一种磷酸二酯酶4抑制剂的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种磷酸二酯酶4抑制剂的应用。

背景技术：

帕金森病(parkinson'sdisease，pd)是一种中枢神经系统退行性疾病，多发生于中、老年人群，随着社会人口老龄化现象加剧，pd给患者自身以及家庭的生活质量已经带来严重的影响。该疾病主要病理特征是黑质多巴胺神经元进行性丢失，进一步导致纹状体内多巴胺含量减少。导致这一疾病的确切机制尚未明确，现有研究普遍认为与环境因素、线粒体功能障碍、遗传因素、氧化应激、基因突变、神经毒性、炎症以及自噬等有关，也可能是由多种因素共同作用的结果。pd的主要临床表现是肌强直、进行性运动迟缓、静止性震颤以及姿势步态障碍等。该疾病目前尚未找到有效的治疗药物以及方法，现有的治疗手段主要以药物治疗为主，辅以脑深部电刺激细胞移植以及基因治疗等。pd的症状和体征能够被提高多巴胺功能的药物缓解，其中代表性药物是左旋多巴，但是左旋多巴出现的一系列副作用限制了它的广泛应用。更令人失望的是，如果长期使用，左旋多巴可能损害神经元，加速神经元的凋亡。所以探索pd发生发展的机制以及寻找最佳的pd治疗策略具有非常重大的意义。

磷酸二酯酶(phosphodiesterase,pdes)是催化水解细胞内极其重要的第二信使camp和cgmp的酶超级家族，在调节体内camp和cgmp水平、参与多种疾病的过程等方面发挥着至关重要作用。pde4是特异性催化水解camp的酶。近年来，临床前实验研究表明抑制中枢神经系统pde4具有显著的神经保护作用。然而传统pde4抑制剂如rolipram可产生严重的不良反应，其中恶心、呕吐最为突出，患者顺应性差，导致其无法进入临床使用。因此，保证药物有效、降低药物不良反应是开发pde4抑制剂类抗抑郁药的瓶颈。

fcpr16是个新型的pde4抑制剂，与传统的pde4抑制剂如rolipram相比，fcpr16抑制pde4的ic50值明显低于对照化合物rolipram，即其对pde4的酶抑制活性较rolipram更强。同时，fcpr16对pde4d7这一亚型表现出了较高的选择性，即对pde4d亚型的选择性较高。最明显的优势是fcpr16具有很低的致致呕吐潜能，显示出极好的临床应用价值。现有技术中已对该化合物进行了公开，参见developmentofhighlypotentphosphodiesterase4inhibitorswithanti-neuroinflammationpotential:design,synthesis,andstructure-activityrelationshipstudyofcatecholamidesbearingaromaticrings.eurjmedchem.2016;124:372-379.但是并未公开其在帕金森病治疗上的用途。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供新型pde4抑制剂fcpr16在抗帕金森病药物上的应用，其对pd的运动障碍具有很好的效果；还提供了新型pde4抑制剂fcpr16在修复多巴胺能神经元损伤中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种磷酸二酯酶4抑制剂的应用，磷酸二酯酶4抑制剂为fcpr16，其结构式为：

；

fcpr16应用于预防或治疗帕金森病的药物中，或者应用于制备用于修复多巴胺能神经元损伤的药物中。

为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

上述的fcpr16应用于制备用于修复因帕金森病造成的脑神经元损伤的药物中。

上述的药物中包含fcpr16化合物或者其药物可接受盐。

上述的药物的给药方式为注射制剂、口服制剂或外用制剂。

上述的药物的制剂形式包括片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

与现有技术相比，本发明的pde4d抑制剂fcpr16应用于抗帕金森病药物中，其在制备治疗pd药物中的用途属于首次公开，而且其对pd的运动障碍具有很好的效果；还提供了新型pde4抑制剂fcpr16在修复多巴胺能神经元损伤中的应用，其能够修复多巴胺能神经元的退行性变或细胞凋亡或氧化损伤。

