，批号20121008)，无水D-葡萄糖（分析纯，110833-200904,中国药 品生物制品检定所），氯化钠、磷酸氢二钠（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司），氯化钾 (分析纯，南京化学试剂厂），磷酸二氢钾（分析纯，汕头市西陇化工厂），硫酸（分析纯，南 京化学试剂有限公司），精制苯酚（分析纯，南京化学试剂有限公司）。主要仪器设备：超 声处理器JAC-500,济宁奥波超声电气有限公司JY92- II DN型超声细胞粉碎机，宁波新芝 生物科技有限公司；FA1104N型电子天平，上海精密科学仪器有限生产公司生产；旋转蒸发 仪RE-52A，上海亚荣生化仪器厂；SHZ- III型循环水真空栗，上海亚荣仪器厂；754紫外分光 光度计，上海精密科学仪器有限公司；离心机湘仪L-550,湖南湘仪实验室仪器开发有限公 司，Zetasizer Nano系列纳米粒度和Zeta电位仪，产品型号Zetasizer Nano系列，英国 马尔文仪器有限公司。
[0044] GUPL包封率的测定：G_50微柱离心法结合苯酚-浓硫酸法测定。GUPL分离及包 封率和载药量的测定：G-50微柱离心法。G-50放入0.9%的生理盐中过夜，使其充分溶胀， 后将其缓慢填入已经弃去活塞并已装入适量棉花的2mL注射器内，离心1500rpm，5min，除 去多余的水分。缓慢悬空加入400ul的LP30脂质体溶液，离心1500rpm，5min，收集离心液， 即包封LP30的脂质体。包封率及载药量的计算。精密称取微柱离心后的脂质体400ul，加 入400ul体积分数为10% TritonX-IOO溶解，以同样处理的空白脂质体作为空白对照，按照 苯酚-浓硫酸法法测定样品吸光值A490,将吸光值带入回归方程，计算。
[0045] 包封率（EE) % = CL/CT X 100 %
[0046] 式中CL为包封LP30的浓度；CT为总浓度，即包封的LP30与游离LP30之和。
[0047] 载药量 ％ = WL/WP X 100 %
[0048] 式中WL为包封的质量；WP为大豆磷脂和胆固醇的质量之和。
[0049] 本发明用到的甘草多糖的提取方法或纯化方法。
[0050] 甘草干品粉碎后过30目筛100g，经石油醚（60~90°C ) 500mL回流脱脂2次，每 次lh，再用质量分数为80%乙醇回流提取2次，每次2h，以除去单糖、低聚糖及其它脂溶性 杂质；将药渣加500mL水于90°C水浴浸提2次，每次2h，合并2次滤液，在旋转蒸发仪上减 压浓缩至200mL，用15%的三氯乙酸在4°C条件下搅拌脱蛋白；溶液经离心去沉淀，清液经 Imol/LNaOH调至中性，然后加无水乙醇依次将清液调至30 %、50%、80 %并静止过夜，依次 离心收集沉淀，经无水乙醇和无水丙酮依次洗涤三次，冷冻干燥得粗多糖；经体外淋巴细胞 增值试验，30%和50%醇沉多糖效果最好，本发明主要用30%醇沉多糖。
[0051] 实施例1乙醇注入法制备GUPL
[0052] 精确称取大豆磷脂0. 4g，胆固醇0. 05g和吐温800.1 g溶于IOmL无水乙醇中，超声 使其充分溶解；在45°C水浴摇床的振荡下，将20mL的含2mg ^mL 1甘草多糖的PBS(pH 7. 4) 溶液缓慢导入前者，保持45°C继续振荡30min ;置于250mL圆底烧瓶中，50°C减压蒸发除去 乙醇，随后置于超声细胞粉碎机进行超声处理（强度40 %，2. 5s开，2. 5s停，作用15min)， 使甘草多糖充分均匀地融合到脂质体中，同时也使得甘草多糖脂质体的粒径更均一，从而 得到甘草多糖脂质体混悬液；再将其分别挤压过孔径为〇. 45 μ m、0. 22 μ m的微孔滤膜，各 重复三次，即得甘草多糖脂质体溶液。置于4°C保存。
[0053] 经计算该方法制备的GUPL包封率为35. 41 %。
[0054] 实施例2薄膜分散法制备GUPL
