41] 提供上文实例W证实可能将来自AAV9供体的半乳糖结合位点引入AAV2模板内的 取代。表3列出了对于其鉴定运些相应的氨基酸的几种AAV血清型，化及可W在运些血清型 各自中制备的示例性取代，W引入AAV9的半乳糖结合位点。表3中显示和本文详细描述的 是特异性氨基酸位置是保守的，并且其他氨基酸位置是取代。当显示取代时，表3中阐述的 取代是可W在运些残基位置处制备的各种取代的示例。考虑本发明的实施方案涵盖除AAV9 之外的其他供体AAV血清型，W及除半乳糖结合位点之外的其他聚糖结合位点。
[0042] 表2列出了可W由本发明涵盖的AAV的非限制性示例性血清型化及基因组登录号 和衣壳序列。供体和模板的AAV血清型并不限于人AAV，还可W包括非人AAV，例如禽类或 牛AAV，W及非人灵长类动物AAV，其实例显示于表1中。
[0043] 上文实例显示了在AAV2模板中可能的氨基酸取代，用于引入来自AAV9供体的 半乳糖结合位点。在另一个实例中，模板可W是AAV1或AAV6,并且在对应于AAV2的位置 463-475的氨基酸位置处的取代可W是SX1X2X3PX4X5MXJQX7XS，其中Xi_8可W是任何氨基酸。 在一个特定实施方案中，Xi_ 3是VAG;X4是S;X5是N;Xe是A;X7是G，并且XS是R，导致序列 SVAGPSNMAVQGR。在进一步的实施方案中，在对应于AAV2中的位置499-502的氨基酸位置 处的取代可W是XgFXinW，其中Xg和X1。可W是任何氨基酸。在一个特定实施方案中，Xg是E 并且Xi。是W，导致序列EFAW。
[0044] 在另一个实例中，模板可W是AAV3a或AAV3b，并且在对应于AAV2的位置463-475 的氨基酸位置处的取代可W是SXiAGPXzXsMXAXsQXeR，其中Xi_6可W是任何氨基酸。在一个特 定实施方案中，Xi是V;X2是S;X3是N;X4是A;Xs是N;并且Xe是G，导致序列SVAGPSNMAVQGR。 在进一步的实施方案中，在对应于AAV2中的位置499-502的氨基酸位置处的取代可W是 XyFXsW，其中X,和XS可W是任何氨基酸。在一个特定实施方案中，X7是E并且XS是W，导致 序列EFAW。
[0045] 在另一个实例中，模板可W是AAV4,并且在对应于AAV2的位置463-475的氨基酸 位置处的取代可W是X1X2X3X4PX5NX6X7X品Xi〇X…其中Xi_。可W是任何氨基酸。在一个特定 实施方案中，Xi是S;X2是V;X3是A;X4是G;X5是S;Xe是M;X7是A;XS是V;Xg是Q;X1。是 G;并且X。是R，导致序列SVAGPSNMAVQGR。在进一步的实施方案中，在对应于AAV2中的位 置499-502的氨基酸位置处的取代可W是X12X13X14X。，其中Xi2-i5可W是任何氨基酸。在一 个特定实施方案中，Xi2是E;X13是F;X14是A;并且XU是W，导致序列EFAW。
[0046] 在另一个实例中，模板可W是AAV5,并且在对应于AAV2的位置463-475的氨基酸 位置处的取代可W是X^XsXaXsXsX而AXgXi品品2,其中Xi_ 12可W是任何氨基酸。在一个特定 实施方案中，Xi是S;X2是V;X3是A;X4是G;X5是P;Xe是S;X7是N;XS是M;Xg是V;X1。是 Q;Xi2是G;并且X。是R，导致序列SVAGPSNMAVQGR。在进一步的实施方案中，在对应于AAV2 中的位置499-502的氨基酸位置处的取代可W是X13X14AX15,其中Xi3-i5可W是任何氨基酸。 在一个特定实施方案中，Xi3是E;X14是F;XU是A;并且Xle是W，导致序列EFAW。
[0047] 在另一个实例中，模板可W是AAV7,并且在对应于AAV2的位置463-475的氨基酸 位置处的取代可W是X1X2X3GPSX4MA而QXeX,，其中Xi_7可W是任何氨基酸。在一个特定实施方 案中，Xi是S;X2是V;X3是A;X4是N;X5是V;Xe是G;并且X7是R，导致序列SVAGPSNMAVQGR。 在进一步的实施方案中，在对应于AAV2中的位置499-502的氨基酸位置处的取代可W是 XsFAW，其中而可W是任何氨基酸。在一个特定实施方案中，其中Xs是E，导致序列EFAW。 [004引在另一个实例中，模板可W是AAV8,并且在对应于AAV2的位置463-475的氨基酸 位置处的取代可W是SX1X2GPX3X4MA而QXeX,，其中Xi_7可W是任何氨基酸。在一个特定实施方 案中，Xi是V;X2是A;X3是S;X4是N;X5是V;Xe是G;并且X7是R，导致序列SVAGPSNMAVQGR。 在进一步的实施方案中，在对应于AAV2中的位置499-502的氨基酸位置处的取代可W是 XsFAW，其中而可W是任何氨基酸。在一个特定实施方案中，Xs可W是E，导致序列EFAW。
