饿后，细胞内仍存在少量Gln，Leu 可轻微上调mTORCl。加入胡椒碱W后，可显著上调Leu激活的mTORCl活性（冲<0. 01)。 [005引图6进一步表明，化La细胞在氨基酸（Gln+Leu，其中Gin提前1小时加载）存在 的条件下，胡椒碱可显著上调mTORCl的活性。同样地，在氨基酸存在的条件下（其中Gin提前1小时加载），胡椒碱可显著上调小鼠腹腔巨隧细胞（图7)中Leu诱导的mTORCl的活 性。
[005引运些结果说明，胡椒碱可显著上调由Leu诱导的mTORCl的活性。
[0054]实施例4
[00巧]胡椒碱上调氨基酸转运载体化C7A5/SLC3A2在细胞表面的分布
[0056]将胡椒碱（40ymol/L)、Leu(0. 8mmol/L)，加入血清饥饿的化La细胞培养基（无 血清的KRBB)中，通过巧光显微镜观察巧光抗体标记的氨基酸转运蛋白化C3A2。
[0057] 结果表明，溶剂本身不能影响中性氨基酸受体化C7A5/SLC3A2在细胞膜上的分 布。但加入胡椒碱后，该氨基酸受体的平均巧光强度显著上调，Leu的存在与否似乎不影 响该受体在细胞膜上的分布（图8)。运些结果说明，胡椒碱可通过上调中性氨基酸受体 SLC7A5/化C3A2在细胞膜上的分布，上调氨基酸诱导的mTORCl的活性。
[00则实施例5
[0059] 胡椒碱上调组织定居的巨隧细胞对感染细菌的吞隧功能
[0060]W胡椒碱（每只小鼠20mg/kg)、二甲双脈（每只小鼠250mg/kg)对C57化/6小鼠 进行灌胃，4小时后腹腔注射CFSE标记的灭活的大肠杆菌E.coli作用0. 5小时，从腹腔 中分离巨隧细胞，巧光抗体F4/80标记巨隧细胞。通过流式细胞仪检测F4/80阳性细胞对 CF沈-E.coli的吞隧能力。
[0061] 结果表明，小鼠经细菌E.coli注入腹腔0. 5小时后，细胞内F4/80巨隧细胞的比 例迅速下降为23% (正常小鼠运一比例为80%左右）。但胡椒碱灌胃小鼠中，细菌感染后F4/80巨隧细胞的比例下降至32%，说明胡椒碱可缓解因细菌感染诱导的F4/80巨隧细胞 的丢失。如果胡椒碱灌胃时，加入二甲双脈（该药可激活AMPK而抑制mTORCl的活性），细 菌感染后F4/80巨隧细胞的比例更降至16% (图9)。
[006引E.coli经CFSE标记，因而可用流式细胞术方法检测。结果表明，CFSE阳性细胞 (负载细菌的细胞）同时也是F4/80阳性细胞（图10)。该结果说明，F4/80是细菌感染早 期（本例为0.5小时）腹腔内主要的吞隧细菌细胞，而胡椒碱灌胃可缓解小鼠因细菌感染 诱导的F4/80阳性腹腔巨隧细胞的丢失，该保护效应与胡椒碱上调细胞内mTORCl的活性有 关。
[006引 实施例6
[0064] 胡椒碱上调巨隧细胞分泌TNF-a和IL-6等细胞因子
[0065] 取正常C57化/6小鼠的腹腔巨隧细胞，均匀的种植到24孔板里。将胡椒碱 (40ymol/L)预处理小鼠腹腔巨隧细胞1小时（图11)、6小时（图12)和48小时（图13)， 细菌脂多糖（LP巧（lOOng/ml)刺激细胞24小时。另胡椒碱（每只小鼠20mg/kg)连续灌胃 C57化/6小鼠10天，然后分离小鼠的腹腔巨隧细胞在24孔板中培养，加LPS(l(K)ng/ml)刺 激细胞24小时（图14)。收集细胞培养基上清，通过抓公司的CBA炎症因子检测试剂盒， 在流式细胞仪上检测TNF-a和IL-6等细胞因子的表达量。
[0066] 测定结果显示，胡椒碱预处理短时间（1小时和6小时）或者长时间（48小时）后 均能上调LPS刺激的腹腔巨隧细胞分泌TNF-a和IL-6炎症因子，而且胡椒碱灌胃10天的 小鼠腹腔分离的巨隧细胞，在体外LI^S刺激后TNF-a和IL-6因子均高于溶剂组，说明胡椒 碱能增强固有免疫细胞的功能（另参见实施例10)。
[0067] 实施例7
[006引胡椒碱可抑制炎症性巨隧细胞分泌IFN- 丫
[0069] 将胡椒碱（40ymol/L)在体外分别作用于培养在24孔板内的正常鼠的腹腔巨 隧细胞和腹腔注射琉基乙酸盐灯hioglycollate，TG)诱导的巨隧细胞48小时，然后加 LPS(10化g/ml)刺激细胞24小时。收集细胞培养上清，使用CBA试剂盒，通过流式细胞仪检 巧。IFN-丫等因子的表达水平。
[0070] 结果显示，胡椒碱对正常的腹腔巨隧细胞分泌IFN- 丫没有影响，而能够显著抑制 TG诱导的巨隧细胞在炎症条件下IFN-丫的表达，表明胡椒碱对炎症性细胞有免疫调节作 用（图15)。
[00川实施例8
[0072] 胡椒碱保护受感染的腹腔巨隧细胞免于调亡
[0073]将胡椒碱（20mg/kg)、二甲双脈（250mg/kg)灌胃C57化/6小鼠，4小时后腹腔注 射活的E.coli(0. 5X109CFU/mouse)作用0. 5小时，从腹腔中分离巨隧细胞，用巧光抗体 CDUb、F4/80(巨隧细胞标志物）和cleavedcaspase-3(调亡蛋白）染色。通过流式细胞 仪检测腹腔巨隧细胞中的活化调亡蛋白cleavedcaspase-3巧光强度。