[0055] 精确称取大豆磷脂0· 4g，胆固醇0· 05g和吐温800.1 g溶于IOmL氯仿和甲醇（I: 1) 溶液中，超声使其充分溶解；置于250mL圆底烧瓶中，50°C减压蒸发除去有机溶剂，当烧瓶 壁上形成一层均匀的薄膜后，导入20mL的含2mg ^mL 1甘草多糖的PBS (pH 7. 0)溶液，50°C 减压蒸发，使瓶壁薄膜洗脱；25°C水化0. 5h ;随后置于超声细胞粉碎机进行超声处理（强度 40 %，2. 5s开，2. 5s停，作用15min)，使甘草多糖充分均匀地融合到脂质体中，同时也使得 甘草多糖脂质体的粒径更均一，从而得到甘草多糖脂质体混悬液；再将其分别挤压过孔径 为0. 45 μm、0. 22 μm的微孔滤膜，各重复三次，即得甘草多糖脂质体溶液。置于4°C保存。
[0056] 经计算该方法制备的GUPL包封率为30. 39 %。
[0057] 实施例3硫酸铵梯度法制备GUPL
[0058] 精确称取大豆磷脂0· 4g，胆固醇0· 05g和吐温800.1 g溶于IOmL无水乙醇中，超 声使其充分溶解；在50°C水浴摇床的振荡下，将前者导入IOmL 10%硫酸铵溶液中，进而置 于250mL圆底烧瓶中，50°C减压蒸发除去有机溶剂；置于PBS(pH 7. 0)中透析24h ;在50°C 水浴摇床的振荡下，将20mL的含2mg ^mL 1甘草多糖的PBS(pH 7. 0)溶液缓慢导入前者，保 持50°C继续振荡30min ;随后置于超声细胞粉碎机进行超声处理（强度40%，2. 5s开，2. 5s 停，作用20min)，使甘草多糖充分均匀地融合到脂质体中，同时也使得甘草多糖脂质体的粒 径更均一，从而得到甘草多糖脂质体混悬液；再将其分别挤压过孔径为0. 45 μ m、0. 22 μ m 的微孔滤膜，各重复三次，即得甘草多糖脂质体溶液。置于4°C保存。
[0059] 经计算该方法制备的GUPL包封率为31. 04%。
[0060] 实施例4逆相蒸发法
[0061] 精确称取大豆磷脂0· 4g，胆固醇0· 05g和吐温800.1 g溶于12mL氯仿和乙醚（1:2) 溶液中，超声使其充分溶解；将4mL的含2mg · mL 1甘草多糖的PBS (pH 7. 0)溶液缓慢导入 前者，形成两相体系，冰水浴超声，至形成稳定的W/0型乳剂，60°C减压蒸发，形成胶态后加 入一定量PBS，继续旋蒸lOmin，除去有机溶剂，随后置于超声细胞粉碎机进行超声处理（强 度40 %，2. 5s开，2. 5s停，作用20min)，使甘草多糖充分均匀地融合到脂质体中，同时也使 得甘草多糖脂质体的粒径更均一，从而得到甘草多糖脂质体混悬液；再将其分别挤压过孔 径为0. 45 μ m、0. 22 μ m的微孔滤膜，各重复三次，即得甘草多糖脂质体溶液。置于4°C保存。
[0062] 经计算该方法制备的GUPL包封率为39. 94%。高于以上3种制备方法，所以逆向 蒸发法为最佳制备方法。
[0063] 实施例5空白脂质体的制备
[0064] 空白脂质体的制备方法分别同实施例1至实施例4,将其中多糖溶液换成等量的 PBS溶液。
[0065] 实施例6标准曲线的制作
[0066] 精密称取105°C干燥至恒重的葡萄糖标准品lOOmg，定容至100mL，得Img · mL 1的 储备液，吸取IOmL储备液定容至IOOmL，得0.1 mg ^mL 1的标准液。精密吸取标准液0. 2、0. 4、 0. 6、0. 8、1.0 mL至试管中，加蒸馏水补足至2mL，以空白脂质体的透析液做为空白对照，吸 取2mL至试管中，各加入5%精制苯酸lmL，浓硫酸5mL，混勾后热水浴加热10min，冷却后在 分光光度计上测定490nm处的吸光度值，以吸光度为纵坐标，葡萄糖标准品溶液浓度为横 坐标，绘制成标准曲线。
[0067] 如图1所示，经计算得回归方程为Y = 16. 754X+0. 0105,R2= 0. 9991 (η = 5)。表 明葡萄糖在0. 01~0. 05mg · mL 1范围内线性关系良好。
[0068] 实施例7
[0069] GUPL制备方法同实施例4,其中，超声时间分别为5、10、15、20、2511^11，观察不同超 声时间对甘草多糖脂质体包封率和载药量的影响。
[0070] 不同超声时间对甘草多糖脂质体包封率和载药量的影响如图2和3。当超声时间 在15min时，包封率和载药量均为最大值。
[0071] GUPL制备方法同实施例4,其中，大豆磷脂与甘草多糖的质量比（w/w)比分别为 5:1、10:1、15:1、20:1、25:1，观察大豆磷脂与甘草多糖的质量比对甘草多糖脂质体包封率 和载药量的影响。
[0072] 大豆磷脂与甘草多