动 区域（数据未示出）。相反，当用BDNF或EGF诱导时，在过表达hsa-miR-204的细胞中未观 察到膜边缘波动和Racl易位（数据未示出）。凋亡逃避（其对于肿瘤生长和进展是关键的 (Hanahan等，2000))可以是对于表现出hsa-miR-204丢失的癌症中之癌发生的另一种中心 机制。此外，增加的AKT/mTOR活性还与癌症中降低的凋亡有关（Krishnan等，2006)。事实 上，hsa-miR-204过表达导致激活的胱天蛋白酶-3和聚ADP核糖聚合酶（PARP)两者的水 平均显著增加，它们是对细胞和基因组完整性的不可逆性损伤的指示，由此引起凋亡活性 的增加（图5B&5C)。总之，这些发现表明hsa-miR-204的丢失通过激活其靶基因来促进肿 瘤细胞生长、迀移和侵入，所述靶基因是致癌信号级联放大的已知调节子。
[0084] G.高通量功能筛选
[0085] 认为Hsa-miR-204不仅是肿瘤抑制剂，而且是致敏针对化学治疗药物紫杉醇有药 物抗性之乳腺癌的miRNA。
[0086] 为了鉴定可致敏针对紫杉醇有紫杉醇抗性之TNBC细胞的miRNA，采取如下无偏 且全面的方法：将974种化学合成的miRNA抑制剂文库用于高通量筛选平台以鉴定在亚致 死剂量的紫杉醇（2nM至8nM)的存在下降低TNBC细胞生存力的miRNA，并且证实所选择 的候选，所述亚致死剂量是在其下80%的TNBC细胞保持活力的剂量。使用TNBC细胞系 MDA-468。
[0087] 将抑制剂以一种抑制剂一个孔的形式排列在96孔微滴定板上，所述抑制剂的每 一种靶向974种人微RNA中的一种。对于存在（亚致死浓度）药物和没有药物的三次分析， 一式六份地进行紫杉醇抗性MDA-468细胞的转染。使细胞暴露于在IC2tl下或低于IC2tl的药 物72小时，如来源于5天的MTS测定。使用CellTiter-Gl0生存力测定（Promega)来测量 细胞生存力。
[0088] 将每个板上的原始值归一化到内部参照对照样品（阳性对照和阴性对照）以允 许板与板的比较。指定各miRNA抑制剂的生存力比-计算为紫杉醇中的平均生存力除以 没有药物的平均生存力（平均pac/平均载体）。在高通量筛选中，统计学比较的数目显 著地超过生物学重复的数目。对于各miRNA抑制剂，进行两个样品t检验（使用合并方 差）来确定在两个实验条件（存在药物和没有药物）下的平均值之间是否有显著性差异。 基于其在所有P值的分布中的秩来放大所得的原始P值（基于控制错误发现率（FDR)的 Benjamini-Hochberg方法）。已经将该方案成功应用于基于全基因组RNAi的合成致死筛 选研宄，其中在目前筛选中鉴定了 18个命中（hit)的高度可重复列表（图6)。
[0089] 该筛诜导致不同类别miRNA的鉴定：（1)脱敏物：当抑制时,与裁体相比,在紫杉醇 的存在下降低细胞生存力的miRNA (表明当过表达时，这些miRNA将支持细胞生存力）；（2) 致敏物:当抑制时，与载体相比，在絷杉醇的存在下增加细胞生存力的miRNA(表明当过表 达时，这些miRNA将降低细胞生存力）；以及(3)中性药物：当抑制时，当在紫杉醇与裁体之 间比较时，对细胞生存力没有显著影响的miRNA。
[0090] 当与未处理的载体维持的细胞相比时，一种致敏物hsa-miR-204在抑制时示出在 紫杉醇处理的TNBC细胞中细胞生存力的最高幅度增加。如图6中所示，当与未处理的（载 体）对照相比时，致敏物hsa-miR-204的过表达导致在亚致死剂量的紫杉醇的存在下，TNBC 细胞生存力的显著（大于约四倍；P = 〇· 006)降低。
[0091] H.埃兹蛋白
[0092] 本发明人还鉴定了与埃兹蛋白RNA相结合的hsa-miR-204,以及hsa-miR-204种子 区域中的序列3' -UUUCCCUU-5'与埃兹蛋白3' -UTR区中相应的5' -AAAGGGAA-3'序列的特 异性结合。埃兹蛋白是埃兹蛋白/根蛋白膜突蛋白（ERM)家族的成员，并且其通过将细胞 的质膜和肌动蛋白细胞骨架的功能偶联来促进细胞骨架再组织。埃兹蛋白涉及多种成人和 儿科肿瘤的肿瘤生长和转移，并且埃兹蛋白的强多病灶表达与多种肿瘤的不良预后有关。P 糖蛋白与埃兹蛋白在ferm结构域中的149位至242位氨基酸残基处结合并且在人骨肉瘤 的多抗药性中起着关键作用。
