表没食子儿茶素没食子酸酯抑制肺炎链球菌致病力及应用的制作方法

本发明为表没食子儿茶素没食子酸酯抑制肺炎链球菌致病力及应用，涉及表没食子儿茶素没食子酸酯在降低肺炎链球菌致病性中的应用，属于医药领域。

背景技术：

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶茶多酚中含量最高的一种成分，具有多种药理学活性，如抗炎、抗氧化、抗真菌、抗病毒及抗肿瘤等，在临床医学已有重要地位。但是目前国内外未见EGCG用于肺炎链球菌性感染的报道。

肺炎链球菌是一种革兰氏阳性的机会致病菌，常无症状地定植于人的鼻咽部。当机体免疫力降低时，肺炎链球菌即可引发急性鼻窦炎和中耳炎等局部感染，也可导致菌血症、败血症及脑膜炎等重症疾病。肺炎链球菌性病疾，在5岁以下儿童、老年人及免疫功能低下的人群中具有很高的发病率及死亡率。研究发现，分选酶A(Sortase A, SrtA)是肺炎链球菌的一个重要的功能蛋白，可以通过LPETG序列将某些毒力相关的细胞表面蛋白锚定在细胞壁上，这些毒力相关的细胞表面蛋白在肺炎链球菌致病过程中发挥着很重要的作用，包括粘附，定殖和入侵等等。

技术实现要素：

本发明公开了表没食子儿茶素没食子酸酯抑制肺炎链球菌致病力及应用，提供了表没食子儿茶素没食子酸酯在降低肺炎链球菌致病性中的新的医用用途。

本发明涉及的表没食子儿茶素没食子酸酯（以下简称：EGCG），具有以下分子结构：

分子式： C₂₂H₁₈O₁₁；分 子 量：458.38。

本发明提供的表没食子儿茶素没食子酸酯抑制肺炎链球菌致病力及应用，通过药敏实验发现EGCG对肺炎链球菌几乎没有抗菌活性，而分选酶活性抑制试验表明EGCG在低浓度（低于EGCG对肺炎链球菌的最小抑菌浓度）即可抑制肺炎链球菌分选酶活性。通过人肺泡上皮细胞(A549)损伤的保护性试验，人喉癌上皮细胞(Hep2)粘附抑制试验以及肺炎链球菌感染小鼠肺炎模型证实EGCG体内和体外均可抑制肺炎链球菌的致病力。肺炎链球菌感染的过程中，分选酶A是介导多种毒力相关的表面蛋白锚定，在肺炎链球菌致病过程中发挥着非常重要的作用，但对肺炎链球菌生长不是必须的。因此与抗生素治疗相比，使用中药化合物EGCG不易诱导耐药性，并且治愈率高。

本发明的积极效果在于：

本发明研究证实了EGCG对肺炎链球菌没有抑菌活性，但是可以通过抑制SrtA的肽酶活性降低肺炎链球菌的致病性；并且提供了表没食子儿茶素没食子酸酯的新的药业用途。通过药敏试验、SrtA肽酶活性抑制试验、人喉癌上皮细胞(Hep2)粘附抑制试验以及肺炎链球菌感染小鼠的治疗试验证实了EGCG在降低肺炎链球菌致病性中的作用。

附图说明

图1. EGCG对SrtA肽酶活性的抑制作用；

图2. EGCG对肺炎链球菌粘附Hep2细胞的抑制作用；

图3. EGCG对肺炎链球菌感染小鼠肺部菌落定植的影响；

图4. EGCG对肺炎链球菌感染小鼠肺病理变化的影响。

具体实施方式

试验例1

1、药敏试验

本试验中，采用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的肉汤微量稀释法，以THY(THB+1%酵母提取物)培养基对EGCG进行倍比稀释，加至96孔微量培养板中，每孔100 μl，同时将培养过夜的肺炎链球菌D39菌株按5×10⁵ CFUs/ml接种至倍比稀释的THY培养基中，于37℃ CO₂培养箱中培养。以培养基中加入苯唑西林为阳性对照，不加任何药物为阴性对照，以没有肉眼可见的细菌生长的最低药物浓度判定为药物的最低抑菌浓度(MIC)。结果发现EGCG对肺炎链球菌D39菌株的最低抑菌浓度大于2234 μM。因此，EGCG对肺炎链球菌几乎没有抑菌活性。

