专利名称：口蹄疫的抗原化抗体疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及能引发抗口蹄疫之免疫力的疫苗。
抗体是身体免疫系统对侵入体内的已知为抗原的外源物质作出反应而产生的蛋白质。疫苗可引发免疫应答，随即可保护宿主免受致病剂(抗原)的感染。
通常，疫苗由致病生物体或其部分组成。组成疫苗的生物体或其某些部分经常是灭活的或减毒的以使宿主体内的致病生物体失去部分或全部的致病能力。在大多数情况下，当在体外培养细菌，和某种程度上为病毒时，它们会慢慢失去在生物体内生存并繁殖的能力。
有多种方法可产生疫苗，大多数类型的疫苗包括病毒疫苗，生物药物疫苗，多抗原-肽疫苗和多蛋白疫苗。
口蹄疫(下文也称之为FMD)是感染所有偶蹄动物的高传染性，严重导致衰弱的疾病。该病在世界上很多发展中国家流行，尤其是，亚洲的猪经常被FMD感染。FMD降低家畜的生产率，带来很高的免疫接种花费，限制了家畜和家畜产品的国际贸易。FMD是病毒传染性疾病，口蹄疫病毒(下文也称之为FMDV)是具有约8000个核苷酸长的单链有义RNA基因组的小的动物病毒。
针对FMD已产生了两种主要类型的疫苗，它们是常规疫苗和合成的肽疫苗。抗FMDV的常规疫苗可使用灭活的FMD病毒或活的减毒FMD病毒。尽管常规疫苗方法一般是有效的，但还有几个相伴随的不符合要求的缺点。
首先，它在花费上不合算。这一类型的疫苗由大量活的传染性病毒制成，维持和加工大量传染性病毒是昂贵的，费力的，还需占用大量空间。
第二，也是最重要的缺点是这些疫苗具有潜在的危险性。最近几年大多数FMD的突然蔓延是由疫苗生产单位泄漏病毒引起的，或者是由使用未完全灭活或未充分减毒的病毒引起的。例如，本世纪80年代，包括意大利，英国，法国的欧洲国家发生了多次口蹄疫大流行，台湾于1996年也发生了口蹄疫大流行。由于经常发现导致口蹄疫流行的病毒与欧洲生产厂家所用的毒株密切相关或甚至相同，最初的口蹄疫大流行可能是由未充分灭活的疫苗或由疫苗生产厂泄漏的病毒引起的。
另一个与生产常规疫苗相关的问题是它们是热不稳定的。当暴露于升高的温度中时，常规的FMD疫苗相对不稳定，不得不将它们置于低温中保存。持久地维持所需的低温经常是难以做到的，特别是在热带国家更是如此。
常规疫苗生产方法之病毒培养方案中的另外一个潜在问题是使用胎牛血清病毒培养。疾病可能由胎牛血清传入并影响经免疫的动物。
使用常规FMD疫苗的另一个主要缺点是使用常规方法产生的大多数疫苗是灭活的组织培养病毒的相对粗的制品。这种组织培养的混合物可导致严重的副作用，如变应性反应和易感家畜的流产。
较新形式的FMDV疫苗不使用灭活的病毒。它们是合成的肽疫苗和重组蛋白疫苗。FMDV病毒蛋白1(VP1)上的免疫显性位点的鉴定为设计合成肽和重组蛋白FMD疫苗提供了新的思路。与常规疫苗相比，这两种类型的疫苗在生产和应用中都是安全的。它们也很容易处理，储存，运输，经设计能符合特殊的需要。
在每个末端加上半胱氨酸残基之后，用戊二醛或空气氧化使VP1的141a.a.-160a.a肽聚合化，从而开始合成的FMDV肽疫苗研究，发现未偶联的肽可成为免疫原性的肽。1987年，Francis及其同事报道了具有游离巯基的C末端半胱氨酸的存在可大大增加游离的141-160a.a.肽的免疫原性。当加上多个半胱氨酸残基时也可得到类似的结果。这表明游离巯基半胱氨酸残基的存在可以形成导致更适宜的二级结构的肽二聚体，所述二级结构可在体内导致免疫复合物的形成(Francis，1995)。根据这一思路，将串联重复(Cys 137-162(×2))的免疫原性与单拷贝Cys 137-163肽的免疫原性相比较，发现串联重复的FMDV肽一般比单拷贝的二硫键二聚体的免疫原性更强。增加半胱氨酸残基可导致二硫键四聚体结构的形成，该结构可进一步改善免疫应答。
使用Tam多抗原肽(MAP)系统(Tam 1988)进一步检测多拷贝合成肽的想法。该系统可以在分支赖氨酸骨架上固相合成肽抗原以产生几个多赖氨酸八聚体构建体。具有多拷贝肽的该系统导致大大增强的免疫应答。
为了应用多拷贝FMDV肽，通过将小的肽序列与编码较大蛋白质的基因融合应用了重组DNA技术。这些较大的重组疫苗蛋白质具有多个特点。与通过化学交联制备的那些结构相比，将肽与载体连接的目的是提供完全均一和确定的结构以提供免疫原(Francis，1991)。首先使单或多拷贝的FMDV免疫原性肽与细菌蛋白质，β-半乳糖苷酶的N-末端融合以研究此方法(Broekhuijsen等，1986；Winther等，1986)。选择β-半乳糖苷酶的原因是已表明它可引发产生针对位于N末端的VP1表位的抗体，它也含有几个T细胞表位(Krzych等，1982；Manca等，1985)。已发现这个多拷贝FMDV肽-β-半乳糖苷酶重组蛋白的免疫原性与使用赖氨酸背景系统得到的(Broekhuijsen等，1987)相类似。
