；与对照侧相比，治疗侧可见多条新生血管，表明本发 明复合型血小板凝胶能够促进血管的新生，可用于促进缺血性坏死组织的再生修复。小鼠 图像给药侧以实施例6凝胶组为代表，其它实施例凝胶组小鼠血管分布情况相当。
[0061] 试验例3、促进骨髓来源的干细胞迀移试验
[0062] 骨髓来源的循环干/祖细胞向损伤部位趋化、定植对于组织血管新生和创伤修 复至关重要（YounSW,LeeSW,LeeJ,etal.COMP-AnglstimulatesHIF-la-mediated SDF-loverexpressionandrecoversischemicinjurythroughBM-derivedprogenitor cellrecruitment.Blood, 2011，117(16) :4376-86.) 〇
[0063] 取荧光素酶转基因C57BL/6J小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所，2-3周 龄，颈椎脱臼法处死后，无菌取股骨，以胶原酶II消化，收获骨片，在含10%胎牛血清的 a-MEM中培养（GuoZK,LiH,LiXSetal.Invitrocharacteristicsandinvivo immunosuppressiveactivityofbone-derivedmurinemesenchymalprogenitor cells.StemCells2006;24:992-1000)。干细胞传代3次后，收获细胞备用。
[0064] 取健康裸鼠，由军事医学科学院实验动物中心提供，6-8周龄，体重15-18g。以戊 巴比妥钠腹腔麻醉后，无菌条件下，以打孔器剪除裸鼠背部全层皮肤，暴露筋膜，直径12_。 对照组给予人富血小板血浆（同实施例中步骤1)所得物）浸湿的纱布覆盖创面，治疗组涂 抹本发明复合型血小板凝胶（实施例产品），两组裸鼠创面均覆盖3M膜。同时，经尾静脉给 裸鼠输注干细胞，浓度2. 5xl06/ml，每只0. 2ml。分别于细胞注射后24、48、72小时，在活体 成像仪下观察干细胞的迀移分布情况。
[0065] 试验结果如图5所示（以实施例5产品的图像为代表），左侧小鼠为本发明复合型 血小板凝胶（实施例产品）治疗组，右侧小鼠为PRP对照组：与对照组相比，复合型血小板 凝胶治疗后24小时，即可观察到干细胞迀移至创面，且持续至72小时观察结束时，而对照 组未观察到趋化至创面的干细胞；治疗后72小时创面的荧光强度强于24小时，说明趋化至 创面的干细胞数量逐渐增加且定植于创面的复合型血小板凝胶中生长、增殖。表明本发明 复合型血小板凝胶能够促进间充质干细胞的趋化和植入。
[0066] 试验例4 :蛋白和细胞因子缓释实验
[0067] 将本发明复合型血小板凝胶（实施例产品）和PRP(同实施例中步骤1)所得物） 置于4°c保存，每隔4小时分别取出500y1样本于-20°c冻存，待72小时后实验结束时统 一检测总蛋白的浓度。
[0068] 将本发明复合型血小板凝胶（实施例产品）和PRP(同实施例中步骤1)所得物） 置于4°C保存，每24小时分别取出500y1样本于-20°C冻存，待7天后实验结束时统一检 测血管内皮细胞生长因子（VEGF)的浓度。
[0069] 试验结果如图6和图7所示（以实施例3产品的结果为代表），图6为总蛋白的释 放情况，图中实线为本发明复合型血小板凝胶，虚线为PRP;本发明复合型血小板凝胶与对 照组PRP相比，在成胶早期（16小时）即释放出较高浓度的总蛋白，且稳定地维持在较高浓 度直至72小时，波动幅度小；而PRP成胶36小时才达到与本发明复合型血小板凝胶相当的 浓度，48小时出现释放高峰后迅速降低至较低浓度，波动幅度很大；至72小时，本发明复合 型血小板凝胶释放的总蛋白浓度为PRP的1. 9倍。
[0070] 图7为细胞因子VEGF的释放情况，图中实线为本发明复合型血小板凝胶，虚线为 PRP;两组相比，本发明复合型血小板凝胶VEGF的释放稳定在较高浓度，而PRP则在开始成 胶时即达到最高浓度，随后迅速降低；至第3天时，本发明复合型血小板凝胶释放的VEGF浓 度为PRP的2. 8倍。
[0071] 本实验表明本发明实现了血小板源性生长因子及活性物质的缓释，并能保持生物 效应持久。
