理盐水润湿，得到样品2 ;
[0112] 3)根据实施例4中的透明质酸钠和凝血酶的含量，制备新的止血膜，同样裁剪成 2cmX2. 5cm的大小，用2ml的生理盐水润湿，得到样品3 ;
[0113] 4)根据步骤1)得到的样品中凝血酶的含量，将凝血酶冻干粉用2ml的生理盐水润 湿，得到样品4;
[0114] 5)由步骤1)、2)、3)得到的样品测定第一天凝血酶的活性；
[0115] 6)由步骤1)、2)、3)得到的样品同时放入老化箱中（老化条件：45°C、湿度60%)， 一周后取出样品，测定样品的凝血酶活性。
[0116] 2、实验结果：第一天凝血酶活性见表1 ;一周后凝血酶活性见表2
[0117] 表1:第一天凝血酶活性
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[0121] 由表1、表2可以看出，透明质酸钠对凝血酶的稳定性无作用；羧甲基壳聚糖对凝 血酶的活性有稳定性作用。
[0122] 实验例2:体外凝血时间
[0123] 1、实验步骤
[0124] 1)取试管27支；
[0125] 2)将由实施例1~6得到的复合止血膜裁剪成2cmX 2. 5cm的大小，用2ml的生理 盐水润湿，分别得到样1、样2、样3、样4、样5、样6 ;
[0126] 3)根据实施例1的中的透明质酸钠和羧甲基壳聚糖的含量，制备不添加凝血酶的 止血膜，将得到的止血膜裁剪成2cmX 2, 5cm的大小，用2ml的生理盐水润湿，分别得到对照 品1 ;
[0127] 5)根据实施例1中的凝血酶含量，将不含透明质酸钠与羧甲基壳聚糖的凝血酶冻 干粉用2ml的生理盐水润湿，分别得到对照品2 ;
[0128] 6)根据实施例1中的羧甲基壳聚糖和凝血酶含量，将不含透明质酸钠原料制备成 止血膜，再用2ml的生理盐水润湿，得到对照品3 ;
[0129] 7)将制备的样品1-6及对照品1-3放入老化箱内老化（老化条件为：温度45°C、 湿度60% )，待一周后取出样品及对照品；
[0130] 8)将猪静脉麻醉后动脉插管，迅速给各管加入血液至IOml于各试管中，同时开始 计时。
[0131] 9)室温下每隔20s试管倾斜一次，至血液不再流动时停止计时。即得全血凝固时 间。
[0132] 2、实验结果：见表3
[0133] 表3 :添加凝血酶的样品凝固时间
[0135] 从表3中看出：由实施例1-6得到的复合止血膜，当裁剪为大小2cmX 2. 5cm时， 在加入IOml的新鲜猪血后，其止血平均时间在3min ;样1与对照品1相比看出在加入凝血 酶后止血时间明显缩短；样1与对照组2、对照组3相比看出凝血酶活性在复合止血膜的羧 甲基壳聚糖中能够保持一定的稳定性。
[0136] 结果表明：本发明在与实施例1-6相同配比的透明质酸钠和羧甲基壳聚糖的基础 上添加适当的凝血酶有助于提高凝血时间，同时能够保证凝血酶的稳定性。
[0137] 实验例3 :复合止血膜动物实验
[0138] 1、实验方法：
[0139] 1)动物建模：从家兔耳缘静脉按30~40mg/kg体重剂量注射3%戊巴比妥钠，麻 醉后在手术台上固定，腹部剪毛、消毒，75%乙醇消毒铺巾后沿左侧肋缘下5cm切口，剪开 皮肤、腹膜逐层开腹进入腹腔，暴露肝脏，在肝脏左页表面用手术刀划出1条长约lcm、深 0. 3cm的切割伤。
[0140] 2)出血时间和出血量测定：建模后迅速用已称量的干燥纱布吸干切口部位血液， 并根据分组立即于出血最明显部位铺放复合止血膜（空白对照组不放任何止血材料），开 始计时，用手压迫创面15s抬起（空白对照组用纱布压迫创面15s)，观察各组止血材料凝 固过程，直至无新鲜血液流出，记录时间，延续观察2min无新鲜血液渗出则之前记录时间 为止血时间。若2min内有新鲜血液流出，则立刻重新按压15s，重复上述步骤，直至止血成 功。整个过程中用已知重量的无菌纱布收集手术中多余血液（即出血量=止血后纱布质 量一止血前纱布质量）。记录出血量和止血时间，并在使用后14天观察止血材料与创面的 粘合情况。
[0141] 2、实验分组：
[0142] 取健康合格新西兰兔15只，根据体重随机分为3组，每组5只，雌雄兼用，分别为 供试品组（实施例5提供的复合止血膜，2cmX 4cm/只）、同类产品对照组（可吸收止血膜， 2cmX4cm/只）、空白对照组（不做任何处理）。动物分组及编号见表4。