然后，使用与乙肝病毒核心抗原(HBcAg)之N末端融合的FMDV肽序列进一步开发多个肽的提供以产生HBc融合颗粒。据报道这一27nm的杂合蛋白颗粒能完全保护豚鼠，其结果与灭活的FMDV VP1142a.a.-160a.a.肽所引发的相似，可保护动物免受攻击性感染。
尽管最初是有希望的，但合成肽方法和重组蛋白疫苗方法似乎存在缺点，其中有三级结构的可预见性差和免疫原性弱。如果肽表现出其所需功能必需的三维水平上特定的构象的话，溶液中的肽却以不总是最适于受体结合(B细胞受体和可能是T细胞受体和主要组织相容性基因产物)的构象存在。
在合成肽相对较小的情况下，注射后容易在体内降解。因此，它们在提供长期免疫应答方面不是很有效，这可能是因为重组蛋白疫苗不能表现出适当的构象。另外，肽合成是昂贵的，可导致疫苗的高生产花费。如上所述，通过与β-半乳糖苷酶或HBcAg类的微生物蛋白质之N末端融合可在肽疫苗上提供FMDV表位。然而，使用β-半乳糖苷酶可引发很多额外的和不必要的免疫应答(Bona等，1994)。用此重组蛋白疫苗重复免疫之后，可产生如即发性超敏反应的副作用，导致动物患严重的枯草热和气喘病。
核酸疫苗或DNA疫苗代表着控制传染因子的新方法。这些新疫苗易于设计和制备。使用重组DNA技术将编码用作免疫原的一种或多种蛋白质的DNA序列克隆至真核表达载体中。
抗原化抗体是其可变区经基因工程改造可表达不同抗原之表位的抗体。抗原化抗体可用作针对特异性B或T细胞表位产生免疫应答的免疫原。因此，抗原化抗体可用于替代常规或合成肽免疫接种法。
因此，既可提供安全的可能性又可提供效力的最有效的疫苗类型是抗原化抗体疫苗。抗体的抗原化方法由下列步骤组成，即将得自非免疫球蛋白之抗原的肽表位移植到抗体分子的互补决定区(“CDR”)环中。由于CDR环暴露于抗体分子的表面，它们为抗体的抗原性作出了主要的贡献。与上述合成疫苗不同的是，抗原化抗体经由Fc受体靶向抗原呈递细胞，籍此使II类主要组织相容性(MHC)分子的抗原呈递最大化。抗原化抗体也为B细胞提供了连续不断的抗原肽来源以在I类MHC分子中呈递。除了B细胞水平上的免疫原性外，抗原化抗体作为经加工的肽产物起作用以产生Th-细胞免疫原性。
因此，本发明的目的是提供抗口蹄疫的抗原化抗体疫苗以提供克服了现有技术的一些缺点，较安全，更便宜和/或更有效的疫苗产品，并为公众提供有用的选择。
尽管使用的是与奶牛IgG连接的奶牛FMDV病毒表位，本发明仍可用于抗猪FMD，该疫苗也可用于如奶牛等的其它动物。
本发明由疫苗组成，所述疫苗的功能可由四种不同形式提供，即两种蛋白质疫苗构建体和两种相关的DNA疫苗对应物构建体。该疫苗所有的形式都提供抗猪FMD和FMDV的免疫功能。特别的是，蛋白质形式的疫苗是抗原化抗体疫苗；此肽序列含有取代猪IgG之CDR环的FMDV表位或FMDV单个或串联重复的表位由猪IgG重链恒定区蛋白质携带的嵌合蛋白。
例如，用基因工程的方法改造用于移植到CDR中的特定FMDV表位。当单个IgG载体为质粒形式时，对应于第一种形式蛋白质疫苗的第一种形式的DNA对应物利用FMDV表位cDNA序列。对应于第二种形式蛋白质疫苗的第二种形式的DNA对应物利用FMDV表位DNA序列，所述序列不同地与猪IgG的重链恒定区cDNA连接。另外，可使用此疫苗进行抗猪FMD或FMDV的免疫接种方法。施用此疫苗的方法各不相同，对于蛋白质形式的疫苗而言，可通过例如常规的注射来给药。当施用DNA形式的疫苗时，使用表皮基因枪或注射给药。
利用实施例并参照附图可解释本发明优选的实施方案，其中
图1a图解显示了使用猪IgG的抗原化抗体疫苗的结构即使用猪IgG的抗原化抗体疫苗，FMDV表位取代了猪IgG重链和轻链上的CDR2和CDR3区域；图1b图解显示了使用FMDV单个或串联重复表位的抗原化嵌合疫苗的结构即使用与猪IgG重链恒定区连接的FMDV单个或串联重复表位的抗原化抗体疫苗；图2a显示了抗原化抗体疫苗的相应cDNA，该疫苗使用IgG cDNA作为质粒载体即使用猪IgG cDNA为质粒载体的DNA疫苗，FMDV表位DNA序列被移植到猪IgG重链和轻链cDNA的CDR2和CDR3区域；图2b显示了抗原化嵌合疫苗的相应cDNA，该疫苗使用FMDV单个或串联重复表位即使用与猪IgG重链恒定区cDNA连接的单个或串联重复FMDV表位DNA序列的DNA疫苗；图3显示了抗原化抗体重链分子的氨基酸序列，其中CDR3区域被FMDV VP1 aa 200至213取代；图4显示了图3所示氨基酸相应的cDNA序列；图5显示了抗原化抗体重链分子的氨基酸序列，其中CDR3区域被FMDV VP1 aa 141至160取代；图6显示了图5所示氨基酸相应的cDNA序列；图7显示了抗原化嵌合疫苗分子的cDNA序列，黑体部分表示FMDV VP1的表位(aa 141至160，aa 200至213)，其余序列属于猪IgG重链恒定区；图8显示了抗原化嵌合疫苗分子的蛋白质序列，黑体部分表示FMDV VP1的表位(aa 141至160，aa 200至213)，其余序列属于猪IgG重链恒定区；图9显示了对应于图8中IgG轻链之cDNA序列的4个cDNA序列；图10显示了编码IgG轻链的4个氨基酸序列，黑体序列是构架区域，下划线序列是CDR区域，CDR2或CDR3序列可被相应的FMDV表位序列取代；图11A显示了所发生的重叠(延伸)PCR即两个阶段发生的重叠/延伸PCR，首先，扩增CDR1/CDR2区域，同时扩增CK/CDR3区域。