[0074] 结果显示，腹腔巨隧细胞在吞隧细菌0.5小时后调亡蛋白cleavedcaspase-3在 CDUb+(图16)和F4/8(T(图17)细胞中有明显的表达，而胡椒碱能够抑制调亡蛋白cleaved caspase-3在细胞中的表达，胡椒碱抑制细胞调亡的效应能被二甲双脈逆转。运表明，胡椒 碱通过mTORCl信号保护腹腔巨隧细胞因细菌感染引起的调亡。
[00巧]实施例9
[0076] 胡椒碱防止腹腔巨隧细胞重要亚群（如Gata6+亚群）的丢失
[0077] 将胡椒碱（20mg/kg)、二甲双脈（250mg/kg)灌胃C57BL/6小鼠，4小时后腹腔注射 活的E.coli(0. 5X109CFU/mouse)作用0. 5小时，从腹腔中分离巨隧细胞然后种到玻璃底 培养皿中，贴壁3小时后洗去未贴壁细胞。通过细胞免疫巧光法标记CDUb(巨隧细胞的标 志物）、Gata6 (转录因子）和Hoechst33342 (核染料）。
[007引在巧光倒置显微镜下观察显示，细菌感染溶剂灌胃的小鼠腹腔巨隧细胞后，CDUb阳性细胞减少、Gata6因子逐渐消失、细胞核出现浓缩或碎裂（呈细胞调亡形态），而胡椒碱 灌胃鼠的巨隧细胞核相对完整、Gata6聚集在核内，说明胡椒碱可保护腹腔巨隧细胞免于因 细菌感染而死亡，但胡椒碱的运种保护效应能够被二甲双脈所抑制。该实施例中更直观的 结果表明，胡椒碱可保护腹腔巨隧细胞免于细菌感染引起的调亡，防止重要功能亚群（此 例中卫Gata6+细胞）的丢失（图18)。
[007引实施例10
[0080] 胡椒碱单独或与谷氨酷胺、亮氨酸联用，可抑制细菌感染，防止和治疗败血症的发 生
[0081] 将不同剂量的胡椒碱预先灌胃C57化/6小鼠3天，然后腹腔注射致死剂量 (2X1〇9cFU)的活的E.coli(图19)，或者先腹腔注射半致死剂量（1X1〇9cFU)的活的 E.coli，1小时后再W胡椒碱（20mg/kg)灌胃（图20)，每隔6小时观察记录小鼠的存活情 况，共计4天，绘制小鼠生存曲线分析存活率，结果显示胡椒碱能抵抗细菌感染引起的小鼠 死亡；
[0082] 另胡椒碱（20mg/kg)预先灌胃C57化/6小鼠3天，然后腹腔注射致死剂量 (2X109CFU)的活的E.coli作用8小时，劲椎脱白处死小鼠，取肝脏和结肠，固定、脱水、石 蜡包埋后切片进行H.E.染色（图21)，显微镜下观察。结果显示，胡椒碱降低了肝脏白细胞 的浸润和结肠的炎症性损伤；
[0083] 胡椒碱（20mg/kg)预先灌胃C57化/6小鼠3天，然后腹腔注射半致死剂量 (1X109CFU)的活的E.coli作用不同时间化小时和24小时），收集小鼠腹腔灌洗液，CBA 试剂盒测量腹腔中炎症因子TNF-a和IL-6等的表达水平（图22)，W及菌落计数腹腔内活 细菌的量（图23)，结果显示胡椒碱在细菌感染早期上调腹腔中TNF-a、IL-6因子的表达， 但在后期（24小时）下调运两种细胞因子表达，而细菌的清除呈现时间依赖性，说明胡椒碱 能增强小鼠的腹腔巨隧细胞的固有免疫功能，促进细菌清除W及败血症引起的器官损伤的 修复。
[0084]W上结果表明，胡椒碱可抑制细菌感染，有效防止和治疗败血症的发生。
[0085] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 胡椒碱在制备防治败血症药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的胡椒碱在制备防治败血症药物中的应用，其特征在于：所述 的防治败血症药物中含有胡椒碱、谷氨酰胺和亮氨酸。3. 根据权利要求1所述的胡椒碱在制备防治败血症药物中的应用，其特征在于：所述 的防治败血症药物还包含可接受的辅料和其他起配伍协同作用的有效成分。4. 根据权利要求1所述的胡椒碱在制备防治败血症药物中的应用，其特征在于：所述 的防治败血症药物为片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、缓释剂、口服液或注射剂。
【专利摘要】本发明公开了胡椒碱在制备防治败血症药物中的应用。胡椒碱可强烈增强亮氨酸诱导的mTORC1的激活。胡椒碱还可防止细菌腹腔感染，防止败血症的发生。胡椒碱还可增强巨噬细胞的功能，包括其细菌吞噬功能，分泌TNF-α和IL-6的能力，防止细菌感染诱导的巨噬细胞凋亡。因此，胡椒碱或胡椒碱与亮氨酸、谷氨酰胺联合，可增强机体mTORC1活性，用于治疗细菌感染和败血症。
【IPC分类】A61P31/04, A61K31/4525
【公开号】CN105147684
【申请号】CN201510664801
【发明人】欧阳东云, 何贤辉, 潘浩, 徐丽慧, 黄美云, 查庆兵, 施资坚
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月30日