(ProteinDat油ank)(分别为PDB登录# 1LP3和3UX1)3°'3i。使用SWISS-M孤化蛋白质结 构建模服务器化ttp://swissmodel.expasy.org/) 32,用AAV2VP3的晶体结构作为模板生 成 2G9VP3 单体的同源性模型。使用VIP邸db-VirusParticleExploreR233中的Oligomer Generator实用程序产生完整的2G9衣壳的S维二十面体模型。类似地，使用Oligomer Generator实用程序产生AAV2VP3S聚体、2G9S聚体和AAV9S聚体的举例说明。所有结 构模型均使用PyMOL显现，其中形成半乳糖结合位点（AAV9VP1编号：D271、N272、Y446、 M70、A472、V473、W503y3和硫酸类肝素结合位点（AAV2VPl编号：R487、K527、K532、R585、 R588)的残基1°I2'34分别W澄色和紫色突出显示。不同单体W淡绿色、浅蓝色和浅粉色着 色。
[01W] 双重聚糖结合AAV毒株的生成。辅助质粒pXRl、2、6、8和9得自UNC载体核屯、。 通过将AAV9衣壳蛋白亚基上直接设及或侧接Gal识别位点的氨基酸残基取代到AAV2的 衣壳亚基上的相应残基（AAV2VP1 编号：A266S、Q464V、A467P、D469N、I470M、R471A、 D472V、S474G、Y500F、S501A)上，生成原型PXR2G9嵌合质粒构建体。使用下述引物（IDT)， 使用如化化ange?Li曲tning定点诱变试剂盒（Agilent)生成取代：5' -GGAACCACCA CGCAGTCAAGGCTTCAGTTTTCTGTGGCCGGACCCAGTAACATGGCTGTCCAGGGAAGGAACTGGCTTCCT GGACCCTGTTACCGC-3，和 5, -GACATCTGCGGATAACAACAACAGTGAATTTGCTTGGACTG GAGCTACCAAGTACCACCT-3'。包装CBA-Luc转基因盒的重组AAV载体如先前描述的生成14。 病毒滴度通过定量PCR获得。
[0192] 体外结合、转导和竞争抑制测定。CH0Lec2细胞在aMEM(ThermoScientific) 中进行培养，所述〇161补充有10%胎牛血清（邱5)、100 11/1111青霉素化611肖'〇)、100嗦/1111 链霉素（Cellgro)和2. 5嗦/ml两性霉素B(Sigma)。细胞WlxlO5细胞/孔的密度种植 到24孔板中。对于竞争抑制测定，细胞在4°C下预冷30分钟，并且与100帖/ml門TC-标 记的鸡冠刺桐（位T化rinaCri別3洗心_/)凝集素（FnC-E化，VectorL油S)-起在aMEM中 在4°C下溫育1小时。可替代地，不同的病毒衣壳与100嗦/ml可溶性肝素（Sigma)或IxPBS (对照)一起在室溫下溫育1小时。随后用服结合或模拟处理的AAV2、AAV2G9或AAV9衣壳 (其包装CBA-Luc转基因盒)，W1000个载体基因组（vg)拷贝/细胞的M0I，感染模拟处理 或FITC-E化处理的细胞。在冷室中溫育1小时后，通过用冰冷的IxPBS的S次洗涂去除未 结合的病毒粒子。对于细胞表面结合测定，通过使用定量PCR定量每个孔中的载体基因组 拷贝数/细胞，来测量结合的病毒粒子数目。对于转导测定，将受感染的Lec2细胞移动至 37°C，并且在定量来自细胞裂解产物的蛋光素酶转基因表达之前溫育24小时。
[0193] 对于用亲本AAV2或AAV9衣壳的竞争抑制，利用包装CBA启动子驱动的tdTomato 转基因盒的载体。简言之，将Lec2细胞WIxlO5细胞/孔的密度种植到24孔板中过夜。 在4 °C下预冷30分钟后，使Lec2细胞与AAV2-tdTomato或AAV9-tdTomato载体在4°C 下预溫育另外30分钟，其感染复数(M0I)范围为500 - 100,000vg/细胞。细胞随后用 AAV2G9-CBA-LUCW1000vg/细胞的M0I在4°C下重叠感染45分钟，随后使用冰冷的PBS 去除未结合的病毒粒子。随后在蛋光素酶表达分析之前，使受感染的细胞在37°C下溫育24 小时。对照包括AAV2-CBA-LUC或AAV9-CBA-LUC载体。