[0049] 在另一个实例中，模板可W是AAV10,并且在对应于AAV2的位置463-475的氨基酸 位置处的取代可W是X1X2AGPX3NMX4而QXeX,，其中Xi_7可W是任何氨基酸。在一个特定实施方 案中，Xi是S;X2是V;X3是S;X4是A;X5是V;Xe是G;并且X7是R，导致序列SVAGPSNMAVQGR。 在进一步的实施方案中，在对应于AAV2中的位置499-502的氨基酸位置处的取代可W是 XsFAW，其中而可W是任何氨基酸。在一个特定实施方案中，Xs可W是E，导致序列EFAW。
[0050] 上文实例描述了将来自AAV9的半乳糖结合位点引入衣壳蛋白模板内，所述衣壳 蛋白模板可W是AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8或AAV10。运些实例不预期是 限制性的，证实通过修饰限定本文描述的"袋"的残基，可W将来自供体AAV血清型的聚糖 结合位点引入不同AAV血清型的衣壳蛋白模板内的该通用原则(例如表3中列出的)。包含 新的聚糖结合位点的此类经修饰的或嵌合衣壳蛋白可W装配成衣壳，其构成可W用作病毒 载体的病毒颗粒，所述病毒载体具有增加细胞表面结合的有利表型，w及在体内更快速和 增强的转基因表达。
[0051] 如本文使用的，术语"腺伴随病毒"（AAV)包括但不限于AAV1型、AAV2型、AAV3 型(包括 3A和 3B型)、AAV4 型、AAV5 型、AAV6 型、AAV7 型、AAV8 型、AAV9 型、AAV10 型、AAV11型、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、进化枝FAAVW及目前已知或W 后发现的任何其他AAV。参见例如邸RNA畑N.FIELDS等人，VIROLOGY,第2卷，第69章(第 4版，Lippincott-RavenPublishers)。许多相对新的AAV血清型和进化枝已得到鉴定(参 见例如Gao等人（2004) 乂片>〇知斜^ 78:6381-6388和表1)。
[0052] 各种AAV血清型的基因组序列，W及天然末端重复（TR)、R巧蛋白质和衣壳亚 基的序列是本领域已知的。此类序列的示例性但非限制性实例可W在参考文献或公共 数据库例如GenBank?数据库中找到。参见例如GenBank?数据库登录号NC_002077. 1、 NC_001401. 2、NC-001729. 1、NC-001863. 1、NC-001829. 1、NC-006152. 1、NC-001862. 1、 AF513851. 1、AF513852. 1，其公开内容通过引用并入本文，用于教导细小病毒和AAV核酸 和氨基酸序列。还参见例如Srivistava等人（1983) 乂化45:555;Qiio;rini等人 (1998) 乂化TO的巧^ 71:6823 ;Qiio;rini等人（1999) 乂化TO的巧^ 73:1309 ;Bantel-Schaal 等人（1999) 乂片>〇知斜^ 73:939;Xiao等人（1999) 乂片>〇知斜^ 73:3994;Muramatsu等人 (1996)片221:208;Shade等人（1986)乂片58:921;Gao等人（2002)尸roc.yV別. 99:11854 ;国际专利公开胖0 00/28061，W0 99/6160和胖0 98/11244 ;和美国 专利号6, 156, 303 ;其公开内容通过引用并入本文，用于教导细小病毒和AAV核酸和氨基酸 序列。
[0053] 自主性细小病毒和AAV的衣壳结构在邸RNA畑N.FIELDS等人，Virology,第2 卷，第69 & 70章(第4版，Lippincott-RavenPublishers)中更详细地描述。还参见AAV2 (乂16等人（2002)&'〇。絶（.5bi. 99:10405-10)、八八￥4(化化〇11等人（2005)乂 片79: 5047-58)、AAV5(Walters等人（2004) 乂片78: 3361-71)和CPV(Xie 等人（1996) 乂ifoi.化6:497-520 和Tsao等人（1991) 打ce251: 1456-64)的晶 体结构的描述。
