本发明涉及一种具有抗肿瘤药物功效的联合用药物。
背景技术：
二氢叶酸还原酶(dhfr)是生物体内很重要的一种酶，催化生物体内二氢叶酸还原成四氢叶酸的反应，为生物合成dna的前体物胸腺嘧啶脱氧核苷的过程提供一碳单元。dhfr抑制剂在肿瘤细胞生长过程中，能够选择性地与dhfr结合，抑制其催化还原活性，使二氢叶酸不能转变成四氢叶酸，干扰dna和蛋白质的合成，最终导致细胞死亡，从而达到抗肿瘤的目的。
dhfr抑制剂抗肿瘤效果明显，常作为一线和二线的治疗使用，但是由于属于细胞毒性类药物，对机体损伤大，无法持续性治疗。为减轻dhfr抑制剂的毒副作用，临床上通常采用联合其他化疗药物的方式对肿瘤进行间歇性治疗，但由于其他化疗药物同样存在较大的毒副作用，故效果并不明显。绿原酸是一种多酚类化合物，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等生物活性。目前由于毒副作用低、抗肿瘤效果好，已成为抗肿瘤药物的研究热点。
未见将培美曲塞等二氢叶酸还原酶抑制剂，与绿原酸联合使用的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤药物功效的联合用药物，以提高药物单药用药的疗效的同时，降低二氢叶酸还原酶抑制剂的毒副作用。
本发明提供了一种具有抗肿瘤药物功效的联合用药物，其特征在于：它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的绿原酸和二氢叶酸还原酶抑制剂，以及药学上可接受的载体。
其中，二氢叶酸还原酶抑制剂包括但不限制于培美曲塞、氨喋呤。
其中，绿原酸和二氢叶酸还原酶抑制剂的重量比为1：1—1：5。
本发明抗肿瘤药物功效的联合用药物，单位制剂药物中含绿原酸10mg-240mg的注射剂或口服制剂；给药剂量为10-40mg/kg绿原酸和给药剂量2-40mg/kg的联合用药物。
其中，所述抗肿瘤药物为培美曲塞时，绿原酸和抗肿瘤药物的重量比为2:5；
所述抗肿瘤药物为氨喋呤时，绿原酸和抗肿瘤药物的重量比为2:4。
本发明还提供了前述的联合用药物在制备治疗乳腺癌、肺癌、肝癌、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、治疗恶性胸膜间皮瘤、急性白血病的药物中的用途。
本发明还提供了前述的联合用药物在制备非多药耐药性肿瘤的药物中的用途。
本发明还提供了绿原酸和二氢叶酸还原酶抑制剂在制备抗肿瘤的联合用药物中的用途。
其中，所述联合用药物是治疗非多药耐药性肿瘤的药物。
本发明还提供了绿原酸在制备降低二氢叶酸还原酶抑制剂的毒副作用的药物中的用途。
其中，所述药物是减弱二氢叶酸还原酶抑制剂导致体重变轻的副作用的药物。
其中，所述药物是修复二氢叶酸还原酶抑制剂导致的造血功能损伤的副作用的药物。
本发明绿原酸与培美曲塞等dhfr抑制剂联合使用，可以发挥协同增效的作用，并缓解dhfr抑制剂导致的造血功能损伤及体重变轻，有效降低dhfr抑制剂的毒副作用，将绿原酸与dhfr抑制剂联合用药物的疗效优良，毒性小，临床应用前景良好。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
具体实施方式
实施例1联合用药的体外试验
1、实验材料
试药：绿原酸、培美曲塞、氨喋呤。
细胞株：肺腺癌a549细胞株、乳腺癌mcf-7细胞株、肝癌bel-7402细胞株。
2、试验方法
2.1细胞复苏