附图说明

图1为fcpr16在悬挂实验(a)及爬杆实验(b)中对mptp诱导的帕金森病模型小鼠运动功能的影响；

图2为fcpr16在转棒实验中对mptp诱导的帕金森病模型小鼠运动功能的影响；

图3为fcpr16对mptp诱导的帕金森病模型小鼠自主活动的影响；

图4为fcpr16在悬挂实验(a)及爬杆实验(b)中对pd转基因小鼠运动功能的影响；

图5为fcpr16在转棒实验中对pd转基因小鼠运动功能的影响；

图6为流式细胞术检测fcpr16对mpp⁺造模后sh-sy5y细胞凋亡的影响；

图7为fcpr16对mpp⁺造模后对sh-sy5y细胞内ros水平的影响。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一种磷酸二酯酶4抑制剂的应用，磷酸二酯酶4抑制剂为fcpr16，其结构式为：

；

fcpr16应用于预防或治疗帕金森病的药物中。或者应用于制备用于修复多巴胺能神经元损伤的药物中；所制备的药物用于能够修复多巴胺能神经元的退行性变或细胞凋亡或氧化损伤。

实施例中，药物中包含fcpr16化合物或者其药物可接受盐。

实施例中，药物的给药方式为注射制剂、口服制剂或外用制剂。

实施例中，药物的制剂形式包括片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

下面通过实验证实pde4d抑制剂fcpr16的抗帕金森病以及修复多巴胺能神经元损伤上的作用。

实验1.fcpr16对mptp(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)诱导的pd模型小鼠运动功能的改善作用

实验动物及给药处理：选取72只10周龄的雄性c57bl/6小鼠，适应环境两周，体重为(20-25)g，每天接受12h光照/12h黑暗。实验室温度20±2℃，湿度60%，动物可以自行摄取标准饲料和清洁用水。实验动物遵守国际实验动物伦理学要求。将小鼠随机分为6组，每组12只，空白对照(control)组、mptp组、低剂量组(1.25mg/kgfcpr16＋mptp)、中剂量组(2.5mg/kgfcpr16＋mptp)、高剂量组(5.0mg/kgfcpr16＋mptp)、阳性药对照组(25.0mg/kg左旋多巴＋mptp)，称重和记录体重。实验的第一天，低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠按体重10ml/kg的容积分别灌胃0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml的fcpr16溶液，使药物作用浓度为1.25mg/kg、2.5mg/kg和5.0mg/kg的fcpr16。以上溶液的溶剂都为0.5%cmc-na溶液，实验的第二天至第六天，低剂量组、中剂量组和高剂量组先用fcpr16灌胃，其余组灌胃等容积的0.5%cmc-na溶液。1h后mptp组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组均腹腔注射30mg/kgmptp，空白组腹腔注射等容量的生理盐水，连续5天。实验第七天至第十五天，阳性对照组小鼠按体重10ml/kg的容积灌胃2.5mg/kg的左旋多巴溶液，溶剂为0.5%cmc-na溶液。实验第十六天，即mptp末次注射第十天，取各组小鼠进行行为学实验。

自主活动实验(openfield)：自制30cm×30cm×15cm的木盒，底部刻出6cm×6cm的格子，在安静、光线较暗的环境中检测。小鼠适应环境10min后，计数5min内小鼠移动(ambulation)的格子数和站立(rearing)的次数。

滚轴实验(rotarod)：滚轴实验需要动物在滚轴上保持平衡并连续运动，是广泛采用的检测运动协调性的实验。实验前，每只小鼠训练5min，使其能够在大小鼠疲劳转棒仪上停留，随后休息5min开始实验，转速为12rpm。以180秒作为实验终止时间。记录小鼠在疲劳转棒仪上停留时间。