[0072] 本发明提出的复合型血小板凝胶有喷剂、膏剂或乳剂形式，可注射于组织缺损腔 隙，治疗软/硬组织缺损；可直接涂抹或喷洒于创面，治疗皮肤/粘膜损伤和溃疡；可注射 于关节腔内，治疗关节软骨退行性变；可注射于缺血性坏死组织周围，促进血管新生及组织 再生修复。
【主权项】
1. 一种复合型血小板凝胶，其特征在于，由壳聚糖与富血小板血浆混合液被活化得到， 其微观结构为：富血小板血浆被活化得到的纤维蛋白网状结构连结于壳聚糖分子构成凝胶 载体支架，血小板来源的细胞因子粘附、锚着于凝胶载体支架中，形成复合型血小板凝胶。2. 根据权利要求1所述的复合型血小板凝胶，其特征在于：活化过程为：先将壳聚糖与 富血小板血浆冻融裂解液混合，再加入活化剂静置，将富血小板血浆中的纤维蛋白原活化 成纤维蛋白网状结构。3. 根据权利要求1或2所述的复合型血小板凝胶，其特征在于：所述壳聚糖是北极深 海虾、蟹壳的天然提取物及其衍生物，选用适用于人体的医用级药物辅料，壳聚糖在反应体 系中的终浓度为0. 5-8 % (质量/体积浓度，单位g/100ml)，凝胶为喷剂、膏剂或乳剂形式， 其中膏剂或乳剂中壳聚糖浓度为6% -8%，喷剂中壳聚糖浓度为0. 5%。4. 根据权利要求1或2或3所述的复合型血小板凝胶，其特征在于：所述活化剂为 氯化钙-凝血酶混合液，壳聚糖与富血小板血浆混合液与氯化钙-凝血酶混合液体积比 10:1-4:1。5. 根据权利要求4所述的复合型血小板凝胶，其特征在于：所述氯化钙-凝血酶混合 液中，氯化钙浓度为20-40mm〇l/mL，凝血酶浓度为400-1000U/mL，溶剂为无菌水。6. 根据权利要求1或2或3所述的复合型血小板凝胶，其特征在于：所述活化剂为葡 萄糖酸钙溶液，壳聚糖与富血小板血浆混合液与葡萄糖酸钙溶液体积比10:1。7. 根据权利要求6所述的复合型血小板凝胶，其特征在于：所述葡萄糖酸钙溶液质量/ 体积浓度为10% (g/l〇〇ml)，溶剂为无菌水。8. 根据权利要求1至7任一所述的复合型血小板凝胶，其特征在于：所述富血小板血 浆来自用血细胞分离机直接采集的浓缩血小板（机采血小板）、静脉采集的全血（抗凝血） 经两次离心法分离制备的血小板浓缩液（富浆法手工血小板）或商业富血小板血浆。9. 一种制备权利要求1-8任一所述复合型血小板凝胶的方法，包括以下步骤： 1) 制备富血小板血浆冻融裂解液：-70°C冻存的富血小板血浆，使用前转移至37°C水 浴冻融而得； 2) 制备凝胶：将壳聚糖按质量/体积浓度0.5-8% (在反应体系中的终浓度，g/100ml) 比例加入富血小板血浆冻融裂解液，混合后再与氯化钙-凝血酶混合液或葡萄糖酸钙溶液 按体积比10:1-4:1的比例混合，室温静置5分钟，得到复合型血小板凝胶。10. 权利要求1-8任一所述复合型血小板凝胶在制备适用于软/硬组织缺损、皮肤/粘 膜难愈性损伤或溃疡、关节软骨退行性变、缺血性组织坏死等修复治疗的基质胶中的应用； 其中喷剂用于粘膜损伤和溃疡修复。
【专利摘要】本发明一种复合型血小板凝胶及其制备方法，是以具有良好的生物可降解性和生物相容性的天然材料—壳聚糖作为生物支架与递药载体，将PRP中的纤维蛋白原活化成的纤维蛋白网状结构连结于壳聚糖分子构成凝胶载体支架，而血小板来源的细胞因子粘附、锚着于凝胶载体支架中，以此形成复合型血小板凝胶。该凝胶具有快速促进组织再生、止血、抗菌、镇痛、保湿等多重作用，且制备简单、使用方便，并可实现血小板源性生长因子及活性物质的缓释，发挥生物效应持久。适用于软/硬组织缺损、皮肤/粘膜难愈性损伤或溃疡、关节软骨退行性变、缺血性组织坏死等修复治疗中应用。
【IPC分类】A61L27/20, A61K9/06, A61P17/02, A61K47/36, A61L27/36, A61K35/19, A61K35/16, A61L27/52
【公开号】CN105030826
【申请号】CN201510315609
【发明人】王海平, 郭希民, 钱智勇, 张雅妮, 周勇, 邵春燕, 卓海龙, 王全立
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院附属医院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月10日