将冻存细胞株从-152℃超低温冰柜中取出，40℃水浴解冻，离心并用基础培养基洗涤后用培养液悬浮细胞，转移到细胞培养瓶内，静置于5％co2细胞培养箱中37℃培养，每2～3天换液。细胞生长铺满细胞瓶后用0.25％胰蛋白酶消化传代培养至实验所需细胞数量。
2.2加药培养
取对数生长期细胞，0.25％胰蛋白酶消化，用基础培养基洗涤离心(1000rpm5min两次)，用培养液悬浮细胞并调整细胞浓度为6×104/ml，接种细胞于96孔板内，每孔50μl(细胞数量3×103/孔)，各试验组各浓度接种3个复孔，待细胞贴壁后按进行分组加药，静置培养48小时。
2.2.1半数抑制浓度
取绿原酸、培美曲塞、氨喋呤，加水溶解后，用培养基稀释，在已接种的每个复孔加50μl药物培养基稀释液，配成的药物浓度如表1，对照组每个复孔加50μl培养基稀释液。
表1药物浓度
2.2.2联合用药
取绿原酸、培美曲塞、氨喋呤，加水溶解后，用培养基配制成绿原酸+培美曲塞(64μg/ml+2μg/ml)溶液、绿原酸+氨喋呤(64μg/ml+10μg/ml)溶液，在已接种的每个复孔加50μl药物溶液使用表2的药物浓度。
表2联合用药药物浓度
2.3测定
上述各试验组孔内加入10μlwst-1溶液，置37℃细胞培养箱继续孵育4小时后，在μ-quant微孔板测定仪上测定不同药物组和对照组440nm波长处的吸收值。
2.4数据处理
(1)计算gi(生长抑制率)＝(1-od药物组/od对照组)×100％
(2)以同一药物不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图，可得到剂量效应曲线。
(3)根据药物浓度及对应的肿瘤细胞抑制率，采用logit法ic50计算软件计算半数抑制浓度(ic50值)。
(4)联合用药以公式计算有无协同作用。其中e(a+b)为两药合用的抑制率，即实测合并效应，ea和eb为两药单用时的抑制率，分母(ea+eb-ea×eb)为期望合并效应，q为两者比值。q值在0.85～1.15时，两药合并效应为相加(+)，q值在1.15～20时为协同(++)，q值＞20为明显协同(+++)，q值在0.05～0.85时为拮抗，q值＜0.05为明显拮抗。
3、实验结果
3.1半数抑制浓度
试验结果如表3-1、3-2、3-3：
表3-1绿原酸对各肿瘤细胞株半数抑制浓度(μg/ml)
表3-2培美曲塞对各肿瘤细胞株半数抑制浓度(μg/ml)
表3-3氨喋呤对各肿瘤细胞株半数抑制浓度(μg/ml)
由表3-1、3-2、3-3可以看出绿原酸、培美曲塞、氨蝶呤分别对肺腺癌a549细胞株、乳腺癌mcf-7细胞株、肝癌bel-7402细胞株及急性淋巴细胞白血病tchu147细胞株的半数抑制浓度。
3.2联合用药对细胞株的抑制率
试验结果如表4：
表4联合用药对细胞株的抑制率
由表4可以看出：绿原酸与培美曲塞联合用药(32μg/ml+1μg/ml)，对肺腺癌a549细胞株、乳腺癌mcf-7细胞株、肝癌bel-7402细胞株抑、急性淋巴细胞白血病tchu147细胞株制作用的q值均在1.15～20间，两药具有协同作用。
绿原酸与氨喋呤联合用药(32μg/ml+1μg/ml)，对肺腺癌a549细胞株、乳腺癌mcf-7细胞株、肝癌bel-7402细胞株、急性淋巴细胞白血病tchu147细胞株抑制作用的q值均在1.15～20间，两药具有协同作用。
实验结果说明，绿原酸与二氢叶酸还原酶抑制剂具有协同作用，能提高药物单药用药的疗效。