CDR3的寡核苷酸是互补的，较长的引物3也含有VP1 141-160或200-213残基，这使得在随后的PCR中可融合这两个产物(a和b)；图11B显示了所发生的重叠(延伸)PCR即两个阶段发生的重叠/延伸PCR。首先，扩增CDR1/CDR2区域，同时扩增CH/CDR3区域。CDR3的寡核苷酸是互补的，较长的引物7也含有VP1 141-160或200-213残基，这使得在随后的PCR中可融合这两个产物(c和d)。
本发明基于一种新的抗FMD疫苗类型，这种新的疫苗类型可引发抗FMD的免疫应答。本发明由编码FMDV表位之cDNA序列的基因工程改造构成。疫苗也含有猪IgG cDNA构建体作为FMDV表位的载体。通过将FMDV肽表位移植到猪IgG CDR环或将FMDV表位与图1b所示的猪IgG恒定区连接进行FMDV表位和猪IgG蛋白质形式的缀合。
因此，如图1a和1b所示，将得自FMDV的肽表位移植到猪抗体CDR环中可产生蛋白质形式的抗原化抗体疫苗分子。通过以FMDV之VP1基因为基础进行PCR可合成FMDV肽表位。使用重叠PCR法将FMDV肽表位插入到猪免疫球蛋白重链和轻链基因的CDR区域内。所得抗原化抗体基因被克隆至哺乳动物表达载体。将质粒转染至CHO或骨髓瘤细胞中。
本发明的疫苗实际上具有两个优选的类型，每个类型具有两种优选的形式，因此，如图1a，1b和图2a，2b所示，本发明总共有4种不同的实施方案将在本文中讨论。其中两种是蛋白质形式(图1a，1b)，已知它们是可通过注射给药的抗原化抗体疫苗。第一种类型是利用猪IgG蛋白为FMDV表位的载体，并被注射至猪肌肉组织的抗原化抗体疫苗。第一种形式的这种抗原化抗体疫苗(图1a)将FMDV表位插入到猪IgG重链和轻链的CDR2和CDR3区域内。第二种形式的这种抗原化抗体疫苗(图1b)利用了仅与猪IgG重链恒定区连接的单个或串联重复的FMDV表位，形成了嵌合的蛋白质。因此，第二种形式的这种抗原化抗体疫苗也被称为抗原化嵌合疫苗。
本发明的第二种类型被称为裸露的DNA疫苗，通过基因枪注射可施用该疫苗。各种DNA形式具有相应的蛋白质形式的对应物。两种形式的这种裸露的DNA疫苗对应于上述的其蛋白质对应物。施用后，宿主细胞机制可表达这两种DNA形式。相应的蛋白质等同物可直接施用于动物，其功能与裸露的DNA疫苗形式相同。第一种形式的这种裸露DNA疫苗将FMDV表位DNA序列移植到猪IgG重链和轻链cDNA的CDR2和CDR3区域内。第二种形式的这种DNA疫苗利用仅与猪IgG重链恒定区cDNA连接的FMDV表位DNA序列(图4)。当转录和翻译过程在宿主细胞机器内产生产物时，这两种形式的裸露DNA疫苗将分别发挥两种形式的抗原化抗体疫苗的功能。
疫苗的构建包括三个主要的步骤，即1)克隆猪单个IgG重链恒定区，和猪轻链，2)将两个FMDV免疫原的序列连接在一起和3)将猪IgG单个重链恒定区与FMDV免疫原的序列连接在一起，然后插入细菌表达载体。该方法的细节解释如下。
1)克隆猪单个IgG重链恒定区使用可商购的试剂盒(mRNA制备试剂盒，Pharmacia)，根据厂商的描述进行猪脾脏mRNA的提取和纯化。简单地说，用1.2ml提取缓冲液匀浆3g新鲜猪脾脏，用2.4ml洗脱缓冲液稀释经匀浆的组织提取物并彻底混合。将匀浆物转移到无菌试管中，离心1分钟得到澄清的匀浆物。将1ml澄清的匀浆物放在寡(dT)-纤维素小球顶端。将试管倒转3分钟以重新悬浮寡(dT)-纤维素。于16,000×g下离心10秒钟以收集沉淀物，为了进行洗涤，用1ml高盐缓冲液将寡(dT)-纤维素洗涤5次，并于16,000×g下离心10秒钟，接着用1ml低盐缓冲液洗涤3次，并于16,000×g下离心10秒钟。然后将沉淀物重新悬浮于0.3ml低盐缓冲液中并转移到MicroSpinTM柱上，将该柱全速离心5秒钟，弃去流出液，用新的收集管替代旧管，重复2次此步骤。将柱置于无菌微量离心管中，加入0.2ml预温的洗脱缓冲液，全速离心5秒钟以收集含mRNA的洗脱物。在样品中加入10ml糖原溶液和1/10体积的醋酸钾溶液，将样品与500ml 100％乙醇混合并在-20℃下放置至少30分钟。