[0143] 表4动物分组及编号
[0145] 注：复合止血膜为按照实施例1的制备得到；可吸收止血膜由透明质酸钠和羧甲 基壳聚糖制备而成。
[0146] 3、实验结果：见表5
[0147] 表5动物实验的结果
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[0149] 表5结果显示：与空白对照组相比，供试品组的出血时间显著缩短(Ρ〈0· 05)，且出 血量也显著减少（Ρ〈〇. 05)。与同类产品组相比，供试品组的出血时间显著缩短（Ρ〈0. 05)， 出血量也有所下降。
[0150] 结果表明：与空白对照组与同类产品组比较，供试品具有止血速度快、并减少出血 量的作用，使用14天后在体内无肉眼可见残留，未产生组织粘连现象；且供试品的降解作 用于同类产品相当。
[0151] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种含有凝血酶的复合止血膜，其原料包含以下成分：凝血酶与选自透明质酸钠、 羧甲基壳聚糖中的一种或两种，但不包括透明质酸钠和凝血酶的组合。2. 根据权利要求1所述的复合止血膜，其特征在于，其原料包含以下重量份的成分：凝 血酶0. 05-8份和选自透明质酸钠0-20份、羧甲基壳聚糖0. 1-8份中的一种或两种，但不包 括透明质酸钠和凝血酶。3. 根据权利要求2所述的复合止血膜，其特征在于，所述止血膜原料包括以下重量份 的成分：凝血酶〇. 1-6. 0份和选自透明质酸钠1. 5-12份、羧甲基壳聚糖0. 25-6. 0份中的一 种或两种，但不包括透明质酸钠和凝血酶。4. 根据权利要求3所述的复合止血膜，其特征在于，所述止血膜原料包括以下成分：凝 血酶1. 0-6. 0份和选自透明质酸钠1. 5-7. 5份、羧甲基壳聚糖2. 0-6. 0份中的一种或两种， 但不包括透明质酸钠和凝血酶。5. 根据权利要求4所述的复合止血膜，其特征在于，所述止血膜原料包括以下成分：凝 血酶2. 5-6. 0份和选自透明质酸钠1. 5-3. 0份、羧甲基壳聚糖5. 0-6. 0份中的一种或两种， 但不包括透明质酸钠和凝血酶。6. 根据权利要求5所述的复合止血膜，其特征在于，所述止血膜原料包括以下成分：透 明质酸钠1. 5份、羧甲基壳聚糖6. 0份和凝血酶6. 0份。7. 根据权利要求2所述的复合止血膜，其特征在于，所述止血膜原料包括以下成分：羧 甲基壳聚糖6. 0份和凝血酶6. 0份。8. 根据权利要求1-7任一项所述的复合止血膜，其特征在于，所述凝血酶为白色或类 白色的冻干块状物或粉末；所述透明质酸钠的分子量为50~300万道尔顿；所述羧甲基壳 聚糖的分子量为1~100万道尔顿。9. 制备权利要求1-8任一项所述的复合止血膜的方法，其特征在于，该方法包括以下 步骤： 1) 将透明质酸钠直接溶解于纯化水中，配制得到透明质酸钠溶液； 2) 将羧甲基壳聚糖直接溶解于纯化水中，配制得到羧甲基壳聚糖溶液； 3) 将步骤1)得到透明质酸钠和步骤2)得到的羧甲基壳聚糖溶液混合，然后按照配比 将凝血酶加入其中，搅拌均匀；或， 将凝血酶加入到步骤2)得到的羧甲基壳聚糖溶液，再将步骤1)得到的溶液加入到其 中，混合均匀； 4) 将三种原材料的混合溶液，进行冷冻干燥。10. 权利要求1-8任一项所述的复合止血膜在制备止血、防粘连类的医疗器械中的应 用。
【专利摘要】本发明涉及一种含有凝血酶的复合止血膜及其制备方法，该止血膜的原料含有凝血酶、透明质酸和羧甲基壳聚糖。本发明所使用的材料为天然高分子材料，均可被人体吸收，对身体没有副作用，非常安全，通过添加止血因子，缩短手术的止血时间，大大提高手术的效率。
【IPC分类】A61L31/04, A61L15/44, A61L15/38, A61L15/28, A61L31/16, A61L15/64
【公开号】CN105126153
【申请号】CN201510535896
【发明人】李湘杰, 翟晖, 张婷婷, 李次会, 丁力
【申请人】北京大清生物技术有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月27日