[0194] 在体内的转基因表达的动力学。雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）购自化ckson L油oratories,并且在UNC化apel化11使用IACUC批准的方案，依照NIH指导进行处理。 将包装CBA-Luc盒的不同AAV载体W1x10"vg/小鼠的剂量静脉内注射到尾静脉内。在施 用后的所示时间间隔时（3、7和18天)，小鼠用蛋光素（120mg/kg;Nanoli曲t)进行腹膜内 注射，并且使用XenogenIVIS?Lumina系统（CaliperLifesciences)获得生物发光图像。 使用WAVEMETRICS?软件，进行来自肝和整个动物图像的光输出的定量。在不同的两组小鼠 中进行在不同组织中的蛋光素酶转基因表达和载体基因组生物分布的进一步定量，所述不 同的两组小鼠在载体施用后第3和18天时处死。如较早描述的，在不同组织裂解产物中监 控蛋光素酶转基因表达。通过使用DNeasy?Kit(Qiagen)，首先从组织裂解产物中提取基 因组DNA，来测定载体基因组生物分布。使用qPCR测定蛋光素酶转基因拷贝数，并且针对小 鼠核纤层蛋白基因的拷贝数标准化，W测定每种组织中的vg/细胞。特异性引物组分别为 5'-AGGGCACCTCCATCTCGGAAAC-3' / 5'-GGACCCAAGGACTACCTCAAGGG-3'（用于小鼠核 纤层蛋白）和 5'-AAAAGCACTCTGATTGACAAATAC-3' / 5'-CCTTCGCTTCAAAAAATGGAAC-3， (用于CBA-Luc)。
[0195] 统计分析。所有数据均表示为平均值±平均值标准误，并且每次实验的重复数目 在相应的图例中提供。使用不成对单向斯氏^#验测定统计学显著性，并且对于不同实验， 小于0. 05的P值视为统计学显著的，除非另有说明。
[0196] 结果 为了探究AAV9的Gal足迹"移植"到几种AAV毒株内的可行性，我们首先在与AAV9的 那种的比对中，比较AAV血清型1、2、6和8的VP3亚基S聚体的S维结构（图1)。通过多轮 定点诱变修饰在模板衣壳上的氨基酸残基，其与直接设及结合或紧侧接Gal受体足迹的相 应AAV9VP3残基重叠。使用先前确定的方案M，生成的所有嵌合AAV毒株均制备为重组载 体，其包装鸡P-肌动蛋白启动子驱动的蛋火虫蛋光素酶（CBA-Luc)报道转基因盒。设及 Gal识别的氨基酸残基和来自AAV9的其他侧接残基在不同AAV血清型衣壳上是显著良好 耐受的，因为运些AAV嵌合体的包装效率可与亲本株相比较。获得基于AAV血清型1、2、6、 8和先前改造的AAV2i8突变体15的多重AAV嵌合体(滴度范围为5X10 11至5X10 12病毒基 因组拷贝/mL)，并且进行观察W采用Gal作为在体外转导CH0Lec2细胞中的新型主要受体 (图2)。我们随后进行原型双重聚糖结合AAV嵌合体的详细表征，所述双重聚糖结合AAV嵌 合体称之为AAV2G9 (其中G代表Gal足迹，并且编号分别鉴定接受者和供体衣壳血清型)。
[0197] 使用SwissModel?,通过同源性建模生成合成改造的AAV2G9的S维模型（图3A中 的完全衣壳和图3D中的VP3S聚体)，其中突出显示假定的双重聚糖受体结合位点（服和 Gal)。AAV2G9完全衣壳的分子模型证实位于二十面体衣壳上的S重对称轴周围的服和Gal 结合位点的几何分布和正交性。来自S重轴的HS和Gal受体足迹的特写视图进一步支持 下述观察：将正交Gal结合位点移植到AAV2衣壳的骨架上就衣壳装配而言可W是耐受的。 还显示了AAV2VP3亚基S聚体的S维结构，其具有设及服识别的带正电残基的侧链（图 3A)，W及包含在AAV9VP3亚基S聚体上的Gal识别位点的氨基酸残基的侧链（图3C)。
[0198]AAV2G9在体外可互换地利用服和Gal受体。支持双重聚糖受体由AAV2G9使用的 第一线证据得自在细胞表面上的病毒结合的竞争抑制测定，其设及可溶性肝素和鸡冠刺桐 凝集素（E化)，所述E化选择性结合末端半乳糖基化的聚糖。如图4A-B中可见的，HS而不 是E化显著抑制CH0Lec2细胞中的AAV2转导(深灰色条)，而E化将AAV9转导选择性阻断 将近两个对数单位（白色条)。运些结果与对于AAV2和AAV9预期的转导概况一致ISIS。相 比之下，AAV2G9仅能够通过用E化和服两者的组合的预处理得到有效中和（浅灰色条，图 4C)。对于E化观察到小但显著的抑制效应。
[0199] 使用E化或服通过抑制每种毒株的细胞表面结合，进一步确证AAV2和AAV9的 转导概况（图4D-E)。通过经由E化和服的组合专一地，而不是单独的任一试剂竞争抑制 AAV2G9的细胞表面附着，进一步支持嵌合AAV毒株的独特细胞表面附着（图4F)。另外，使 用针对不同AAV衣壳的单克隆抗体获得的共聚集免疫巧光显微照片（图5)，提示AAV2G9比 AAV2或AAV9更强地与CH0Lec2细胞的表面结合。基于AAV2G9可互换地结合两种不同聚 糖的明显能力，可W预期此类情况。