于4℃，14,000rpm下离心5分钟以收集沉淀的mRNA。弃去上清液，将沉淀的mRNA溶解于经DEPC-处理的水中。通过260nm下的UV吸收测定RNA的量。RT-PCR分析使用一套猪IgG 5′和3′特异性引物，通过RT-PCR扩增编码猪IgG重链恒定区的cDNA片断。使用猪IgG 3′特异性引物引发由总RNA合成第一条cDNA链。于37℃，通过MMLV逆转录酶进行逆转录60分钟，于70℃终止15分钟。在猪IgG 5′特异性引物的存在下，通过PCR扩增cDNA产物。PCR的设置如下，并进行30轮循环94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，最后于72℃延伸6分钟。在1.0％低融点琼脂糖凝胶上分级分离PCR产物，使用苯酚∶氯仿提取和乙醇沉淀从凝胶中纯化大小相当于IgG重链恒定区的带。然后将DNA与较后的FMDV免疫原的序列(F1)连接。
由猪IgG基因(Kacskovics等，1994)设计所用的PCR引物，引物序列如下猪IgG 3′特异性引物5′GAC GCT CGA GTC ATC ATT TAC CCT GAG T 3′猪IgG 5′特异性引物5′AGC TAA GCT TGC CCC CAA GAC GGC CCC A 3′
2)连接两个FMDV免疫原的序列制备对应于FMDV的VP1(Kurz等，1981)之残基141-160和200-213(以残基155-160序列为重叠区域制备两个序列)的两个寡核苷酸序列。通过重叠PCR连接两个序列。PCR设置如下并进行5轮循环94℃1分钟，63℃3分钟。使用两个引物VP1 3′引物和VP1 5′引物在3′末端加上一个Hind III限制性位点，在5′末端加上一个Nde I限制性位点。PCR的设置如下，并进行24轮循环94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，最后于72℃延伸6分钟。在1.5％低融点琼脂糖凝胶上分析PCR产物，切下具有正确大小的产物并纯化之。将连接的片断称为FMDV-免疫-序列。由VP1 141a.a.-160a.a.和200a.a.-213a.a.(Kurz等，1981)设计所用的VP1 3′和5′引物，引物序列如下VP1 5′引物5′ATG CCA TAT GGT ACC AAA C 3′VP1 3′引物5′ATG CAA GCT TCA ACT TCT G 3′图11A阐明了两个阶段发生的重叠(延伸)PCR。首先，扩增CDR1/CDR2区域，同时扩增CK/CDR3区域。CDR3的寡核苷酸是互补的；较长的引物3也含有VP1 141-160或200-213残基。这使得在随后的PCR中可融合这两个产物(a和b)。图11B阐明了两个阶段发生的重叠(延伸)PCR。首先，扩增CDR1/CDR2区域，同时扩增CH/CDR3区域。CDR3的寡核苷酸是互补的；较长的引物7也含有VP1 141-160或200-213残基。这使得在随后的PCR中可融合这两个产物(c和d)。
3)连接猪IgG单个重链恒定区，FMDV-免疫-序列片断和细菌表达载体用Nde I和Hind III消化上述片断；用Hind III和Xho I消化猪单个IgG重链恒定区，用Nde I和Xho I消化细菌表达载体。通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀纯化这3个经消化的片断，然后于16℃使用T4DNA连接酶连接过夜，将连接产物转化到JM109中，通过微量质粒分离，再通过限制性酶消化筛选菌落。通过DNA测序分离和检查正确克隆的质粒。最后，将正确的质粒转化到大肠杆菌BL(2I)DE 3pLysE中，质粒被称为pF1-IgG。
因此，本发明可提供抗口蹄疫的抗原化抗体疫苗，以提供克服了现有技术的一些缺点，较安全，更便宜和/或更有效的疫苗产品。
本发明想在本文所述的整个内容中掺入等价物，其中这种等价物对本领域技术人员而言是显而易见的。本发明的内容是利用实施例提供的，但并不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。
权利要求
1.猪口蹄疫疫苗，其中所述疫苗可引发抗FMD的免疫系统应答，所述疫苗具有FMDV表位之cDNA构建体或其蛋白质对应物。
2.权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗包括蛋白质并具有将得自FMDV的肽表位移植到IgG抗体CDR环的构建体。
3.权利要求2所述的疫苗，其中所述疫苗是抗原化抗体疫苗，所述抗原化抗体疫苗利用猪IgG蛋白作为FMDV表位的载体。
4.权利要求3所述的疫苗，其中所述疫苗利用IgG蛋白作为FMDV表位的载体，所述FMDV表位被插入到IgG重链和轻链的CDR2和CDR3区域内。
