接种于LB固体培养基，继续在37°C条件下培养24小时， 观察无细菌生长的最小浓度即是药物的最小抑菌浓度。
[0043] 结果显不，木犀草素对S.aureusN315的最小抑菌浓度为128yg/mL(万古霉素对 S.aureusN315的最小抑菌浓度仅为< 1yg/mL)。可见其作用较弱，作为金黄色葡萄球菌 生长繁殖的抑制药物，前景非常有限。
[0044] < 实例2〉
[0045] 木犀草素金黄色葡萄球菌对生物膜作用浓度的测定
[0046] 生物膜形成能力分析采用96孔板结晶紫染色法。血琼脂平板转S.aureusN315 过夜活化，挑单菌落于10血TSB肉汤摇菌2地，菌液比浊稀释至0. 5麦氏单位，再用TSB肉汤 稀释100倍。实验分为空白对照组和木犀草素处理组（终浓度分别为8、16、32、64yg/mL)， 每组设置3个复孔，37°C解育2地。W每孔200yLPBS缓冲液轻柔冲洗两次，将96孔板倒 置于通风阴凉处进行风干固定。固定24h后，W每孔200iiL1%结晶紫溶液染色lOmin，移 除结晶紫溶液，并W流水冲洗96孔板至空白对照孔无明显颜色，再次倒置于通风阴凉处进 行风干。风干后每孔加入100yL30 %冰醋酸溶液充分溶解染色液，酶标仪590nm处测定光 密度。 W47] 结果表明木犀草素亚抑菌浓度1/16MIC(8yg/mU、1/8MIC(16yg/mU、 1/4MIC(32yg/ml)、1/2MIC(64yg/ml)均能抑制金黄色葡萄球菌N315生物膜形成。结果见 图1。
[0048] < 实例3〉
[0049] 木犀草素对金黄色葡萄球菌的生物膜抑制作用的观察
[0050] 用含有0. 25%葡萄糖的TSB培养基（膜蛋白腺大豆肉汤培养基）配制终浓度为 每毫升1X1〇5个的工作菌液，在96孔板中每孔加入工作菌液200yL;6孔板中先加入预先 泡酸处理的盖玻片，再加入工作菌液3mL。将加有菌液的培养板置于37°C溫箱中培养2地。 培养结束后在96孔板中、6孔板中的盖玻片上即形成了生物被膜。分别用0. 5%结晶紫染 色液、5 %硝酸银溶液及巧光染料（SYT09和PI)进行染色，分别用巧光显微镜和激光共聚焦 显微镜进行观察。 阳〇5U 结果表明：1/8MIC(16yg/ml)、1/16MIC(8yg/ml)木犀草素均能显著抑制 S.aureusN315的生物膜形成。结果见图2。
[0052] < 实例 4〉
[0053] 木犀草素对金黄色葡萄球菌的毒力因子抑制作用
[0054] 1.a-溶血素活力测定
[0055] 无菌条件下抽取的新鲜兔血5ml，迅速移至高压灭菌的装有玻璃珠的S角瓶中，按 一个方向针轻轻摇动，带出现明显团块为止，即得去纤维蛋白兔血，吸取兔血红细胞，用灭 菌氯化巧缓冲液洗涂，300化/min离屯、5分钟，洗涂3次，使离屯、后上清液体澄清为止。向 1. 5ml灭菌离屯、管加入875y1氯化巧缓冲液，100y1样品上清，25y1红细胞，37°C解育30 分钟；5500Xg离屯、1分钟；OOmsMi测定其吸光值，W全溶作为100。
[0056] 结果表明1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC和1/16MIC组的溶血活力低于对照组（图3)。 高浓度木犀草素对S.aureusN315a-溶血素蛋白的表达有明显的抑制作用，且在较宽浓度 范围都能明显降低a-溶血素的表达，低浓度仍能抑制a-溶血素表达。
[0057] 2.凝固酶的效价测定
[0058] 抽取新鲜兔血4ml，肝素抗凝，300化/min离屯、10分钟，弃掉血细胞取上层血浆，按 PBS和血浆体积比例4 : 1稀释；用灭菌LB培养基将上述收集的不同浓度蜂培养的菌液倍 比稀释，每试管中加入100y1巧加入0. 5ml稀释的兔血浆，于37°C解育，观察，每15分钟 观察一次，直至产生凝集现象。W产生凝集的最高稀释倍数作为凝固酶效价。
[0059] 实验结果表明1/2MICU/4MIC和1/8MIC组能够减少凝固酶的产生，低浓度不能抑 制其产生，结果见表1。 W60] 表1血凝固分析
[0061]
[0062] 3.肠毒素A、B的WesternBlot分析
