一种地衣芽孢杆菌与低聚木糖的组合物及其用途的制作方法

本发明涉及复方药物领域中的一种地衣芽孢杆菌与低聚木糖的药物组合物及其用途。

背景技术：

地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformisbl63516)活菌胶囊是一类应用广泛的需氧型益生菌制剂，口服进入肠道后通过夺获氧分子的方式制造肠腔内的厌氧环境,促进厌氧菌(如双歧杆菌、乳酸杆菌等)的正常繁殖,同时可以抑制腐败菌生长，减少细菌内毒素的产生；使肠道ph值得以降低,维持酸性环境有利于氨及内毒素的排泄。中国专利92113318.9报道了地衣芽孢杆菌63516株及其治疗腹泻的用途，目前常用于儿童及成人的腹泻的治疗。

低聚木糖(xylo-oligoosaccharides，xos)是一种具有高稳定性的低聚糖类益生元，可以选择性促进肠道益生菌的繁殖，与益生菌相辅相成共同维护肠黏膜屏障功能。低聚木糖常用于儿童便秘的治疗。

高胆固醇血症是指血液中总胆固醇和/或低密度脂蛋白(ldl)胆固醇或非高密度脂蛋白(hdl)胆固醇(定义为总胆固醇减去高密度脂蛋白胆固醇[hdl-c]后的部分)升高，又常被称为血脂异常，这种情况下可能伴随hdl-c降低或甘油三酯升高。

对于高胆固醇血症，目前常用他汀类药物进行治疗，但该类药物可能会引起肌病的副作用，其常见症状是非特异性肌肉或关节痛。在罕见情况下，肌病可以导致横纹肌溶解并导致肾衰而死亡。因此，研制开发一种更加安全高效的防治高胆固醇血症的药物是目前亟待解决的新课题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种地衣芽孢杆菌与低聚木糖的药物组合物及其用途，该药物组合物具有地衣芽孢杆菌与低聚木糖可产生协同防治高胆固醇血症，有效协同降低低密度脂蛋白胆固醇和/或总胆固醇、安全性高等特点。

本发明的目的是这样实现的：一种地衣芽孢杆菌和低聚木糖的药物组合物，所述药物组合物用于预防或治疗高胆固醇血症，所述的胆固醇为低密度脂蛋白胆固醇和/或总胆固醇；所述药物组合物中，所述地衣芽孢杆菌与低聚木糖的比为2.5-20×10⁸:0.5-6，所述地衣芽孢杆菌的单位为cfu，所述低聚木糖的单位为g；所述的高胆固醇血症是由高脂饮食引起的；所述的地衣芽孢杆菌选自地衣芽孢杆菌63516株；所述地衣芽孢杆菌与低聚木糖的比为5-15×10⁸:1-4，所述地衣芽孢杆菌的单位为cfu，所述低聚木糖的单位为g；所述地衣芽孢杆菌与低聚木糖的比为6-9×10⁸:1.5-2.5，所述地衣芽孢杆菌的单位为cfu，所述低聚木糖的单位为g；优选的所述地衣芽孢杆菌与低聚木糖的比为7.5×10⁸:2，所述地衣芽孢杆菌的单位为cfu，所述低聚木糖的单位为g；所述的高胆固醇血症为伴有肥胖的高胆固醇血症；所述的高胆固醇血症为伴有肝脏il-1β升高的高胆固醇血症；所述的高胆固醇血症为伴有d-乳糖升高的高胆固醇血症。

