取后，本发明将每次回流提取得到的液相组分进行过滤，合并多次提取得到的滤液，得到提取液。得到提取液后，本发明将所述提取液浓缩，得到小春花乙醇提取稠膏。在本发明中，所述浓缩方式优选为加热浓缩，将所述提取液浓缩至密度1.05-1.1mg/ml，优选的浓缩至1.08mg/ml。得到小春花乙醇提取稠膏后，本发明将所述小春花乙醇提取稠膏用大孔吸附树脂柱和聚酰胺柱进行吸附，得到小春花总黄酮。本发明使用大孔吸附树脂柱吸附和聚酰胺柱吸附的先后顺序无具体限定，优选的依次进行大孔吸附树脂柱吸附和聚酰胺柱吸附。所述大孔吸附树脂柱吸附和聚酰胺柱吸附中，本发明分别先用水进行洗脱，弃去水洗脱液，再用体积分数为50～90％的乙醇水溶液进行洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液，所述乙醇水溶液洗脱液中包括小春花总黄酮。在本发明中，所述洗脱吸附过程中优选的用6bv水进行洗脱，以6bv水洗脱能够去除大部分极性杂质，并且对黄酮成分的洗脱能力弱，总黄酮损失率仅为0.82％，可以有效的提高总黄酮提取物的纯度并减少吸附过程中的损失。在本发明中，所述吸附过程中优选的用体积浓度为50～90％乙醇水溶液4～6bv进行洗脱，采用该浓度的乙醇水溶液进行洗脱，能够提高解吸附的效率，体积浓度为40％的乙醇水溶液解吸附率仅为33.10％，而体积浓度为80的乙醇水溶液解吸附率为83.95％。优选的用体积浓度为70～85％乙醇水溶液4～5bv进行洗脱；更优选的为用体积浓度为80％的乙醇水溶液4bv洗脱。在本发明中，总黄酮洗脱量主要集中在4bv内，占总黄酮含量的80％左右。本发明对所述大孔树脂吸附柱和聚酰胺柱洗脱条件的一致性并无任何限定，大孔吸附柱与聚酰胺柱在进行洗脱时分别从上述洗脱条件中单独选择。在本发明中，所述大孔吸附树脂柱优选为非极性大孔吸附树脂柱，更优选的，所述非极性大孔吸附树脂的类型为hpd450、860021、ab-8、d101；在本发明中，以非极性大孔吸附树脂d101型对小春花总黄酮进行吸附的样品吸附和解吸附能力最高。在本发明中，所述聚酰胺柱中聚酰胺树脂粒度优选为100～200目，对小春花总黄酮吸附和解吸附的能力最强。在本发明中，所述大孔吸附树脂柱吸附时的上样液总黄酮浓度过高或过低均会降低大孔吸附树脂对小春花总黄酮的吸附量，所述上样液总黄酮浓度优选为1.22～2.44mg/ml，更优选为1.22mg/ml；所述大孔吸附树脂柱吸附的上样液ph值过高或过低均会显著降低大孔吸附树脂对小春花总黄酮的吸附量，优选的上样液ph为4～7，更优选的ph为5。在本发明中，所述聚酰胺柱吸附时的上样液总黄酮浓度过高或过低均会降低大孔吸附树脂对小春花总黄酮的吸附量，所述上样液总黄酮浓度优选为0.59～2.36mg/ml，更优选为0.59～1.18mg/ml，最优选为1.18mg/ml。得到乙醇溶液洗脱液后，本发明将所述洗脱液减压回收乙醇，而后经真空干燥、粉碎，得到小春花总黄酮。在本发明中，所述真空干燥的温度优选的为40-60℃，更优选为50℃；真空度压力优选为-0.1～0.2mpa，更优选为0mpa；在本发明中，所述粉碎优选的粉碎至不低于18目，更优选不低于35目。下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1取20g小春花，粉碎至18目制成小春花粗粉；用体积浓度为80％的乙醇水溶液与小春花粗粉按质量比6:1进行混合，浸泡1h后回流提取3次，每次提取2h并过滤，合并滤液进行浓缩，得到小春花乙醇提取稠膏。所述小春花乙醇提取稠膏的总黄酮含量为4409.6μg/g。取制备得到的小春花乙醇提取稠膏，加水混合配制成总黄酮含量为1.22mg/ml、ph＝5的上样溶液a。取经预处理的d1010大孔吸附树脂200g装柱，取1200ml上述上样溶液a，以流速2ml/min过柱，用6bv水进行洗脱，弃去水洗脱液，再用体积浓度为80％的乙醇水溶液4bv洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液，减压回收乙醇，得到小春花总黄酮提取液。将上述得到的小春花总黄酮提取液与水混合配制成总黄酮含量为1.18mg/ml的上样溶液b。取经预处理的粒度为100～200目的聚酰胺树脂200g装柱，取1200ml上样溶液b，以流速2ml/min过柱，用6bv水进行洗脱，弃去水洗脱液，再用体积浓度为70％的乙醇水溶液4bv洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液，减压回收乙醇，50℃下、0mpa进行真空干燥，粉碎至35目，得到小春花总黄酮。实施例2取20g小春花，粉碎至60目制成小春花粗粉；用体积浓度为90％的乙醇水溶液与小春花粗粉按质量比8:1进行混合，浸泡2h后回流提取3次，每次提取2h并过滤，合并滤液进行浓缩，得到小春花乙醇提取稠膏。所述小春花乙醇提取稠膏的总黄酮含量为4184.2μg/g。取制备得到的小春花提取稠膏，与水混合配制成总黄酮含量为2.44mg/ml、ph＝7的上样溶液a。取经预处理的d1010大孔吸附树脂200g装柱，取1200ml上述上样溶液a，以流速2ml/min过柱，用6bv水进行洗脱，弃去水洗脱液，再用体积浓度为80％的乙醇水溶液5bv洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液，减压回收乙醇，得到小春花总黄酮提取液。将上述得到的小春花总黄酮提取液水混合配制成总黄酮含量为2.36mg/ml的上样溶液b。