胡椒碱在制备防治败血症药物中的应用

胡椒碱在制备防治败血症药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物领域，具体设及胡椒碱在制备防治败血症药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 胡椒碱（Piperine)是胡椒科植物提取的天然化合物，其分子式为CnHigN〇3;化学 名称为巧,E)-l-[5-(l,3-苯并二氧戊环-5-基）-1-氧代-2, 4-戊二締基]-赃晚。白色 晶体粉末。烙点130~133°C。溶于乙酸、苯、乙醇和氯仿，微溶于乙酸。其化学结构如下：
[0003]
[0004] 中医理论和实践表明，胡椒入胃大肠经，溫中散寒，下气，消疲。可用于胃寒呕吐， 腹痛泄泻，食欲不振，癒痛疲多。简单地说，胡椒可用于治疗胃肠不适和癒痛。胡椒碱在治 疗结肠炎方面的用途，可见公开专利文件（申请公布号CN103690537A)。
[0005] 败血症是一类因病原菌进入机体血液系统后，迅速繁殖并产生大量毒素，激发机 体免疫系统产生过度炎症性反应的症状，致死率极高。目前临床上防治败血症的治疗主要 采用注射抗生素的抗感染治疗和加强营养等支持性治疗为主。然而，由于抗生素的滥用，很 多细菌产生了抗药性，削弱了抗感染治疗的效果。某些情况下，如肠道溃瘍，在肠道尚未修 复的情况下，有害细菌可持续进入机体。mTORCl(雷帕霉素祀蛋白）在维持机体免疫平衡 中起着非常重要的作用，其负责整合环境信号和细胞内信号，如营养物质（如氨基酸和葡 萄糖）、细胞应激、W及生长因子。在免疫低下的情况下，病人的代谢和吸收能力弱，mTORCl 活性低，对细菌感染的免疫力低，容易发展成败血症。
[0006] 研制有效的药物及阐明其抗败血症机制是败血症治疗的难点。抗败血症药物的研 究得益于多种动物模型的建立，其中腹腔注射大肠杆菌DH5a小鼠模型有良好的稳定性和 可重复性，能很好地用来研究药物抗败血症的机制。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的在于提供胡椒碱在制备防治败血症药物中的应用，胡椒碱可提高细 胞mTORCl活性，增强组织巨隧细胞的功能，防治败血症。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] 胡椒碱可用于制备防治败血症的药物，将胡椒碱与谷氨酷胺、亮氨酸联用时，防治 效果更好；
[0010] 所述的防治败血症的药物还包含可接受的辅料和其他起配伍协同作用的有效成 分；
[0011] 所述的防治败血症的药物可W为各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、缓释剂、 口服液、注射剂等。
[001引经研究发现，胡椒碱可上调细胞内mTORCl的活性，可上调氨基酸转运载体SLC7A5/化C3A2在细胞表面的分布。在营养缺乏、氨基酸水平低下（如低水平的谷氨酷胺和 亮氨酸）的情况下，胡椒碱是mTORCl的增强剂；在氨基酸缺乏、细胞mTORCl被完全抑制的 情况下，胡椒碱可通过与谷氨酷胺、亮氨酸联合，激活mTORCl信号通路。
[0013] 另外，胡椒碱可上调组织定居的常驻巨隧细胞对感染细菌的吞隧功能，可上调常 驻巨隧细胞分泌TNF-a和IL-6等细胞因子，增强组织损伤修复能力。在炎症条件下，胡椒 碱可抑制巨隧细胞分泌IFN-丫；胡椒碱可保护受感染的腹腔巨隧细胞免于调亡；胡椒碱还 可防止腹腔巨隧细胞重要亚群（如Gata6+亚群）的丢失。
[0014] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0015] 胡椒碱可强烈增强亮氨酸诱导的mTORCl的激活。胡椒碱还可防止细菌腹腔感染， 防止败血症的发生。胡椒碱还可增强巨隧细胞的功能，包括其细菌吞隧功能，分泌TNF-a 和IL-6的能力，防止细菌感染诱导的巨隧细胞调亡。因此，胡椒碱或胡椒碱与亮氨酸、谷氨 酷胺联合，可增强机体mTORCl活性，用于治疗细菌感染和败血症。胡椒碱的上述新的活性 与用途，尚未见公开文献报道。
【附图说明】
[0016] 图1是胡椒碱对前列腺癌细胞LNCaP细胞mTORCl信号轴激活的免疫印迹图和灰 度分析图。
[0017] 图2是胡椒碱对子宫颈癌细胞化La细胞mTORCl信号轴激活的免疫印迹图和灰度 分析图。
[001引 图3是胡椒碱对小鼠RAW 264. 7巨隧细胞mTORCl信号轴激活的免疫印迹图和灰 度分析图。
[0019] 图4是胡椒碱对无血清的邸SS溶液饥饿的化La细胞的mTORCl信号轴激活的免 疫印迹图和灰度分析图。
[0020] 图5是胡椒碱与谷氨酷胺和亮氨酸联合对KRBB溶液饥饿的化La细胞mTORCl信 号轴激活的免疫印迹图和灰度分析图。
[0021] 图6是胡椒碱与亮氨酸联合对KRBB溶液饥饿并预先加载谷氨酷胺的化La细胞 mTORCl信号轴激活的免疫印迹图和灰度分析图。