一种地衣芽孢杆菌和低聚木糖在制备用于预防或治疗高胆固醇血症药物中的应用，所述的胆固醇为低密度脂蛋白胆固醇和/或总胆固醇；所述地衣芽孢杆菌与低聚木糖的比为2.5-20×10⁸:0.5-6，所述地衣芽孢杆菌的单位为cfu，所述低聚木糖的单位为g；优选的，所述地衣芽孢杆菌与低聚木糖的比为5-15×10⁸:1-4，所述地衣芽孢杆菌的单位为cfu，所述低聚木糖的单位为g；更优选的，所述地衣芽孢杆菌与低聚木糖的比为6-9×10⁸:1.5-2.5，所述地衣芽孢杆菌的单位为cfu，所述低聚木糖的单位为g；最优选的，所述地衣芽孢杆菌与低聚木糖的比为7.5×10⁸:2，所述地衣芽孢杆菌的单位为cfu，所述低聚木糖的单位为g；所述的高胆固醇血症是由高脂饮食引起的；所述的地衣芽孢杆菌选自地衣芽孢杆菌63516株；所述的高胆固醇血症为伴有肥胖的高胆固醇血症；所述的高胆固醇血症为伴有肝脏il-1β升高的高胆固醇血症；所述的高胆固醇血症为伴有d-乳糖升高的高胆固醇血症。

本发明的要点在于提供了一种地衣芽孢杆菌与低聚木糖的药物组合物及其用途，其原理是：(1)相比于地衣芽孢杆菌和低聚木糖各自单独给药，地衣芽孢杆菌和低聚木糖联合给药后，低密度脂蛋白胆固醇水平显著降低，无论单独与地衣芽孢杆菌组、低聚木糖组还是高脂饮食组(模型组)相比，差异均有统计学上的显著意义(p<0.01或p<0.001)，产生了协同降低低密度脂蛋白胆固醇水平的技术效果，而单独应用地衣芽孢杆菌并无具有统计学意义的降低低密度脂蛋白胆固醇水平的技术效果；(2)相比于地衣芽孢杆菌和低聚木糖各自单独给药，地衣芽孢杆菌和低聚木糖联合给药后，总胆固醇水平显著降低(与高脂饮食组相比，p<0.01；与地衣芽孢杆菌干预组相比，p<0.05；与低聚木糖组相比，总胆固醇水平下降了14％)，产生了协同降低总胆固醇水平的技术效果，而单独应用地衣芽孢杆菌并无具有统计学意义的降低总胆固醇水平的技术效果。

一种地衣芽孢杆菌与低聚木糖的药物组合物及其用途与现有技术相比，该药物组合物具有地衣芽孢杆菌与低聚木糖可产生协同防治高胆固醇血症，有效协同降低低密度脂蛋白胆固醇和/或总胆固醇、安全性高等特点，将广泛的应用于药物制剂及其应用领域中。

附图说明

图1为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠体重的影响图。

图2为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠内脏脂肪比率的影响图。

图3为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清总胆固醇(t-cho)水平的影响图。

图4为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平的影响图。

图5为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清甘油三酯(tg)水平的影响。

图6为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平的影响。

图7为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清细菌脂多糖(lps)水平的影响图。

图8为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠肝脏细菌脂多糖(lps)水平的影响图。

图9为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠肝脏白细胞介素1β(il-1β)水平的影响图。

图10为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠肝脏肿瘤坏死因子-a(tnf-a)水平的影响图。

图11为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清d-乳酸(d-lactic)水平的影响图。

图12为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠谷草转氨酶(ast)水平的影响图。

图13为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠谷丙转氨酶(alt)水平的影响图。

图14为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对抗生素诱导受损小鼠体重的影响图。

图15为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对抗生素诱导受损小鼠血清中lps影响图。

图16为地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对抗生素诱导受损小鼠肝脏中lps影响图。

图17为地衣芽孢杆菌及低聚木糖对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠血清白介素-10(il-10)影响图。

图18为地衣芽孢杆菌及低聚木糖对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠血清lps影响图。

图19为地衣芽孢杆菌及低聚木糖对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠组织mpo浓度影响图。

图20为地衣芽孢杆菌及低聚木糖对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠组织白介素-17影响图。