5.权利要求3所述的疫苗，其中所述疫苗利用与IgG重链恒定区相连接的串联重复的FMDV表位。
6.权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗是裸露的DNA疫苗，所述裸露的DNA疫苗利用IgG cDNA基因作为FMDV表位的载体。
7.权利要求6所述的疫苗，其中所述疫苗将FMDV表位DNA序列移植到猪IgG重链和轻链cDNA的CDR2和CDR3区域内。
8.权利要求6所述的疫苗，其中所述疫苗利用与IgG重链恒定区cDNA相连接的FMDV表位DNA序列。
9.权利要求4所述的疫苗，其中IgG的轻链包括容纳FMDV表位的CDR2和CDR3区域。
10.权利要求9所述的疫苗，其中FMDV表位携有FMDV或其毒株衍生物的免疫原性。
11.权利要求4所述的疫苗，其中所述IgG轻链可具有下列4种氨基酸序列中的一种PIGL1 序列DS QTVIQKPAISFSLGGTVTLT CAFSSGSLTG INYPSWFQRT PGQPPQTVTYNTNNRPTGVP IRFSGAISGN KAALTTTGAQ AKDEADYFCALYKSSAQITFGGGTHLTVLG QPKAAPTVNL FPPSSEELGTNKATLVCLIS DFYPGAVTVTWKAGGTTVTQ GVETTKPSKQ SNNKYAASSY LALSASDWKS SSGFTCQVTHEGTIVEKTVT PSECAPIGL2 序列DSQTVIQEPAMSVSPGGTV TLTCAFTSGSVTTSNHPGWY QQTPGQPPRLVIYRTNNRPTGVPSRFSGAISGNKAALSTTGAQANDEADYFCTLWKDNTYFFGGGTRLTVLGQPKAAPMVNLFPPSSEEL GTNKATLVCL ISDFYPGAVTVTWKAGGTTV TQGVETTKPSKQSNNKYAAS SYLALSASDW KSSSGFTCQV THEGTIVEKTVTPSECAPIGL3 序列DSQTVIQEP AMSVSPGGTV TVTCAFSSGS VTSSDYPSWF QQTPGQPPRTVIYRTNKPPDWVPGLSGAMSGNKASLTTTGAQAEDEADYFCALEEKSRYQVFGGGTHLTVLGQPKAAPTV NFFPPSSEEL GTNKATLVCL ISDFYPGAVT VTWKAGGTTVTQGVETTKPS KQSNNRYAAS RYLALSASDW KFSSGFTCQV THEGTIVEKTVTPSECAPIGL4 序列DSQTVIQEPAM SVSPGGTVALTCAFSSGSVTTSNYPSWFQTPGQPPRQLIWRTNNRPTGVPGRFSGAISG NKAALTTTGAQANDEADYFCTLCKSTANVIFGGGTHLTVLGQPKAAPTVNLFPPSSEELGTNKATLVCLI SDFYPGAVTV TWKAGGTTVT QGVETTKPSK QSNNRTAASRYLALSASDWK FSSGFTCQVT HEGTIVEKTV TPSECA
12.权利要求7所述的疫苗，其中IgG轻链可具有下列之一的基因密码A.PIGL1 序列座位PK 805bpDNA碱基数 168A264C 221G 152T来源1GTGCCAAGGT TGCATGCCTG CAGGTCGACT AGTACGGGGG GGGGGGGGGGGGGCAGGAGG61CTAAAGAGGC CCCTTCCCAA AATTGTCCCC ACCATGGCCT GAACGGTGCTTCTGATCGGG121CTCCTCCCTG TCGGCTCAGG GGTGGATTCT CAAACTGTGA TCCAAAAACCGGCAATCTCT181TTTTCTCTTG GAGGGACCGT CACACTCACC TGTGCCTTTA GCTCTGGGTCACTCACTGGT241ATTAACTACC CTAGCTGGTT CCAGCGGACA CCAGGCCAGC CTCCTCAAACTGTTATCTAC301AACACAAACA ACCGCCCGAC TGGGGTCCCC ATTCGCTTCT CTGGAGCCATCTCTGGGAAC361AAAGCCGCCC TCACCATCAC GGGGGCCCAG GCTAAGGACG AGGCCGACTACTTCTGTGCT421CTGTATAAAA GTAGCGCTCA GATTACGTTC GGCGGTGGGA CCCATCTGACCGTCCTCGGT481CAGCCCAAGG CCGCTCCCAC GGTCAACCTC TTCCCGCCCT CCTCTGAGGAGCTCGGCACC541AACAAGGCCA CCCTGGTGTG TCTAATAAGT