[0054] 定女 单数形式"一个"、"一种"和"该/所述"预期还包括复数形式，除非上下文另有明确说 明。
[0055] 此外，如本文使用的，当提及可测量值例如多核巧酸或多肤序列长度、剂量、时间、 溫度等的量时，术语"约"意欲涵盖指定量± 20%、± 10%、± 5%、± 1%、± 0.5%或甚至 ± 0.1%的变动。
[0056] 还如本文使用的，"和/或"指且涵盖相关列出项中的一种或多种的任何和所有可 能组合，W及当W替代("或"）解释时的组合缺乏。
[0057] 除非上下文另有说明，特别预期本文描述的本发明的各种特点可任何组合使 用。
[005引此外，本发明还考虑了在本发明的一些实施方案中，可W排除或省略本文阐述的 任何特点或特点组合。
[0059] 为了进一步举例说明，如果例如说明书指示特定氨基酸可W选自A、G、I、L和/或 V，则该措辞还指示氨基酸可W选自运些氨基酸的任何子集，例如A、G、I或L;A、G、I或V;A或G;仅L;等，如同每种此类子组合在本文中明确阐述一样。此外，此类措辞还指示指定氨 基酸中的一个或多个可W被放弃。例如，在特定实施方案中，氨基酸不是A、G或I;不是A; 不是G或V;等，如同每种此类可能弃权者在本文中明确阐述一样。
[0060] 如本文使用的，术语"降低（reduce)"、"降低（reduces)"、"降低（reduction)"和 相似术语意指至少约 5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99〇/〇、 100%或更多的减少。
[0061] 如本文使用的，术语"增强（enhance)"、"增强（enhances)"、"增强 (enhancement)"和相似术语指示至少约 10%、20%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300〇/〇、 400%、500%或更多的增加。
[0062] 如本文使用的，术语"多肤"涵盖肤和蛋白质两者，除非另有说明。
[0063] "多核巧酸"是核巧酸碱基的序列，并且可W是RNA、DNA或DNA-RNA杂合序列(包括 天然存在和非天然存在的核巧酸两者)，但在代表性实施方案中，是单链或双链DNA序列。
[0064] 如本文使用的，"经分离的"多核巧酸(例如"经分离的DNA"或"经分离的RNA")意 指至少部分与天然存在的生物或病毒的至少一些其他组分，例如通常发现与多核巧酸结合 的细胞或病毒结构组分或者其他多肤或核酸分开的多核巧酸。在代表性实施方案中，与原 材料相比较，"经分离的"核巧酸富集至少约10倍、100倍、1000倍、10, 000倍或更多倍。
[0065] 同样地，"经分离的"多肤意指至少部分与天然存在的生物或病毒的至少一些其他 组分，例如通常发现与多肤结合的细胞或病毒结构组分或者其他多肤或核酸分开的多肤。 在代表性实施方案中，与原材料相比较，"经分离的"多肤富集至少约10倍、100倍、1000倍、 10, 000倍或更多倍。
[0066] 如本文使用的，"分离"或"纯化"（或语法等价物）病毒载体意指病毒载体至少部 分与原材料中的至少一些其他组分分开。在代表性实施方案中，与原材料相比较，"经分离 的"或"纯化的"病毒载体富集至少约10倍、100倍、1000倍、10, 000倍或更多倍。
[0067] "治疗多肤"是可W减轻、降低、预防、延迟和/或稳定症状的多肤，所述症状产生于 蛋白质在细胞或主体中的不存在或缺陷，和/或是W其他方式对主体赋予利益，例如抗癌 效应或移植存活性中的改善的多肤。
[0068] 术语"治疗（treat)"、"治疗（treating)"或"……的治疗"（及其语法变化）意指 主体状况的严重性降低，至少部分改善或稳定，和/或实现至少一种临床症状中的一定减 轻、缓和、减少或稳定，和/或在疾病或病症的进展中存在延迟。
[0069] 术语"预防（prevent)"、"预防（preventing)"和"预防（prevention)"(及其语法 变化）指相对于在不存在本发明的方法的情况下出现的那种，主体中的疾病、病症和/或临 床症状的发作预防和/或延迟，和/或疾病、病症和/或临床症状的发作严重性中的降低。 预防可W是完全的，例如疾病、病症和/或临床症状的完全不存在。预防还可W是部分的， 使得主体中的疾病、病症和/或临床症状的出现和/或发作的严重性小于在不存在本发明 的情况下出现的那种。