具体实施方式

实施例一

地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠的影响

1、方法：

1.1动物分组及造模

健康sd雄性大鼠30只，购自大连医科大学实验动物中心，体重400±20g。地衣芽胞杆菌bl63516来自东北制药集团沈阳第一制药有限公司。随机分为对照组(con)，高脂饮食组(hf)，低聚木糖干预组(xos)，地衣芽胞杆菌干预组(bl)，低聚木糖加地衣芽胞杆菌联合干预组(xos-bl)，每组6只。除正常对照组外，其它组均给予高脂饮食(高脂鼠粮成分见表1)，同时每日给予10mg/ml丙基硫氧嘧啶(ptu)灌喂。同时从第1日起给予xos组大鼠2g/ml低聚木糖0.4ml灌喂，bl组大鼠7.5×10⁸cfu/ml地衣芽胞杆菌0.4ml灌喂，xos-bl组大鼠2g/ml低聚木糖加7.5×10⁸cfu/ml地衣芽胞杆菌混合溶液0.4ml灌喂，连续21日。第22日处死大鼠，内脏脂肪称重，留取血清，结肠及肝脏。

表1高脂饲料成分表

1.2血脂水平评估

高脂饮食大鼠模型中沿腹中线剖开大鼠腹腔，使用无菌磷酸盐缓冲液(pbs)将肝脏冲洗干净后统一取同一部位1×1cm左右大小肝组织4％甲醛固定、石蜡包埋切片，行苏木精-伊红(he)染色，并在光镜下进行观察评估。

使用elisa方法检测血清中高密度脂蛋白(hdl-c)含量，试剂盒购自上海朗顿生物科技有限公司。血清总胆固醇(t-cho)水平使用甘油胆固醇氧化酶-过氧化物酶法测定,血清甘油三酯(tg)水平使用甘油磷酸氧化酶过氧化物酶法测定,血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平使用直接法测定，试剂盒购自于南京建成生物科技有限公司。

1.3肠道屏障功能评估

处死大鼠后,沿腹中线剖开腹腔，分离全段结肠进行结肠拍照，并测量长度，观察炎症损伤。使用无菌磷酸盐缓冲液(pbs)将肠内容物冲洗干净后统一取同一部位1cm左右远端结肠组织4％甲醛固定、石蜡包埋切片，行苏木精-伊红(he)染色，图像处理系统拍照分析结肠的病理学改变，结肠炎模型小鼠进行结肠病理评分。

收集血液于无菌eppendor管中，静置2小时，4℃3000rpm离心10min，吸取上清，-80℃冻存。使用elisa方法检测血清中的细菌脂多糖(lipopolysaccharides,lps)，试剂盒由上海朗顿生物科技有限公司提供。称取100mg的肝脏组织于无菌eppendor管中，按照1：9的比例加入硫酸缓冲盐溶液(pbs)，用组织处理器制备组织匀浆，4℃3000rpm离心20min，吸取上清液，-80℃保存，elisa方法测定肝脏lps含量，试剂盒由上海朗顿生物科技有限公司提供。

1.4肝组织中il-1β、tnf-α、d-乳酸、谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平评估

参照elisa试剂盒说明书检测肝组织中il-1β、tnf-α、d-乳酸、谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平：称取100mg的肝脏组织于无菌eppendor管中，按照1：9的比例加入硫酸缓冲盐溶液(pbs)，用组织处理器制备组织匀浆，4℃3000g离心20min，吸取上清液，-80℃保存。elisa试剂盒均购自上海朗顿生物科技有限公司。

1.5统计学分析

使用graphpad进行统计学分析，对两组之间进行t检验比较，p<0.05具有统计学差异。

2、结果

2.1大鼠体重及内脏脂肪变化

5组大鼠体重变化见附图1，第6天高脂饮食干预组hf组大鼠体重显著高于con组大鼠(p<0.01)，bl组体重显著低于hf组大鼠(p<0.05)。3周后bl组大鼠体重显著低于hf组(p<0.05)。如附图2所示，hf组内脏脂肪比率(visceralfatratio)明显高于con组，其余4组较hf组内脏脂肪比率有所降低，xos-bl组内脏脂肪比率分别单独与xos组、bl组和hf组比，均没有统计学上的显著性差异，p>0.05。