GACTTCTACC CGGGCGCCGTGACGGTGACC601TGGAAGGCAG GCGGCACCAC CGTCACCCAG GGCGTGGAGA CCACCAAGCCCTCGAAACAG661AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC CTGGCCCTGT CCGCCAGTGACTGGAAATCT721TCCAGCGGCT TCACCTGCCA GGTCACCCAC GAGGGGACCA TTGTGGAGAAGACAGTGACG781CCCTCCGAGT GCGCCTAGGG ATCCCB.PIGL2序列座位 PKG 751bpDNA碱基数 153A247C 213G 138T来源1GGGGGGGGGC TGAGGAGGCC GCGTCCCAAG ATTGTCCCCA CCATGGCCTGAACGGTGCTT61CTGATCGGGC TCCTCGCTGT CGGCTCAGGG GTGGATTCTC AAACTGTGATCCAGGAGCCG121GCGATGTCAG TGTCTCCTGG AGGGACCGTC ACACTCACCT GTGCCTTTACATCTGGGTCA181GTCACTACTA GTAACCACCC CGGCTGGTAC CAGCAGACAC CAGGCCAGCCTCCCCGACTG241GTGATTTACA GGACAAACAA CCGCCCGACT GGGGTCCCCA GTCGCTTCTCTGGAGCCATC301TCTGGGAACA AAGCCGCCCT CAGCATCACG GGGGCCCAGG CTAATGACGAGGCCGACTAT361TTCTGTACTC TGTGGAAAGA TAACACATAT TTTTTCGGCG GTGGGACCCGTCTGACCGTC421CTCGGTCAGC CCAAGGCCGC TCCCATGGTC AATCTCTTCC CGCCCTCCTCTGAGGAGCTC481GGCACCAACA AGGCCACCCT GGTGTGTCTA ATAAGTGACT TCTACCCGGGCGCCGTGACG541GTGACCTGGA AGGCAGGCGG CACCACCGTC ACCCAGGGCG TGGAGACCACCAAGCCCTCG601AAACAGAGCA ACAACAAGTA CGCGGCCAGC AGCTACCTGG CCCTGTCCGCCAGTGACTGG661AAATCTTCCA GCGGCTTCAC CTGCCAGGTC ACCCACGAGG GGACCATTGTGGAGAAGACA721GTGACGCCCT CCGAGTGCGC CTAGGGATCC CD.PIGL3 序列座位PPL2 657bp碱基数139A211C 188G 119T来源1GTGGATTCTC AGACTGTGAT CCAGGAGCCG GCGATGTCAG TGTCTCCTGGAGGGACCGTC61ACAGTCACCT GTGCCTTTAG CTCTGGGTCA GTCACTAGTA GTGACTACCCAAGCTGGTTC121CAGCAGACAC CAGGCCAGCC TCCTCGAACT GTCATCTACA GAACAAACAAGCCGCCCGAC181TGGGTCCCAG GTCTCTCTGG AGCCATGTCT GGGAACAAAG CGTCCCTCACCATCACGGGG241GCCCAGGCTG AGGACGAGGC TGACTACTTC TGTGCTCTGG AGGAAAAGTCACGGTATCAG301GTTTTCGGCG GTGGGACCCA TTTGACCGTC CTCGGTCAGC CCAAGGCCGCTCCCACGGTC361AACTTCTTCC CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC GGCACCAACA AGGCCACCCTGGTGTGTCTA421ATAAGTGACT TCTACCCGGG CGCCGTGACG GTGACCTGGA AGGCAGGCGGCACCACCGTC481ACCCAGGGCG TGGAGACCAC CAAGCCCTCG AAACAGAGCA ACAACAGGTACGCGGCCAGC541AGGTACCTGG CCCTGTCCGC CAGTGACTGG AAATTCTCCA GCGGCTTCACCTGCCAGGTC601ACCCACGAGG GGACCATTGT GGAGAAGACA GTGACGCCCT CCGAGTGCGCCTAGGGAD.PIGL4序列座位 PPL4 687bpDNA碱基数 144A230C 186G 127T来源1CCTGGACTCC TCTCTCCTGT