实施例2联合用药的抗肿瘤动物实验
1、实验材料
试药：绿原酸、培美曲塞、氨喋呤、甲氨喋呤
动物：balb/c-nu小鼠(spf级，体重：16-21g，雌性)。
细胞系：lewis小鼠肺癌细胞株、h22小鼠肝癌细胞株、emt-6小鼠乳腺癌细胞株
2、试验方法
2.1方法
取对数生长期的细胞，经胰蛋白酶消化至脱壁后加入生理盐水制成细胞悬液，将制备好的细胞悬液按0.2ml·只-1(约含细胞数1×106个)，接种于小鼠左前腋窝下，并按体重随机分组，分别为绿原酸组、培美曲塞组、氨喋呤组、甲氨喋呤、绿原酸+培美曲塞联合用药组、绿原酸+氨喋呤、绿原酸+甲氨喋呤联合用药组、阴性组，每组6只，于接种后的第二日腹腔注射给药，给药容量为0.2ml·10g-1。绿原酸组每日一次，连续给药15次；培美曲塞、氨喋呤及甲氨喋呤组间隔5天给药一次，共给药两次；联合用药组，每日给一次绿原酸，连续给药15次，美曲塞、氨喋呤及甲氨喋呤分别间隔5天给药一次，共给药两次，阴性组每日一次腹腔注射生理盐水，连续给药15次。每5天给药前称小鼠重量并观察小鼠行为状态，待阴性组瘤体积约为0.5cm3时停止实验，眼球摘除取血测定wbc、hbc及hgb含量，脱颈椎处死小鼠并称重，剥取肿瘤并称重，计算抑瘤率。
2.2数据处理
(1)抑瘤率％＝[1-(给药组平均瘤重/阴性组平均瘤重)]×100％；
(2)两药合并q＝e(a+b)/(ea+eb-ea×eb)，其中e(a+b)为两药合用的抑制率，即实测合并效应，ea和eb为两药单用时的抑制率，分母(ea+eb-ea×eb)为期望合并效应，q为两者比值。q值在0.85～1.15时，两药合并效应为相加(+)，q值在1.15～20时为协同(++)，q值＞20为明显协同(+++)，q值在0.05～0.85时为拮抗，q值＜0.05为明显拮抗。
3、实验结果
3.1联合用药小鼠移植瘤抑瘤率的影响
结果见表5-1、5-2、5-3
表5-1联合用药对lewis肺癌小鼠移植瘤抑瘤率的影响
注：培美曲塞、氨喋呤及甲氨喋呤试验组小鼠终止试验时存活数量分别为4只、5只和5只，另联合
用药3试验组小鼠终止试验时存活数量为4只。
表5-2联合用药对h22肝癌小鼠移植瘤抑瘤率的影响
注：培美曲塞、氨喋呤及甲氨喋呤试验组小鼠终止试验时存活数量分别为4只、4只和5只，另联合用药3试验组小鼠终止试验时存活数量为5只。
表5-3联合用药对emt-6乳腺癌小鼠移植瘤抑瘤率的影响
注：培美曲塞、氨喋呤及甲氨喋呤试验组小鼠终止试验时存活数量分别为4只、3只和5只，另联合用药3试验组小鼠终止试验时存活数量为4只。
由表5-1、5-2、5-3可以看出，绿原酸与培美曲塞联合用药(20mg/kg+50mg/kg)，对lewis肺癌小鼠移植瘤抑瘤率的q值为1.37，在1.15～20间，两药具有协同作用；对h22肝癌小鼠移植瘤抑瘤率的q值为1.37，在1.15～20间，两药具有协同作用；对emt-6乳腺癌小鼠移植瘤抑瘤率的q值为1.33，在1.15～20间，两药具有协同作用。
绿原酸与氨喋呤联合用药(20mg/kg+40mg/kg)，对lewis肺癌小鼠移植瘤抑瘤率的q值为1.41，在1.15～20间，两药具有协同作用；对h22肝癌小鼠移植瘤抑瘤率的q值为1.43，在1.15～20间，两药具有协同作用；对emt-6乳腺癌小鼠移植瘤抑瘤率的q值为1.35，在1.15～20间，两药具有协同作用。