、SrtA肽酶活性抑制试验

本试验中，将体外表达的肺炎链球菌SrtA分别与不同浓度的EGCG (0、8.73、17.45、34.9和69.8 μΜ)相互作用于96孔黑色板子中，反应体系为90 μl。于37 °C温箱孵育30 min后，用酶标仪检测样品的荧光值S₀，激发波长为350 nm，发射波长为520 nm。然后，向样品中加入10 μl酶作用底物(Dabcyl-QALPETGEE-Edans, 10 μΜ)，于37 °C温箱孵育1 h后，用同样的方法测定样品的荧光值S。按照公式计算每组样品中SrtA的肽酶活性(%)：[(S – S₀)/(C - C₀)] × 100，其中C和C₀为蛋白酶K阳性对照组所测数值。试验结果如图所示，随着EGCG浓度逐渐增加，SrtA的肽酶活性明显降低(图1)。因此，EGCG对SrtA的肽酶活性有显著的抑制作用，且呈现剂量依赖性。

、肺炎链球菌对人喉癌上皮细胞(Hep2)的粘附抑制试验

本试验中，用胰酶将生长状态良好的人喉癌上皮细胞(Hep2)消化后，以每孔1×10⁵个细胞的密度接种至24孔细胞培养板中，于37 °C CO₂培养箱中培养过夜。将培养过夜的D39接种至新鲜的THY培养基中，同时加入不同浓度的EGCG (0、8.73、17.45、34.9和69.8 μΜ)，于37 °C CO₂培养箱中培养至对数生长期(OD_600nm=0.4)。收集菌体，并重悬至含相应浓度EGCG (0、8.73、17.45、34.9和69.8 μΜ)的DMEM细胞培养液中。然后，将培养过夜的Hep2细胞用PBS洗三次，每孔加入1ml DMEM培养液(其中含3×10⁶ CFU菌体及相应浓度的EGCG)，于37 °C CO₂培养箱中培养。2 h后，弃去培养液上清，用PBS将细胞洗涤三次。然后用0.25%胰酶消化细胞，用0.02% Triton X-100裂解细胞，并通过琼脂平板菌落计数法对粘附于Hep2细胞的D39进行统计。将每组得到的细菌数量与细菌接种量相比较，检测EGCG对D39粘附Hep2细胞的影响。结果如图所示，随着EGCG浓度增加，D39对Hep2细胞的粘附作用明显降低(图2)。因此，EGCG可显著抑制肺炎链球菌对人喉癌上皮细胞的粘附作用。

、肺炎链球菌感染小鼠的治疗学研究

本研究以致病性较强的二型肺炎链球菌D39菌株经小鼠鼻腔攻毒，建立肺炎链球菌感染模型。每只Balb/c小鼠感染的菌量为1.5×10⁸ CFUs，感染后即通过皮下注射EGCG (50 mg/kg)进行治疗。给药间隔时间为8 h，对照组同时给相同剂量的PBS (含2% DMSO)。连续给药48 h后，取小鼠肺脏组织，研磨后涂板进行菌落计数，统计感染小鼠肺部的菌落定植情况。另外，对小鼠肺脏组织进行固定、染色、切片并观察其病理变化。结果如图所示，EGCG可以显著抑制肺炎链球菌在小鼠肺部的定植(图3)，并且明显减轻感染小鼠肺部的病理变化(图4)。表明，EGCG可以明显降低肺炎链球菌的致病性。