2.2大鼠血脂变化

2.2.1地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清总胆固醇(t-cho)水平的影响

参见附图3、表2及组间的统计学差异情况。图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表2：对血清总胆固醇(t-cho)水平的影响

hf组与con组相比，t＝8.114，p<0.001(p<0.0001)；

hf组与bl组相比，t＝0.5860，p>0.05(p＝0.5722)；

bl组与xos-bl组相比，t＝2.945，p<0.05(p＝0.0164)；

bl组与xos组相比，t＝2.114，p>0.05(p＝0.0636)；

xos组与xos-bl组相比，t＝1.570，p>0.05(p＝0.1474)；

hf组与xos组相比，t＝2.679，p<0.05(p＝0.0231)；

hf组与xos-bl组相比，t＝3.503，p<0.01(p＝0.0057)；

2.2.2地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平的影响

参见附图4、表3及组间的统计学差异情况。图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表3：对血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平的影响

hf组与con组相比，t＝8.119，p<0.001(p<0.0001)；

hf组与bl组相比，t＝0.9068，p>0.05(p＝0.3882)；

bl组与xos-bl组相比，t＝7.637，p<0.001(p<0.0001)；

bl组与xos组相比，t＝2.366，p<0.05(p＝0.0422)；

xos组与xos-bl组相比，t＝3.512，p<0.01(p＝0.0056)；

hf组与xos组相比，t＝2.438，p<0.05(p＝0.0350)；

hf组与xos-bl组相比，t＝4.912，p<0.001(p＝0.0006)；

2.2.3地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清甘油三酯(tg)水平的影响

参见附图5、表4及组间的统计学差异情况。图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表4：对血清甘油三酯(tg)水平的影响

hf组与con组相比，t＝0.5070，p>0.05(p＝0.6231)；

hf组与bl组相比，t＝2.645，p<0.05(p＝0.0267)；

bl组与xos-bl组相比，t＝1.913，p>0.05(p＝0.0880)；

bl组与xos组相比，t＝1.063，p>0.05(p＝0.3157)；

xos组与xos-bl组相比，t＝1.246，p>0.05(p＝0.2413)；

hf组与xos组相比，t＝2.520，p<0.05(p＝0.0304)；

hf组与xos-bl组相比，t＝1.795，p>0.05(p＝0.1030)；

2.2.4地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平的影响

参见附图6、表5及组间的统计学差异情况。图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表5：对血清高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平的影响

hf组与con组相比，t＝0.6038，p>0.05(p＝0.5609)；

hf组与bl组相比，t＝0.8445，p>0.05(p＝0.4263)；

bl组与xos-bl组相比，t＝0.9800，p>0.05(p＝0.3721)；

bl组与xos组相比，t＝0.1741，p>0.05(p＝0.8667)；

xos组与xos-bl组相比，t＝1.049，p>0.05(p＝0.3247)；

hf组与xos组相比，t＝0.4962，p>0.05(p＝0.6305)；

hf组与xos-bl组相比，t＝0.9643，p>0.05(p＝0.3631)；

2.3血清lps及肝组织lps水平

2.3.1地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清细菌脂多糖(lps)水平的影响

参见附图7、表6及组间的统计学差异情况。图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表6：对血清细菌脂多糖(lps)水平的影响

hf组与con组相比，t＝0.1370，p>0.05(p＝0.8938)；

hf组与bl组相比，t＝2.765，p<0.05(p＝0.0245)；

bl组与xos-bl组相比，t＝1.786，p>0.05(p＝0.1119)；

bl组与xos组相比，t＝0.05005，p>0.05(p＝0.9615)；

xos组与xos-bl组相比，t＝0.7828，p>0.05(p＝0.4539)；

hf组与xos组相比，t＝1.979，p>0.05(p＝0.0792)；

hf组与xos-bl组相比，t＝4.281，p<0.01(p＝0.0016)；

2.3.2地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠肝脏细菌脂多糖(lps)水平的影响

参见附图8、表7及组间的统计学差异情况。图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表7：对肝脏细菌脂多糖(lps)水平的影响