爬杆实验(poletest)：自制直径0.8cm，高60cm的直木杆，杆顶部有一小木球，外面覆盖纱布以防止小鼠打滑。小鼠置于球顶，记录以下3个时间：小鼠在木杆顶部小球停驻的时间；小鼠爬完杆长的上半部分所需时间；小鼠爬完杆长的下半部分所需的时间；按以下标准打分：3秒内完成任一动作的记3分，6秒内记2分，超过6秒记1分，最后计算三项累计得分情况。

悬挂实验(gridtest)：自制水平放置的金属杆直径1.5mm，距地面30cm，实验中将小鼠双前肢悬挂于一水平电线上，如小鼠用双后肢抓住电线记3分；仅用一只后肢抓住电线记2分；两支后肢均抓不住记1分；小鼠跌落记为0分。

实验结果：通过在c57bl小鼠采用腹腔注射mptp(30mg/kg)的方法建立稳定的亚急性帕金森病模型，在此模型基础上考察fcpr16是否具有对抗帕金森病运动障碍的作用。在爬杆实验中我们可以观察到：空白对照组小鼠行动自如，完成指定动作用用时较少，获得较高分数。mptp致使模型组小鼠运动迟缓，完成指定动作用用时较长，获得较低分数，而fcpr16药物处理组获得分数明显比mptp组小鼠高(p<0.05)。在悬挂实验中，空白对照组组小鼠可以用四肢抓住电线；而mptp组小鼠却只能用前爪抓住电线，后爪无力，得分较低；fcpr16处理组小鼠后爪力量明显增强，至少可以用一只后爪抓住电线。结果如图1中a部分(悬挂实验)及图1中b部分(爬杆实验)所示。

进一步采用用于评价抗pd药物经典的动物模型转棒实验来评价fcpr16对帕金森病运动障碍的改善作用。小鼠前期经训练，筛选得到运动功能合格的小鼠，成功造模后，将小鼠置于正在运转的转棒仪上,开始计时。记录小鼠在转棒上停留的时间作为潜伏期(即第一次掉落的时间)以此表示其运动协调能力。每只小鼠测定3次,每次间隔30min,取平均值。结果见图2，我们发现正常对照组小鼠在2min内几乎没有掉落,潜伏期记为120秒。mptp模型组小鼠的运动协调能力明显下降,与正常对照组小鼠相比具有显著性差异，表现为潜伏期明显缩短,掉落次数显著增加(p<0.01)。且观察到随着mptp损伤的累积,小鼠的运动障碍呈进行性加重。与mptp模型组相比,fcpr16及阳性对照药左旋多巴(l-dopa)组小鼠在转棒上停留的潜伏期明显延长(p<0.05)。

在获得fcpr16可显著改善pd模型小鼠的运动功能障碍后，我们进一步评价了这一化合物对小鼠自主活动的影响，以明确该化合物是否具有中枢兴奋或中枢抑制作用。结果见图3，我们发现fcpr16不影响单位时间内小鼠在中央格停留时间，某一肢体越过的格子数为水平得分(crossing)，后肢站立次数为垂直得分(rearing)与模型组相比没有显著性差异，即fcpr16在mptp诱导的pd模型中不影响小鼠的自主活动。

实验2.fcpr16对pd转基因小鼠运动障碍的改善作用

实验动物及给药处理：pd转基因动物为synuclein转基因小鼠，pd转基因鼠及wt鼠每天接受12h光照/12h黑暗。实验室温度20±2℃，湿度60%，动物可以自行摄取标准饲料和清洁用水。实验动物遵守国际实验动物伦理学要求。待pd转基因鼠及wt鼠16周龄时，对其进行行为学实验。

检测pd模型小鼠运动障碍的行为学实验同实验1。

实验结果：在mptp诱导的pd模型小鼠中获得了fcpr16可以改善小鼠的运动障碍后，我们进一步采用pd的α-synuclein转基因小鼠考察fcpr16的作用。结果如图4所示，连续灌胃给予fcpr16共21天后，进行悬挂及爬杆实验，α-synuclein转基因小鼠的运动能力显著受损，而给予fcpr16后，则显著改善小鼠的运动能力，与转基因小鼠相比，具有显著性差异(p<0.05)。