[0200] 为了进一步查询通过AAV2G9的替代转导途径的利用，我们用亲本血清型AAV2和 AAV9进行竞争测定。如图6A-B中所示，分别如通过蛋光素酶转基因表达测量的，W范围为 500 - 100,000vg/细胞的M0I与AAV2-CBA-tdTom或AAV9-CBA-tdTom竞争载体的预溫育 有效阻断通过AAV2-CBA-LUC或AAV9-CBA-LUC的转导。然而，在10倍过量的感染复数（M0I) 时，AAV2和AAV9两者均不能有效阻断AAV2G9转导。在更高的M0K100倍过量)时，AAV2看 起来在中和AAV2G9转导方面比AAV9竞争效力更低。总之，运些结果支持下述观念：AAV2G9 事实上是新型、双重聚糖结合毒株，具有利用HS和Gal两者作为转导的主要受体的独特能 力。
[0201]AAV2G9介导转基因表达的快速发作。我们随后调查双重聚糖结合是否对在体外和 体内的病毒转导赋予特异性优点。监控CK)Lec2细胞中的蛋光素酶报道分子表达的时间 过程掲示：AAV2G9介导在体外的快速发作和改善的基因转移（图7)。随后进行活动物成像 研究，W监控在BALB/c小鼠中全身施用不同AAV毒株后的蛋光素酶转基因表达（图8A)。在 注射后第3、7和18天时获得的生物发光图像W及在肝和整个动物内的光输出的定量评价 与体外数据关联，并且支持AAV2G9可W介导快速发作和增强的基因表达的观念（图8B-C)。 有趣的是，由AAV2G9展示的动力学概况反映AAV9而不是AAV2的那种。相比之下，AAV2G9 的转导概况/组织向性看起来主要是亲肝的，类似于AAV2,并且不像如先前确定的由AAV9 展示的全身向性4'19 21。因此，双重聚糖受体衔接看起来改善AAV毒株的转导效率，但不改 变组织向性。
[0202] AAV2G9载体在体内的转导和生物分布概况。为了进一步评估AAV2G9的体内转导 和生物分布概况，在施用后第3和18天时，进行来自BALB/c小鼠的组织裂解产物的定量分 析。具体地，在施用后3天时，与AAV2 (将近两个对数单位)和AAV9 (~1个对数单位)相比 较，AAV2G9展示在肝中显著更高的蛋光素酶转基因表达（图9A)。虽然AAV9展示在屯、脏中 比AAV2G9高多于10倍的转导效率，但还观察到与AAV2相比较，通过AAV2G9在屯、脏转导中 的适度增加。在第18天时，从用AAV2G9处理的小鼠中收获的屯、脏和肝组织继续证实更高 的转基因表达，尽管AAV9作为该阶段时的最有效毒株出现。具体地，通过AAV2、AAV2G9和 AAV9在屯、脏组织中的转导效率维持与施用后3天观察到的相似的趋势。在肝中，在进展至 注射后18天后，通过AAV2、AAV2G9和AAV9在蛋光素酶转基因表达之间的差异缩小。具体 地，当分别与AAV2G9和AAV2相比较时，AAV9证实高5至10倍的转基因表达。
[0203] 在施用后3天时通过AAV2G9和亲本AAV毒株在肝和屯、脏中的载体基因组拷贝数 的定量分析（图9B)与对于图5A中所示的转导效率观察到的趋势一致。具体地，AAV2G9在 屯、脏组织中累积至与AAV2相比较更高的程度，但仍比AAV9低~2对数单位。在肝中，AAV2G9 拷贝数可与AAV9的那种相比较，但比AAV2高超过一个对数单位。在第18天时，所有血清 型的拷贝数均减少，可能是由于继续的细胞更新和单链AAV基因组的降解，如先前报道的 22,23 〇
[0204] 图10显示了包装CBA-蛋光素酶转基因盒的AAV2i8、2i8G9和AAV9载体的体内转 基因表达动力学。BALB/c小鼠（n=4)通过尾静脉W1x10"vg/动物的剂量施用AAV载体， 并且使用Xenogen?Lumina成像系统，在注射后3、7和18天时收集生物发光图像。用在彩 虹色标上表示的生物发光显示了代表性活动物图像（1〇 5-1〇6光子/秒/cm^球面度)。
[020引图11显示了在新生小鼠中的代表性AAVG9毒株的中枢神经系统（CNS)向性概况。 使用含有由杂合鸡P肌动蛋白（CBh)启动子驱动的GFP转基因的3. 5xl0e9AAV载体基因 组，将出生后0 (P0)幼盧（n=3)单侧注射到左侧脑室内。在注射后2周时，GFP免疫组织化 学掲示在鼠脑内，关于每种AAV"G9"毒株的差异传播、区域和细胞向性。
[0206] 前述是本发明的举例说明，并且不应解释为其限制。
[0207] 表1. AAV基因组
[020引表2.示例性AAV基因组和衣壳登录号。
*不完全序列D
[0209]表3.将AAV9的Gal结合足迹移植到不同AAV毒株内的氨基酸位置突变
[0210] 参考文献
【主权项】