[0093] 与在hsa-miR-204与BDNF基因座的表达中之负相关的情况一样（图4A、4B、4C、 4E、4F和4G)，在hsa-miR-204与埃兹蛋白基因座的表达之间也存在负相关（图7)。与BDNF 表达的情况一样，埃兹蛋白表达也是hsa-miR-204的真实革El标（图8)。
[0094] I.另外的考虑
[0095] 已知许多与癌症相关的miRNA位于基因组脆性位点（Calin等，2004)。然而，令人 惊讶地，知道很少关于包含miRNA的具有染色体畸变之区域的功能重要性。可能是最初的 遗传筛选旨在发现染色体异常（通常具有较低的比较基因组杂交分辨率）而忽略了包含 miRNA的基因组区中的改变。因为miRNA影响一个或更多个途径中的多个基因，其调控细胞 生长和凋亡并且当失调时有助于肿瘤形成，所以对编码miRNA之较小基因组区的更进一步 仔细研宄可提供对肿瘤发生机制的重要认识。提出大多数miRNA在癌症中是下调的，并且 包含特定miRNA的遗传区域的微缺失可以是在人癌症的发育和进展中起着重要作用的事 件。
[0096] 本文提供了以下证据：充当有效的肿瘤生长和转移抑制剂的hsa-miR-204在一些 人癌症中是体细胞上丢失的。证明了该hsa-miR-204调控肿瘤中的促血管生成蛋白BDNF 及其受体TrkB的表达和功能，以及hsa-miR-204的丢失通过激活导致Racl易位和肌动蛋 白再组织的AKT/mTOR通路来促进BDNF(或EGF)诱导的癌细胞迀移和侵入。因为AKT与 Racl需要彼此以用于其激活（Kim等，2011 ;Higuchi等，2001)，所以这些发现表明人肿瘤 中hsa-miR-204表达的丢失可在生长因子诱导的癌细胞迀移和侵入期间诱导BDNF/AKT1与 Racl之间的正反馈回路。为了支持这一点，已经示出EGF激活AKT并促进Racl易位到细 胞膜，并且已经示出EGFR与TrkB之间的交叉对话（crosstalk)诱导癌细胞迀移（Qiu等， 2006)。此外，在癌细胞侵入期间对EGF的响应是关键步骤并且其与转移直接相关（WyckofT 等，2004)。除了癌细胞迀移和侵入之外，BDNF/TrkB信号传导的激活也有助于hsa-miR-204 缺失的细胞中的凋亡逃避，因为BDNF/TrkB过表达与AKT的稳定和激活相关，这导致降低 的凋亡（Siu等，2009)。与此一致，这些结果证明hsa-miR-204过表达导致mTOR下游靶标 4E-BP1和S6激酶降低的磷酸化和激活。
[0097] 因为hsa-miR-204位于瞬时受体电位阳离子通道成员3(TRPM3)基因（其是蛋 白质的瞬时受体电位通道家族的成员）内，并且已知这些蛋白质对细胞钙信号传导和体 内稳态是重要的，所以令人感兴趣的推测是，与包含hsa-miR-204之染色体基因座的基 因组丢失相关的表型也可以由宿主基因 TRPM3贡献。但是，本文的结果示出在单独引入 hsa-miR-204之后抑制了肿瘤生长和转移，而在hsa-miR-204模拟物或抑制剂过表达的癌 细胞中TRPM3基因的水平没有改变（图12)。这清楚地表明hsa-miR-204相关的肿瘤抑制 剂表型不是经过TRPM3介导的。然而，不能排除hsa-miR-204及其宿主基因 TRPM3协同作用 以调控肿瘤生长以及肿瘤细胞迀移和侵入的抑制的可能性。由于尚未报道TRPM3在肿瘤发 生中的明确作用，检查TRPM3的潜在肿瘤抑制作用以及其与hsa-miR-204的协同作用（如 果有的话）的详细研宄可能是将来研宄的课题。
[0098] 总之，本文的发现表明，包含特定miRNA的遗传基因座可通过调控关键致癌通路 在癌生长和转移中发挥因果作用。hsa-miR-204靶向BDNF/TrkB的能力表明hsa-miR-204 可控制关键调控机制，并且表明这样的控制的失调可使正常的发育/分化事件倾向于经历 转变，所述BDNF/TrkB在正常细胞过程中具有显著作用并且在侵入性癌症中过表达。因此， 旨在于治疗方案中使用hsa-miR-204的策略具有将在癌细胞中不适当的激活步骤逆转为 更正常状态的优点。本文鉴定的hsa-miR-204为有效的肿瘤抑制剂-连同本文证明的其治 疗潜力和可忽略不计的肝毒性-建立了将hsa-miR-204开发为治疗癌症的可行治疗方案之 关键组分的有力理论。