取经预处理的粒度为100～200目的聚酰胺树脂200g装柱，取1200ml上样溶液b，以流速2ml/min过柱，用6bv水进行洗脱，弃去水洗脱液，再用体积浓度为80％的乙醇水溶液5bv洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液，减压回收乙醇，40℃下、-0.1mpa进行真空干燥，粉碎至18目，得到小春花总黄酮。实施例3取20g小春花，粉碎至35目制成小春花粗粉；用体积浓度为70％的乙醇水溶液与小春花粗粉按质量比10:1进行混合，浸泡0.5h后回流提取2次，每次提取2h并过滤，合并滤液进行浓缩，得到小春花乙醇提取稠膏。所述小春花乙醇提取稠膏的总黄酮含量为4162.9μg/g。取制备得到的小春花提取稠膏，与水混合配制成总黄酮含量为0.59mg/ml的上样溶液b。取经预处理的粒度为100～200目的聚酰胺树脂200g装柱，取1200ml上样溶液b，以流速2ml/min过柱，用6bv水进行洗脱，弃去水洗脱液，再用体积浓度为90％的乙醇水溶液6bv洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液，减压回收乙醇，得到小春花总黄酮提取液。将上述得到的小春花总黄酮提取液与水混合，配制成总黄酮含量为2.44mg/ml、ph＝4的上样溶液a。取经预处理的d1010大孔吸附树脂200g装柱，取1200ml上述上样溶液a，以流速2ml/min过柱，用6bv水进行洗脱，弃去水洗脱液，再用体积浓度为90％的乙醇水溶液6bv洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液，减压回收乙醇，60℃下、2.0mpa进行真空干燥，粉碎至50目，得到小春花总黄酮。比较例1取20g小春花，粉碎至20目制成小春花粗粉；用体积浓度为50％的乙醇水溶液与小春花粗粉按质量比6:1进行混合，浸泡2h后回流提取1次，每次提取1h并过滤，合并滤液进行浓缩，得到小春花乙醇提取稠膏。所述小春花乙醇提取稠膏的总黄酮含量为2197.5μg/g。比较例1采用了体积浓度为50％的乙醇水溶液作为提取溶剂，回流提取次数为1次，每次提取1h，其得到的小春花乙醇提取稠膏的总黄酮含量相对于本申请实施例1～3所述方法得到的小春花乙醇提取稠膏的总黄酮含量降低了47％以上。结果显示，改变本发明提供的小春花总黄酮提取方法会显著降低总黄酮的提取效率。比较例2取实施例1中制备得到的小春花提取稠膏，与水混合配制成总黄酮含量为1.22mg/ml的上样溶液a。取经预处理的d1010大孔吸附树脂200g装柱，取1200ml上述上样溶液a，以流速2ml/min过柱，用6bv水进行洗脱，弃去水洗脱液，再用体积浓度为70％的乙醇水溶液4bv洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液，减压回收乙醇，50℃下、0mpa进行真空干燥，粉碎至35目，得到小春花总黄酮。比较例3取实施例1中制备得到的小春花提取稠膏，与水混合配制成总黄酮含量为1.18mg/ml的上样溶液b。取经预处理的粒度为100～200目的聚酰胺树脂200g装柱，取1200ml上样溶液b，以流速2ml/min过柱，用6bv水进行洗脱，弃去水洗脱液，再用体积浓度为70％的乙醇水溶液4bv洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液，减压回收乙醇，50℃下、0mpa进行真空干燥，粉碎至35目，得到小春花总黄酮。实施例4小春花总黄酮提取方法的工艺验证：分别按照实施例1、比较例2、比较例3记载的三种方法对小春花总黄酮进行提取，所述加入的小春花上样液中的总黄酮含量均为1875mg，每种方法进行三次平行试验。将得到的小春花总黄酮采用紫外分光光度法测定含量，由于木樨草素是小春花总黄酮的主要成分，且其含有的总黄酮中木樨草素结构类似物较多，因而以木樨草素为对照品测定总黄酮的含量，并计算得率。对照品溶液的制备：精密称取木犀草素对照品9.07mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。检测波长的选择：精密吸取对照品溶液4ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2015年版一部,通则0401)于400～800nm范围内进行波长扫描。结果在507nm处，有最大吸收峰，故确定检测波长为507nm。标准曲线的制备：精密吸取对照品1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和6ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2015年版一部,通则0401)，在507nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，木犀草素在30.23～181.40μg/ml范围内才呈良好的线性关系，a＝0.0056c-0.0384(r＝0.9992)，具体结果见表1，绘制的标准曲线见图1。表1标准曲线的制备浓度(c，μg/ml)吸光度(a)30.230.142960.460.284890.700.4595120.930.6555151.170.8004181.400.9784将按照实施例1、比较例2、比较例3记载的三种方法对小春花总黄酮进行提取得到的样品溶液按照对照品的处理方式进行测定并折算，具体验证结果见表2。表2验证实验结果结果表明，实施例1方法提取的小春花总黄酮的得率虽然较单用树脂低，但仍然可达到65％左右，与现有技术无显著差异；且总黄酮含量提高了近7倍以上，说明本发明提供的小春花总黄酮提取方法总得到的黄酮具有较高的得率和纯度。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3