TCGGGTGGAT TCTCAGACTG TGATCCAGGAGCCGGCGATG61TCAGTGTCTC CTGGAGGGAC CGTCGCACTC ACCTGTGCCT TTAGCTCTGGGTCAGTCACT121ACCAGTAACT ACCCCAGCTG GTTCCAGAAG ACACCAGGCC AGCCTCCCCGACAGCTGATC181TGGAGAACAA ACAACCGCCC GACTGGGGTC CCCGGTCGCT TCTCTGGAGCCATCTCTGGG241AACAAAGCCG CCCTCACCAT CACGGGGGCC CAGGCTAATG ACGAGGCCGACTACTTTTGT301ACTCTGTGTA AAAGTACTGC TAATGTAATT TTCGGCGGTG GGACCCATCTGACCGTCCTC361GGTCAGCCCA AGGCCGCTCC CACGGTCAAC CTCTTCCCGC CCTCCTCTGAGGAGCTCGGC421ACCAACAAGG CCACCCTGGT GTGTCTAATA AGTGACTTCT ACCCGGGCGCCGTGACGGTG481ACCTGGAAAG CAGGCGGCAC CACCGTCACC CAGGGCGTGG AGACAACCAAGCCCTCGAAA541CAGAGCAACA ACAGGTACGC GGCCAGCAGG TACCTGGCCC TGTCCGCCAGTGACTGGAAA601TTCTCCAGCG GCTTCACCTG CCAGGTCACC CACGAGGGGA CCATTGTGGAGAAGACAGTG661ACGCCCTCCG AGTGCGCCTA GGGACAC
13.权利要求3所述的疫苗，其中FMDV表位具有下列氨基酸序列RHKQEIVAPVKQKL
14.权利要求6所述的疫苗，其中FMDV表位具有下列cDNA序列CGTCACAAACAGGAAATCGTAGCTCCAGTAAAACAGAAGTTG
15.权利要求5所述的疫苗，其中所述IgG重链具有下列cDNA序列，其中黑体序列是FMDV序列1 ATGGAGTTTC GGCTGAACTG GGTGGTCTTG TTTGCTCTCTTACAAGGTGT CCAGGGTGAG61 GAGAAGCTGG TGGAGTCTGG AGGAGGCCTG GTGCAGCCTGGGGGGTCTCT GAAACTCTCC121 TGTGTCGGCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGT ACCTATATTCACTGGGTCCG CCAGGCTCCA181 GGGAAGGGAC TGGAGTGGCT GGCAGGTCTC TACAGTAGTACTACGCCGAC CTACTACTCA241 GACTCTGTGA AGGGCCGGTT CGACATCTCC AGAGAGGACGCCCAGAACAC GGCCTATCTA301 CAAATGAACG GCCTGAAAAC CGAAGACACG GCCCGCTACTACTGTGGAAA GCGTCACAAA361 CAGGAAATCG TAGCTCCAGT AAAACAGAAG TTGTGGGGCCCAGGCGTTGA AGTCGTCGTG421 TCCTCAGCCC CCAAGACGGC CCCATCGGTC TACCCTCTGGCCCCCTGCGG CAGGGACACG481 TCTGGCCCTA ACGTGGCCTT GGGCTGCCTG GCCTCAAGCTACTTCCCCGA GCCAGTGACC541 ATGACCTGGA ACTCGGGCGC CCTGACCAGT GGCGTGCACACCTTCCCATC CGTCCTGCAG601 CCGTCAGGGC TCTACTCCCT CAGCAGCATG GTGACCGTGCCGGCCAGCAG CCTGTCCAGC661 AAGAGCTACA CCTGCAATGT CAACCACCCG GCCACCACCACCAAGGTGGA CAAGCGTGTT721 GGAATACACC AGCCGCAAAC ATGTCCCATA TGCCCAGGCTGTGAAGTGGC CGGGCCCTCG781 GTCTTCATCT TCCCTCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCAGAC CCCCGAGGTC841 ACGTGCGTGG TGGTGGACGT CAGCAAGGAG CACGCCGAGGTCCAGTTCTC CTGGTACGTG901 GACGGGGTAG AGGTGCACAC GGCCGAGACG AGACCAAAGGAGGAGCAGTT CAACAGCACC961 