我们同样采用了经典的转棒实验来评价fcpr16对对pd转基因小鼠运动障碍的改善作用，结果见图5，与mptp模型小鼠的结果一致，fcpr16显著增加小鼠在转棒上停留的潜伏期(p<0.05)。

实验3.fcpr16对mpp⁺造模后多巴胺能神经细胞sh-sy5y的保护作用

流式细胞法检测细胞凋亡：取出处于对数生长期的sh-sy5y细胞，进行消化，离心，重悬。加入适量培养基和血清调整细胞悬液的浓度，进行六孔板的细胞铺板，细胞置培养箱过夜后，加入不同浓度的fcpr16溶液，置培养箱中培养2h后加入mpp⁺溶液，使孔内的mpp⁺溶液终浓度为500mol/l，置培养箱中继续培养24h后，从培养箱中取出经实验处理后的六孔板，各孔进行消化，离心，小心弃去上清，加入含1%血清、1%牛血清白蛋白的培养基进行细胞重悬，取100μl细胞悬液至离心管中。取出细胞凋亡检测试剂盒，每管加入100μlannexinv/7-add染色剂，轻轻吹打使细胞混匀，在室温下孵育20min，上机检测。检测后进行结果分析，其中annexinv(-)、7-aad(-)代表非凋亡细胞；annexinv(+)、7-aad(-)代表早期凋亡细胞；annexinv(+)、7-aad(+)代表晚期凋亡和死亡细胞；annexinv(-)、7-aad(+)代表核碎片。

细胞内活性氧水平检测：取出处于对数生长期的sh-sy5y细胞，进行消化，离心，重悬。加入适量培养基和血清调整细胞悬液的浓度，进行六孔板的细胞铺板，细胞置培养箱过夜后，加入不同浓度的fcpr16溶液，置培养箱中培养2h后加入mpp⁺溶液，使孔内的mpp⁺溶液终浓度为500mol/l，置培养箱中继续培养2h后，按照1:1000用无血清培养液稀释dcfh-da，使终浓度为10mol/l，去除培养液，加入适当体积稀释好的dcfh-da。37℃细胞培养箱内孵育20min，用无血清培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。倒置荧光显微镜下观察细胞内活性氧水平的变化，激发波长为488nm，发射波长为525nm，每孔随机选取八个视野进行观察统计。

实验结果：利用流式细胞术检测fcpr16对mpp⁺造模后多巴胺能神经细胞sh-sy5y凋亡的影响，结果如图6。与正常对照组相比，mpp⁺模型组中处于早期凋亡(25.53%)和晚期凋亡(7.48%)明显增加，而单纯给予25μmfcpr16处理细胞，细胞凋亡数量与正常对照相比，变化不明显。而与模型组相比，给予6.3μm、12.5μm或25μmfcpr16处理细胞后，能在不同程度上减少凋亡细胞的数量。其中，给予12.5μmfcpr16处理细胞，早期凋亡的细胞数量明显下降(15.12%)，而晚期凋亡及死亡细胞变化不大。给予25μmfcpr16处理细胞，处于早期凋亡呈现均明显下降(11.18%)，晚期凋亡及死亡细胞数量亦呈下降趋势。

利用染色对sh-sy5y细胞活性氧(ros)进行检测，结果如图7。正常对照组和单纯给予25μmfcpr16处理组细胞红色荧光较浅，表明此时细胞ros水平较低，而mpp⁺造模组细胞主要呈较强的红色荧光，表明此时细胞ros水平较高，mpp⁺对sh-sy5y细胞具有氧化损伤的毒性。而25μmfcpr16处理组细胞经mpp⁺造模后，红色荧光减弱，说明fcpr16能够减弱mpp⁺造模后sh-sy5y细胞中ros水平的增加，削弱mpp⁺对sh-sy5y细胞的损伤作用。

本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。