hf组与con组相比，t＝2.709，p<0.05(p＝0.0220)；

hf组与bl组相比，t＝3.470，p<0.01(p＝0.0071)；

bl组与xos-bl组相比，t＝0.4349，p>0.05(p＝0.6739)；

bl组与xos组相比，t＝0.6205，p>0.05(p＝0.5503)；

xos组与xos-bl组相比，t＝0.3293，p>0.05(p＝0.7487)；

hf组与xos组相比，t＝1.976，p>0.05(p＝0.0764)；

hf组与xos-bl组相比，t＝3.167，p<0.05(p＝0.0100)；

2.4对白细胞介素1β、肿瘤坏死因子-a、d-乳酸、谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平的影响

根据elisa检测结果评价发现，地衣芽孢杆菌对于高脂饮食(hfd)诱导的肥胖模型小鼠肝脏促炎细胞因子il-1β、tnf-α具有抑制作用，特别是对于il-1β水平的降低具有显著统计学差异。监测肝功能的指标alt和ast结果显示各组小鼠肝功能无明显变化，说明hfd及益生菌的使用剂量对小鼠肝功能无明显影响。血清d-乳酸检测结果显示地衣芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌联合低聚木糖有助于降低血清d-乳酸含量，说明可能增强了小鼠的肠屏障功能。

2.4.1地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠肝脏白细胞介素1β(il-1β)水平的影响

参见附图9、表8及组间的统计学差异情况。图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表8：对肝脏白细胞介素1β(il-1β)水平的影响

hf组与con组相比，t＝3.004，p<0.05(p＝0.0398)；

hf组与bl组相比，t＝4.808，p<0.01(p＝0.0086)；

bl组与xos-bl组相比，t＝3.9838，p<0.05(p＝0.0170)；

bl组与xos组相比，t＝0.09853，p>0.05(p＝0.9262)；

xos组与xos-bl组相比，t＝2.457，p>0.05(p＝0.0699)；

hf组与xos组相比，t＝3.264，p<0.05(p＝0.0310)；

hf组与xos-bl组相比，t＝7.942，p<0.01(p＝0.0014)；

2.4.2地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠肝脏肿瘤坏死因子-a(tnf-a)水平的影响

参见附图10、表9及组间的统计学差异情况。图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表9：对肝脏肿瘤坏死因子-a(tnf-a)水平的影响

hf组与con组相比，t＝6.197，p<0.01(p＝0.0034)；

hf组与bl组相比，t＝1.313，p>0.05(p＝0.2594)；

bl组与xos-bl组相比，t＝1.491，p>0.05(p＝0.2103)；

bl组与xos组相比，t＝0.3162，p>0.05(p＝0.7676)；

xos组与xos-bl组相比，t＝1.356，p>0.05(p＝0.2467)；

hf组与xos组相比，t＝1.549，p>0.05(p＝0.1963)；

hf组与xos-bl组相比，t＝2.054，p>0.05(p＝0.1091)；

2.4.3地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠血清d-乳酸(d-lactic)水平的影响