绿原酸与甲氨喋呤联合用药(20mg/kg+40mg/kg)，对lewis肺癌小鼠移植瘤、h22肝癌小鼠移植瘤及emt-6乳腺癌小鼠移植瘤抑瘤率的q值均0.05～0.85间，两药具有拮抗作用。
绿原酸与培美曲塞联合用药(20mg/kg+50mg/kg)以及绿原酸与氨喋呤联合用药(20mg/kg+40mg/kg)均能提高小鼠的存活率。绿原酸与甲氨喋呤联合用药(20mg/kg+40mg/kg)对提高小鼠的存活率效果不明显。
3.2联合用药小鼠血常规的影响
结果见表6-1、6-2、6-3
表6-1联合用药对lewis肺癌小鼠血常规的影响
与阴性组比较*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性组(培美曲塞、氨喋呤)比较δp＜0.05，δδp＜0.01
表6-2联合用药对h22肝癌小鼠血常规的影响
与阴性组比较*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性组(培美曲塞、氨喋呤)比较δp＜0.05，δδp＜0.01
表6-3联合用药对emt-6乳腺癌小鼠血常规的影响
与阴性组比较*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性组(培美曲塞、氨喋呤)比较δp＜0.05，δδp＜0.01由表6-1、6-2、6-3可以看出：绿原酸(20mg/kg)，能够显著改善lewis肺癌小鼠、h22肝癌小鼠及emt-6乳腺癌小鼠使用培美曲塞(50mg/kg)后血常规中wbc、rbc、hgb的降低现象；此外，对lewis肺癌小鼠、h22肝癌小鼠及emt-6乳腺癌小鼠使用氨喋呤(40mg/kg)后血常规中wbc、rbc、hgb降低同样具有显著的改善的作用；说明绿原酸对叶酸代谢受阻导致的造血功能损伤具有修复作用。
3.3联合用药对小鼠体重的影响
结果见表7-1、7-2、7-3
表7-1联合用药对lewis肺癌小鼠体重的影响
与阴性组比较*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性组(培美曲塞、氨喋呤)比较δp＜0.05，δδp＜0.01
表7-2联合用药对h22肝癌小鼠体重的影响
与阴性组比较*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性组(培美曲塞、氨喋呤)比较δp＜0.05，δδp＜0.01
表7-3联合用药对emt-6乳腺癌小鼠体重的影响
与阴性组比较*p＜0.05，**p＜0.01；与阳性组(培美曲塞、氨喋呤)比较δp＜0.05，δδp＜0.01
由表7-1、7-2、7-3可以看出：绿原酸(20mg/kg)，能够显著提高lewis肺癌小鼠、h22肝癌小鼠及emt-6乳腺癌小鼠使用培美曲塞(50mg/kg)后体重下降的现象；此外，对lewis肺癌小鼠、h22肝癌小鼠及emt-6乳腺癌小鼠使用氨喋呤(40mg/kg)后体重下降同样具有显著的改善的作用。说明绿原酸能够缓解二氢叶酸还原酶抑制剂药物导致的体重减轻，提高小鼠的生活质量。
实验结果说明，绿原酸与培美曲塞等dhfr抑制剂具有协同作用，能够提高单独用药的疗效，并可以缓解dhfr抑制剂导致的造血功能损伤及体重变轻的毒副作用。
综上，本发明绿原酸与培美曲塞等dhfr抑制剂的联合使用可以发挥协同增效的作用，并缓解dhfr抑制剂导致的造血功能损伤及体重变轻，有效降低dhfr抑制剂的毒副作用，将绿原酸与dhfr抑制剂联合用药物的疗效优良，毒性小，临床应用前景良好。