[0063] 取收集的不同木犀草素浓度培养的S.aureusN315的培养液上清样品30yg， 加入上样缓冲液，煮沸5111111，配制5%浓缩胶，12%分离胶进行505斗466电泳，半干法转 膜化034,30111111);3.5%654封闭化；加入一抗664，1:5000;5邸，1:1000;曰-溶血 素，1 : 8000)室溫慢摇比；TBST清洗3次，每次lOmin;加入HRP标记的二抗（SEA，沈B， 1 : 4000;a-溶血素，1 : 5000)室溫轻摇比，再洗涂；E化显色，胶片曝光、显影。具体过 程如下。 W64] (1)总蛋白浓度的测量
[00化]完全溶解蛋白标准品巧mg/mlBSA)，取10y1稀释至100y1，使终浓度为0. 5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可W用 0. 9%化C1或PBS稀释标准品。将稀释后标准品（0. 5mg/mlBSA)按0，1，2,4,8，12，16， 20y1分别加到96孔板中，加标准品稀释液将所有标准品补足到20y1。加适当体积样品到 96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20y1。各孔加入200y1化a壯ord染色液，轻轻用 加样枪吹打混匀（注意不要弄出气泡影响读数）室溫放置3-5分钟。用酶标仪测定Asee皿 波长的吸光度，根据标准品测得数值绘制标准曲线。根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓 度。
[0066] (2)SDS-PAGE电泳 W67]A.制备凝胶 W側洗净玻璃板，封闭后固定在电泳槽上。按TaKaRa目录的配方配制12%的分离胶， 约占容积的=分之二，迅速注入两玻璃板之间，胶顶加入1. 5mL去离子水。37°C待分离胶凝 固后倒出上层水，用去离子水清洗凝胶顶部数次，倒干液体，用滤纸将水吸干，加入5 %的浓 缩胶溶液至玻璃板顶部，插上梳子，垂直放置使其凝固。小屯、移去梳子，将凝胶玻璃板放入 电泳槽，将电源连接好，在电泳装置加入Tris-甘氨酸缓冲液。 W例 B.上样电泳
[0070]将含30mg总蛋白的菌液上清与5XSDS-PAGELoadingBuffer按照4 : 1的比例 混合。加热煮沸5分钟变性，上样。用90V电压进行浓缩胶电泳，蛋白进入分离胶后，将电 压提高到110V，使蛋白电泳达到分离胶底部。 阳〇7U C.转膜
[0072] 取下凝胶用蒸馈水冲洗，放入电转移缓冲液中。并将PVDF膜裁剪成与凝胶同样大 小尺寸，用剪刀在PVDF膜一角做好标记，浸入甲醇溶液5s左右，放入电转移缓冲液。裁剪 两张BI0-RAD所带滤纸，同样浸泡电转移缓冲液中。浸泡10分钟W上W驱除留于滤膜和滤 纸上的气泡。戴上手套按照如下方法安装转移装置：平放底部电极（阳极）、滤纸、PVDF膜 (正面朝上）、凝胶、滤纸。石墨电极扣上。放置时要保证精确对齐，各层不能留有气泡。电 流确定：长X宽X2。转膜电流为0. 03A，时间为30分钟。 阳〇7引D.封闭 阳074] 把PVDF膜放入覆盖有塑料膜的小托盘中，倒入约20mL的TBS封闭液，平放在平缓 摇动的摇床上，于室溫摇动4小时或4°C过夜。 阳〇7引E.免疫反应
[0076] 将一抗用TBST稀释至适当浓度（SEA，1 : 5000 ;S邸，1 : 1000 ;a-溶血素， 1:8000);剪下大小适当的一块儿保鲜膜铺于塑料板上，四角用力化平保持平整；把一抗 溶液滴加到保鲜膜上；从封闭液中取出PVDF膜，用滤纸将残留液吸去后，将膜结合蛋白面 朝下放置在抗体液面上，一端先接触抗体，再慢慢将另一端放下防止有气泡残留；室溫下解 育轻摇1小时后，用TBST在室溫下脱色摇床上洗=次，每次10分钟。同上方法准备HRPB 标记的二抗稀释液（SEA，S邸，1 : 4000; a-溶血素，1 : 5000)与膜接触，室溫下解育轻摇 1小时后，用TBST在室溫下脱色摇床上洗=次，每次10分钟，进行化学发光反应。
[0077]F.化学发光，显影，定影
[0078] 将A和