1. 一种腺伴随病毒（AAV)衣壳蛋白，其包含一个或多个氨基酸取代，其中所述取代将 新的聚糖结合位点引入所述AAV衣壳蛋白内。2. 权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述氨基酸取代在AAV2中的氨基酸266、氨基酸 463-475 和氨基酸 499-502 中，或者 AAVl、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 或 AAVlO 中 的相应氨基酸位置中。3. 权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述新的聚糖结合位点是己糖结合位点，其中所述 己糖是半乳糖（Gal)、甘露糖（Man)、葡萄糖（Glu)或岩藻糖（fuc)。4. 权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述新的聚糖结合位点是唾液酸（Sia)结合位点， 其中所述Sia残基是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac)或N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc) 〇5. 权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述新的聚糖结合位点是二糖结合位点，其中所述 二糖是以形式Sia ( a 2, 3) Gal或Sia ( a 2, 6) Gal与半乳糖连接的唾液酸。6. 权利要求2的AAV衣壳蛋白，其中所述新的聚糖结合位点是半乳糖结合位点。7. 权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述取代将来自第一 AAV血清型的新的聚糖结合 位点引入第二AAV血清型的衣壳蛋白内，所述第二AAV血清型不同于所述第一 AAV血清型。8. 权利要求7的AAV衣壳蛋白，其中所述第二AAV血清型的血清型是AAV血清型1 (八八￥1)、44￥血清型2 944￥2)、44￥血清型33(44￥33)、44￥血清型313(44￥313)、44￥血清型 4 (AAV4)、AAV 血清型 5 (AAV5)、AAV 血清型 6 (AAV6)、AAV 血清型 7 (AAV7)、AAV 血清型 8 (AAV8)、或 AAV 血清型 10 (AAV10)。9. 权利要求7的AAV衣壳蛋白，其中所述新的聚糖结合位点是来自AAV血清型9(AAV9) 的半乳糖结合位点。10. 权利要求2的AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白来自AAV2,并且 a) 在氨基酸266处的所述取代是A266S ; b) 在氨基酸 463-475 处的所述取代是 SQAGAsDlRDQsiMes-ATSSX1AGX2SX3X 4X5X6QX7R，其 中X1^可以是任何氨基酸；和 c )在氨基酸499-502处的所述取代是EYSW499-502EXsXsW，其中X8 9可以是任何氨基酸。11. 权利要求10的AAV衣壳蛋白，其中31是￥32是？ ；X3_6是NMAV ;并且乂7是6。12. 权利要求10的AAV衣壳蛋白，X 8是F，并且X 9是W。13. -种AAV衣壳，其包含权利要求1-12中任一项的AAV衣壳蛋白。14. 一种病毒载体，其包含： (a) 权利要求13的AAV衣壳；和 (b) 包含至少一个末端重复序列的核酸， 其中所述核酸由AAV衣壳壳体化。15. -种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的权利要求1-12中任一项的AAV衣 壳蛋白、权利要求13的AAV衣壳或权利要求14的病毒载体。16. -种将核酸引入细胞内的方法，其包括使细胞与权利要求14的病毒载体接触。17. 权利要求16的方法，其中所述细胞在主体中。18. 权利要求17的方法，其中所述主体是人主体。
【专利摘要】本发明提供了包含腺伴随病毒（AAV）衣壳蛋白的方法和组合物，所述AAV衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中所述取代将新的聚糖结合位点引入AAV衣壳蛋白内。
【IPC分类】C07K14/075, C12N5/10, A61K48/00
【公开号】CN105163764
【申请号】CN201480025514
【发明人】A.阿索肯, R.萨穆尔斯基
【申请人】北卡罗来纳-查佩尔山大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2904396A1, WO2014144229A1