[0099] 实施例
[0100] 包括了以下实施例以证明本发明的某些非限制性方面。本领域技术人员应理解， 在随后实施例中公开的技术表示由本发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术。然 而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下， 在所公开的具体实施方案中做出许多改变并且仍然获得同样或类似的结果。
[0101]多个以下实施例提供了示例性材料和方法上的另外细节。
[0102] 实施例1
[0103] (正常和肿瘤组织样品以及细胞系）
[0104] 根据ATCC方案培养用于实验的代表儿科肾肿瘤（HEK-293 ;胚胎肾细胞系）、卵巢 癌（SKOV3)和乳腺癌（MDA-MB-231)的细胞系。从儿童肿瘤协作组（Children's Oncology Group) (Arcadia，CA)获得了 76个儿科肾肿瘤和正常匹配的肾。从UT MD安德森癌症中心 (Houston，TX)获得了 11个晚期卵巢肿瘤和5个正常卵巢组织。从UT健康科学中心（UT Health Science Center) (San Antonio, TX)获得了 15个乳腺癌组织和正常匹配的组织。
[0105] 实施例2
[0106] (RNA和蛋白质分析）
[0107] 从肿瘤和正常组织以及所有细胞系提取了总RNA，并且使其进行qRT-PCR分析，如 之前所述（Imam等，2010)。如之前所述进行Western印迹分析（Imam等，2010)。从Sigma Aldrich购买β-肌动蛋白的抗体（AC-74-A5316)和α-微管蛋白的抗体（T6199)。从 Santa Cruz购买BDNF的抗体。从Cell Signaling购买其他抗体，包括特异于胱天蛋白酶-8 的抗体（IC12-9746)、特异于胱天蛋白酶-3的抗体（8G10-9665)、特异于胱天蛋白酶-9的 抗体（9502)、特异于PARP的抗体（9542S)、特异于AKT的抗体（9272)、特异于磷酸-AKT的 抗体（9271)、特异于S6核糖体蛋白的抗体（2217)以及特异于磷酸-S6核糖体蛋白的抗体 (5G10-2211S)〇
[0108] 实施例3
[0109] (基因组PCR测定）
[0110] 用DNeasy基因组DNA提取试剂盒（Qiagen)从儿科肾肿瘤（η = 38)，和晚期（III 和IV)卵巢癌以及匹配的正常肾（η = 38)和卵巢（η = 4)组织分离基因组DNA。对于 hsa-miR-204的基因组分析，采用使用如所述的基于SYBR Green之定量PCR(qRT-PCR)， 采用2_Λ AGt方法（Varambally等，2008)。简言之，将25ng基因组DNA用作模板以扩 增hsa-miR-204基因座。在每个测定中将代表性对照组织样品用作每个样品与其进行 比较的校准物，以获得相对定量（RQ)值。将来自正常雄性样品（IX)和正常雌性样品 (2 X) (Promega)的基因组DNA用于比较磷酸甘油酸激酶I (PGKl)与5个X染色体特异性 miRNA(hsa_miR-424、hsa-miR-503、hsa-miR-766、hsa-miR-222 和 hsa-miR-221)的水平以 校准多个miRNA基因座中丢失的程度。使用非X染色体TATA结合蛋白质（TBP)基因作为 参照来评估雄性基因组DNA中这些区域的RQ值。基于其分离两个不同数据群的能力，认为 〇. 5及以下的RQ值为至少一个拷贝的基因组基因座丢失。
[0111] 实施例4
[0112] (高分辨率miRNA比较基因组杂交（CGH)测定）
[0113] 根据制造商的方案使用Agilent定制设计微阵列在从儿科肾肿瘤样品分离的 基因组DNA上进行miR