TACCGTGTGG TCAGCGTCCT GCCCATCCAG CACCAGGACTGGCTGAAGGG GAAGGAGTTC1021 AAGTGCAAGG TCAACAACGT AGACCTCCCA GCCCCCATCACGAGGACCAT CTCCAAGGCT1081 ATAGGGCAGA GCCGGGAGCC GCAGGTGTAC ACCCTGCCCCCACCCGCCGA GGAGCTGTCC1141 AGGAGCAAAG TCACGCTAAC CTGCCTGGTC ATTGGCTTCTACCCACCTGA CATCCATGTT1201 GAGTGGAAGA GCAACGGACA GCCGGAGCCA GAGAACACATACCGCACCAC CCCGCCCCAG1261 CAGGACGTGG ACGGGACCTT CTTCCTGTAC AGCAAACTCGCGGTGGACAA GGCAAGATGG1321 GACCATGGAG ACAAATTTGA GTGTGCGGTG ATGCACGAGGCTCTGCACAA CCACTACACC1381 CAGAAGTCCA TCTCCAAGAC TCAGGGTAAA TGAGCCACCCGCTGCACCCC ACGTGCTCTC1441 GGGTCCCGCG AGCTCGCCTG AGCCCCAGCG CTGTGTACATACGTCCCGGG CCAGCATGAA1501 ATAAA
16.权利要求5所述的疫苗，其中所述重链具有下列氨基酸序列，其中黑体序列是FMDV表位区域MEFRLNWVVL FALLQGVQGE EKLVESGGGL VQPGGSLKLS CVGSGFTFSSTYIHWVRQAP GKGLEWLAGL YSSTTPTYYS DSVKGRFDIS REDAQNTAYLQMNGLKTEDTARYYCGKRHKQEIVAPVKQKLWGPGVEVVVSSAPKTAPSVYPLAPCGRDVSGPNVALGCLAS SYFPEPVTVT WNSGALTSGV HTFPSVLQPSGLYSLSSMVTVPASSLSSKS YTCNVNHPAT TTKVDKRVGI HQPQTCPICP GCEVAGPSVFIFPPKPKDTL MISQTPEVTC VVVDVSKEHA EVQFSWYVDG VEVHTAETRPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQ DWLKGKEFKC KVNNVDLPAP ITRTISKAIGQSREPQVYTL PPPAEELSRSKVTLTCLVIG FYPPDIHVEW KSNGQPEPENTYRTTPPQQD VDGTFFLYSK LAVDKARWDHGDKFECAVMH EALHNHYTQKSISKTQGK
17.权利要求1、2或6所述的疫苗，其中所述疫苗是使用移植制备的。
18.猪口蹄疫疫苗，其中所述疫苗可引发抗FMD的免疫系统应答，所述疫苗具有FMDV表位之cDNA构建体或其蛋白质对应物，所述蛋白质形式的疫苗是通过将FMDV表位移植到猪IgG的CDR2和CDR3区域中制备的。
19.权利要求1、17或18所述的疫苗，其中所述疫苗是DNA形式的疫苗，该疫苗是通过将FMDV肽表位的cDNA插入到猪IgG基因的CDR区域内以构建DNA质粒，然后克隆质粒以表达而产生的。
20.猪口蹄疫疫苗，其中所述疫苗可引发抗FMD的免疫系统应答，所述疫苗具有FMDV表位之cDNA构建体或其蛋白质对应物，所述疫苗为蛋白质形式的疫苗，可通过注射到猪肌肉组织中给药。
21.权利要求18、19或20所述的疫苗，其中所述疫苗是DNA形式的疫苗，可通过注射到猪表皮中给药。
22.制备猪口蹄疫疫苗的方法，所述方法包括将得自FMDV的表位移植到猪抗体CDR环的步骤，其中所述FMDV肽表位是通过PCR由FMDV的VP1基因克隆得到的。
23.权利要求22所述的制备疫苗的方法，其中所述PCR法是重叠PCR法，使用该方法将FMDV肽表位插入到猪免疫球蛋白重链和轻链基因的CDR区域内，其中重链和轻链基因是克隆至哺乳动物或昆虫细胞表达载体以供表达的抗原化抗体基因。
全文摘要
提供了治疗猪口蹄疫的疫苗,此疫苗是将得自FMDV的肽表位移植到猪抗体CDR环而产生的抗原化抗体疫苗。可通过PCR由FMDV的VP1基因克隆FMDV肽表位。使用重叠的PCR法将FMDV肽表位插入到猪免疫球蛋白重链和轻链基因的CDR区域内,将所得的抗原化抗体基因克隆至哺乳动物表达载体。将质粒转染至CHO或骨髓瘤细胞,选择稳定的转染子细胞系以大量产生所需的蛋白质疫苗。
文档编号A61K39/00GK1270839SQ9911976
公开日2000年10月25日 申请日期1999年9月30日 优先权日1999年4月15日
发明者谢雍 申请人:香港科技大学