参见附图11、表10及组间的统计学差异情况。图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表10：对血清d-乳酸(d-lactic)水平的影响

hf组与con组相比，t＝1.210，p>0.05(p＝0.2929)；

hf组与bl组相比，t＝1.901，p>0.05(p＝0.1302)；

bl组与xos-bl组相比，t＝1.300，p>0.05(p＝0.2635)；

bl组与xos组相比，t＝0.0000，p>0.05(p＝1.0000)；

xos组与xos-bl组相比，t＝0.8173，p>0.05(p＝0.4596)；

hf组与xos组相比，t＝1.175，p>0.05(p＝0.3050)；

hf组与xos-bl组相比，t＝4.709，p<0.01(p＝0.0092)；

2.4.4地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠谷草转氨酶(ast)水平的影响

参见附图12、表11及组间的统计学差异情况。图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表11：对谷草转氨酶(ast)水平的影响

hf组与con组相比，t＝1.313，p>0.05(p＝0.2594)；

hf组与bl组相比，t＝0.4629，p>0.05(p＝0.6675)；

bl组与xos-bl组相比，t＝1.225，p>0.05(p＝0.2879)；

bl组与xos组相比，t＝2.524，p>0.05(p＝0.0651)；

xos组与xos-bl组相比，t＝2.795，p<0.05(p＝0.0491)；

hf组与xos组相比，t＝1.888，p>0.05(p＝0.1321)；

hf组与xos-bl组相比，t＝0.3873，p>0.05(p＝0.7183)；

2.4.5地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对高脂饮食大鼠谷丙转氨酶(alt)水平的影响

参见附图13、表12及组间的统计学差异情况。图中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表12：对谷丙转氨酶(alt)水平的影响

hf组与con组相比，t＝1.841，p>0.05(p＝0.1394)；

hf组与bl组相比，t＝0.6794，p>0.05(p＝0.5342)；

bl组与xos-bl组相比，t＝0.1696，p>0.05(p＝0.8735)；

bl组与xos组相比，t＝0.8616，p>0.05(p＝0.4375)；

xos组与xos-bl组相比，t＝0.8686，p>0.05(p＝0.4341)；

hf组与xos组相比，t＝1.332，p>0.05(p＝0.2538)；

hf组与xos-bl组相比，t＝0.3393，p>0.05(p＝0.7515)；

实施例二

地衣芽孢杆菌与低聚木糖单用及合用对抗生素诱导受损小鼠肠道粘膜屏障功能的影响评价

1.试验方法

1.1动物模型的建立

健康清洁级雄性balb/c雄性小鼠50只，购自大连医科大学实验动物中心，体重20±2g。随机分为正常对照组(con组，n＝10)，模型组(cs组，n＝10)，低聚木糖干预组(xos组，n＝10)，地衣芽胞杆菌干预组(bl组，n＝10)，低聚木糖加地衣芽胞杆菌联合干预组(xos-bl组，n＝10)。前8日每天给予con组小鼠生理盐水0.2ml/只，1天2次，其余4组小鼠每只给予300mg/ml头孢曲松钠0.2ml，1天2次灌服，短期大量服用抗生素以建立肠道受损模型。第9天起给予con组和cs组小鼠生理盐水0.2ml/只灌喂，给予xos组小鼠低聚木糖0.012g/ml灌喂，bl组小鼠给予3×10⁷cfu/ml地衣芽胞杆菌灌喂，xos-bl组小鼠给予0.012g/ml加3×10⁷cfu/ml混合溶液灌喂连续8日。

1.2小鼠基本情况评估

每2日观察记录小鼠体重，每日评估其精神活动状态、毛发色泽、食量、粪便性状，并与第8日及第16日留取粪便。

1.3lps影响

收集小鼠血液于无菌eppendor管中，静置2小时，4℃3000rpm离心10min，吸取上清，-80℃冻存。使用elisa方法检测血清中的细菌脂多糖(lipopolysaccharides,lps)含量。称取100mg的肝脏组织于无菌eppendor管中，按照1：9的比例加入硫酸缓冲盐溶液(pbs)，用组织处理器制备组织匀浆，4℃3000rpm离心20min，吸取上清液，-80℃保存，使用elisa方法测定肝脏lps含量，试剂盒均由上海朗顿生物科技有限公司提供。