[0022] 图7是胡椒碱与亮氨酸联合对KRBB溶液饥饿并预先加载谷氨酷胺的小鼠腹腔常 驻巨隧细胞mTORCl信号轴激活的免疫印迹图和灰度分析图。
[0023] 图8是胡椒碱对氨基酸转运载体化C7A5/SLC3A2在化La细胞表面分布的巧光强 度分析图。
[0024] 图9是二甲双脈对胡椒碱保护F4/80阳性的腹腔常驻巨隧细胞比率影响的流式细 胞术分析图和差异统计分析图。
[00巧]图10是二甲双脈对胡椒碱上调腹腔常驻巨隧细胞吞隧细菌能力影响的流式细胞 术分析图和差异统计分析图。
[0026] 图11是胡椒碱预处理1小时后LI^S刺激腹腔巨隧细胞表达TNF-a和IL-6水平 的分析图。
[0027] 图12是胡椒碱预处理6小时后LPS刺激的腹腔巨隧细胞表达TNF-a和IL-6水 平的分析图。
[002引图13是胡椒碱预处理48小时后LPS刺激的腹腔巨隧细胞表达TNF-a和IL-6水 平的分析图。
[0029] 图14是胡椒碱体内预处理（灌胃）10天后取出体外培养的小鼠腹腔巨隧细胞在 LPS刺激下表达TNF-a和IL-6水平的定量分析图。
[0030] 图15是胡椒碱处理后LPS刺激的炎症性巨隧细胞分泌IFN- 丫水平的分析图。
[0031] 图16是胡椒碱对细菌感染的CDUb阳性的腹腔巨隧细胞活化调亡蛋白Cleaved caspase-3表达量的流式细胞术检测图和统计分析图。
[0032] 图17是胡椒碱对细菌感染的F4/80阳性的腹腔巨隧细胞活化调亡蛋白Cleaved caspase-3表达量的流式细胞术检测图和统计分析图。
[0033] 图18是胡椒碱对细菌感染的腹腔巨隧细胞重要亚群（如Gata6+亚群）的免疫巧 光和细胞核形态观察图。
[0034] 图19是胡椒碱预处理后腹腔接种细菌的小鼠的生存率分析图。
[0035] 图20是腹腔接种细菌后再注射胡椒碱的小鼠生存率分析图。
[0036] 图21是胡椒碱预处理后腹腔接种细菌的小鼠的器官损伤分析图。
[0037] 图22是胡椒碱预处理后腹腔接种细菌的小鼠腹腔灌洗液中炎症因子表达量的分 析图。
[003引图23是胡椒碱预处理后腹腔接种细菌的小鼠腹腔灌洗液中细菌载量（培养菌落 数）分析图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0040] 实施例1
[00川胡椒碱上调细胞内mTORCl的活性
[0042] 将不同浓度（40、80、160ymol/L)的胡椒碱加入培养于6孔板的细胞系（前列腺 癌细胞系LNCaP、人宫颈癌细胞系化La、小鼠巨隧细胞系RAW264. 7)解育2小时，收集细胞 裂解后的蛋白，用Westernblot方法检测mTORCl下游底物p70S服和4E-BP1的憐酸化。
[0043] 结果表明，胡椒碱分别预处理LNCaP(图1)、HeLa(图。W及RAW264. 7细 胞（图3)，剂量依赖性（浓度分别为40、80、160ymol/L)地上调p70S服和4E-BP1蛋 白的憐酸化，而不影响细胞内P70S6K和4E-BP1蛋白表达量。图1-3柱形图分别统计 S种细胞内p-p70S6K/p70S服WP-4E-BP1/4E-BP1的比例，冲<0. 05(差异有统计学意 义），*冲<0. 01 (差异显著），**冲<0. 001 (差异极显著）。p70S服和4E-BP1蛋白是mTORCl 激酶复合体的作用底物，它们的憐酸化水平上调，说明胡椒碱可剂量依赖性地上调mTORCl 的活性。
[0044] 实施例2
[0045]营养缺乏时（细胞内mTORCl活性较低），胡椒碱作为mTORCl的增强剂
[0046] 将40ymol/L胡椒碱加入血清饥饿的化La细胞培养基（无血清的邸SS或DMEM 培养基）中，用Westernblot方法检测mTORCl下游底物p70S服的憐酸化，评估mTORCl的 活性。
[0047] 结果发现，HeLa细胞经无血清的邸SS饥饿W后，p70S服的憐酸化水平（即mTORCl 的活性）较低，邸SS培养基中是否含有葡萄糖（Glc)，也不论是否含有胡椒碱，都不影响p70S服的憐酸化水平（图4)，说明胡椒碱对mTORCl的效应，与葡萄糖无关。但是，无血清 的DMEM培养基可激活p70S服的憐酸化，而胡椒碱可极显著增强DMEM诱导的p70S服憐酸 化（**冲<0. 001)。该结果说明，胡椒碱上调mTORCl效应，可能与培养基中存在氨基酸有关。 [004引实施例3
[0049] 在细胞mTORCl活性低下时，胡椒碱与谷氨酷胺、亮氨酸联合，激活mTORCl信号通 路
[0050]将 40ymol/L胡椒碱、0. 8mmol/L左旋亮氨酸（X-Leucine,Leu)和 2mmol/L的左 旋谷氨酷胺化-Glutamine,Gin)(下同），分别加入血清饥饿的化La细胞（图5-6)和小鼠 腹腔巨隧细胞（图7)培养基中。
[0051] 结果表明，p70S6K的憐酸化（指示mTORCl的激活）依赖于细胞内Gin和Leu的 存在。如图5所示，化La细胞在血清和氨基酸饥饿巧Omin)条件下，mTORCl的活性被抑制 (第一泳道）。Gin本身不能激活mTORCl。由于短时间饥