[0070] 如本文使用的，"治疗有效"或"有效"量是足W对主体提供一定改善或利益的量。 或者说，"治疗有效"或"有效"量是提供主体中的至少一种临床症状中的一定减轻、缓和、减 少或稳定的量。本领域技术人员应当理解疗效无需是完全或治愈的，只要对主体提供一定 利益。
[0071] 如本文使用的，"预防有效"量是相对于在不存在本发明的方法的情况下出现的那 种，足W预防和/或延迟主体中的疾病、病症和/或临床症状的发作，和/或降低和/或延 迟疾病、病症和/或临床症状的发作严重性的量。本领域技术人员应当理解预防水平无需 是完全的，只要对主体提供一定利益。
[0072] 术语"异源核巧酸序列"和"异源核酸"在本文中可互换使用，并且指在病毒中并 非天然存在的序列。一般地，异源核酸包含编码目的多肤或非翻译RNA(例如用于递送至细 胞或主体）的开放读码框。
[0073] 如本文使用的，术语"病毒载体"、"载体"或"基因递送载体"指病毒(例如AAV) 颗粒，其充当核酸递送媒介物，并且包含在病毒粒子内包装的载体基因组(例如病毒DNA [vDNA])。可替代地，在一些背景下，术语"载体"可W用于指单独的载体基因组/vDNA。
[0074] 本发明的病毒载体可W进一步是"祀向"病毒载体(例如具有指定向性）和/或 "杂合"细小病毒（即，其中病毒TR和病毒衣壳来自不同细小病毒)，如国际专利公开W0 00/28004和Chao等人（2000)必〇知細知r巧era獻2:619中描述的。
[0075] 本发明的病毒载体可W进一步是双链体细小病毒颗粒，如国际专利公开W0 01/92551 (其公开内容通过引用全文并入本文)中所述。因此，在一些实施方案中，双链(双 链体）基因组可W包装到本发明的病毒衣壳内。
[0076]牛产病毒裁体的方法 本发明还涵盖了包含本发明的经修饰的衣壳蛋白和衣壳的病毒载体。在特定实施方 案中，病毒载体是细小病毒载体(例如包含细小病毒衣壳和/或载体基因组)，例如AAV载体 (例如包含AAV衣壳和/或载体基因组)。在代表性实施方案中，病毒载体包含包含本发明 的经修饰的衣壳亚基经修饰的AAV衣壳和载体基因组。
[0077] 例如，在代表性实施方案中，病毒载体包含：（a)包含本发明的经修饰的衣壳蛋白 的经修饰的病毒衣壳(例如经修饰的AAV衣壳)；（b)包含末端重复序列(例如AAVTR)的核 酸，其中包含末端重复序列的所述核酸由经修饰的病毒衣壳壳体化。核酸可W任选包含两 个末端重复(例如两个AAVTR)。
[0078] 在代表性实施方案中，病毒载体是包含编码目的多肤或功能RNA的异源核酸的重 组病毒载体。重组病毒载体在下文更详细地描述。
[0079] 在特定实施方案中，与通过不含经修饰的衣壳蛋白的病毒载体的转导水平相比 较，本发明的病毒载体具有降低的肝转导。在特定实施方案中，病毒载体具有朝向肌肉的全 身转导，例如载体转导遍及全身的多重骨骼肌群，并且任选转导屯、肌和/或隔肌。
[0080] 本领域技术人员应当理解本发明的经修饰的衣壳蛋白、病毒衣壳和病毒载体排除 在其天然状态下在指定位置处具有指示氨基酸的那些衣壳蛋白、衣壳和病毒载体（即，不是 突变体)。
[0081] 本发明进一步提供了产生本发明的病毒载体的方法。在一个代表性实施方案中， 本发明提供了生产病毒载体的方法，该方法包括对细胞提供：（a)包含至少一个TR序列(例 如AAVTR序列）的核酸模板，和（b)对于核酸模板复制和包入AAV衣壳内足够的AAV序列 (例如编码本发明的AAV衣壳的AAVre/脖列和AAVca/脖列)。任选地，核酸模板进一步 包含至少一种异源核酸序列。在特定实施方案中，核酸模板包含两个AAVITR序列，其位于 异源核酸序列(例如果存在的话）的5'和3'，尽管它们无需与之直接邻接。
[0082] 核酸模板W及AAV 心/脖列在运样的条件下提供，使得在细胞中产生包含 在AAV衣壳内包装的核酸模板的病毒载体。该方法可W进一步包括从细胞中收集病毒载体 的步骤。病毒载体可W从培养基中和/或通过使细胞裂解进行收集。
[0083] 细胞可W是对于AAV病毒复制许可的细胞。可W采用本领域已知的任何合适的细 胞。在特定实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。作为另一个选项，细胞可W是反式补充包装 细胞系（trans-complementingpackagingcellline),其提供从