2.实验结果

2.1小鼠体重及疾病症状变化

正常对照con组小鼠基本情况良好，无异常。第4天起，给予抗生素灌喂的4组小鼠较con组精神差，毛发无光泽，进食量及饮水量减少，粪便稀薄。实验过程中con组小鼠死亡1只，cs组死亡2只，xos组小鼠死亡1只，bl组小鼠死亡1只，xos-bl组死亡2只。体重变化见附图14，于第3天起4组抗生素干预组小鼠较对照组体重明显减轻(p<0.05)，于第9天差异最为明显，其中bl组与con组差异最为显著(p<0.0001)。停止头孢曲松钠灌胃后，4组小鼠体重均有所回升，4组间无统计学差异。

2.2血清及肝脏细胞因子

如附图15所示，cs组血清中的lps水平与con组相比有显著差异，经低聚木糖、地衣芽胞杆菌以及低聚木糖与地衣芽胞杆菌联合干预的3组小鼠血清lps水平较cs组显著降低，其中bl组与cs组差异最为显著(p<0.001)。如附图16所示，xos组、bl组及xos-bl组肝脏lps水平较cs组明显降低。(注：图中，*表示该组与cs组相比p<0.05；**表示该组与cs组相比p<0.01；***表示该组与cs组相比p<0.001)。

实施例三

地衣芽孢杆菌及低聚木糖对葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的小鼠结肠炎的调节作用研究

1.方法：

1.1动物分组及造模

健康balb/c雌性小鼠50只，购自大连医科大学实验动物中心，体重20±2g。随机分为正常对照组(对照组)，结肠炎模型组(dss组)，低聚木糖干预组(糖组)，地衣芽胞杆菌干预组(菌组)，低聚木糖加地衣芽胞杆菌联合干预组(糖加菌组)，每组10只。除正常对照组其余4组小鼠以3％(m/v)dss作为唯一饮用水，自由饮用，7天建立结肠炎模型。同时从第1日给予3％dss自由饮用起，糖组小鼠给予0.012g/ml地衣芽胞杆菌灌喂，菌组小鼠给予3×10⁷cfu/ml地衣芽胞杆菌灌喂，糖加菌小鼠给予0.012g/ml加3×10⁷cfu/ml混合溶液灌喂连续7日。第8日眼球取血处死小鼠，留取血清，结肠及肠内容。

1.2血清及结肠细胞因子检测

收集小鼠血液于无菌eppendorf管中，静置2小时，4度3000g离心10min，吸取上清，-80度冻存。使用酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)方法检测血清中的白介素10(il-10)含量，细菌脂多糖(lipopolysaccharides,lps)含量。称取100mg的结肠组织于无菌eppendor管中，按照1：9的比例加入硫酸缓冲盐溶液，用组织处理器制备组织匀浆，4度3000g离心20min，吸取上清液，-80度保存，使用elisa方法测定髓过氧化物酶(mpo)及白介素17(il-17)含量，elisa试剂盒购于上海朗顿生物科技有限公司。

2.结果

2.1血清白介素-10(il-10),lps及肠组织白介素-17(il-17),mpo浓度变化

dss组血清il-10、lps以及结肠mpo值均与对照组有差异，经糖、菌干预后以上细胞因子值均有改变。如附图17所示，dss组血清il-10值与其余4组均有差异，与糖组和菌组差异显著(p＝0.0013，t＝4.268；p＝0.0018，t＝4.212)。如附图18所示，dss组血清lps值高于其余4组，与对照组差异显著(p＝0.0096，t＝4.662)，经低聚木糖、地衣芽胞杆菌以及低聚木糖与地衣芽胞杆菌联合干预的3组小鼠血清lps值较dss组显著降低。如附图19所示，dss组结肠mpo值明显高于对照组(p<0.0001，t＝6.298)，低聚木糖干预组mpo值大幅降低，与dss组有显著差异(p<0.0001，t＝12.78)，低聚木糖与地衣芽胞杆菌联合干预组小鼠结肠mpo与dss组亦有差异(p＝0.0373，t＝2.665)。如附图20所示，il-17各组均无明显差异。