用于产生和使用构象-特异性抗体的方法和组合物的制作方法

用于产生和使用构象-特异性抗体的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于产生和使用构象-特异性抗体的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/792,588的申请日的权 益，将其全部内容通过引用结合在此。
[0003] 关于联邦资助研究的声明
[0004] 本发明是通过政府支持在以下基金号下进行的：R01AG039405、R01CA167677、以及 R01CA122434。美国政府享有本发明中的某些权利。
[0005] 发明背景
[0006] 总体而言，本发明涉及用于产生和使用构象-特异性抗体或其片段的多种方法和 组合物。
[0007] 蛋白质磷酸化作用是关键性细胞信号传导机制，其诱导蛋白质构象变化。例如，紧 挨着在脯氨酸残基之前的特定丝氨酸或苏氨酸残基（Ser/Thr-Pro基序）的磷酸化是细胞 中的中心调节机制。脯氨酸残基的独特立体化学意味着Ser/Thr-Pro基序的肽基-脯氨酰 基键可以采用两种不同构象状态（即，一种顺式构象或一种反式构象）。肽基脯氨酰基顺式 /反式异构酶（PPI酶）特异性地催化Ser/Thr-Pro基序的顺式/反式异构化，并且因此调 节这些蛋白质在两个不同的构象之间的结构。
[0008] Pinl是特异性催化某些磷酸化的Ser/Thr-Pro (pSer/Thr-Pro)基序的顺式/反式 异构化的PPI酶。Pinl鉴定为磷酸化-特异性PPI酶导致一种新的信号传导机制的理解， 藉此Pinl在它们的磷酸化后催化地调节其底物的构象以进一步控制蛋白质功能。此外， Pinl由多种机制紧密调节，并且Pinl失调在一些人类疾病中起关键作用。
[0009] 阿尔茨海默病（AD)的患病率到2050在全世界范围内可能翻两番，但目前尚没有 有效的治疗。脑中的AD标志损伤是由Αβ肽和磷酸化τ (ρ-τ)的神经原纤维缠结组成的 衰老斑。τ-相关病理学（τ蛋白病变（tauopathy))与AD中神经元和记忆的进行性损失 相关并且也是无 Αβ病理学的许多其他τ蛋白病变的一种限定特征。虽然针对Αβ肽的主 动和被动免疫已经达到临床试验，对抗P-τ的免疫疗法远远落在后面。最新发现，针对包 含缠结的P-τ表位的主动或被动免疫减少τ聚集体并且在小鼠模型中改善了记忆缺陷， 并且τ蛋白病变可在神经元之间扩散疾病，表明P-τ免疫疗法是一种有前途的治疗AD的 新方法。然而，因为神经元功能障碍发生在缠结形成之前很久，一个主要挑战是仅仅靶向早 期致病性事件（这些事件导致AD中的τ蛋白病变和记忆丧失）的免疫疗法的开发。
[0010] AD的τ蛋白病变中非常早期的事件是尤其对Ser/Thr-Pro基序的τ过度磷酸 化，这导致微管破坏和神经毒性。已经发现，τ(ρΤ231-τ)中磷酸化的Thr231-Pr 〇-基序 存在于顺式和反式两种不同构象中，并且脯氨酰异构酶Pinl加速其转化以抑制τ蛋白病 变。Pinl-无效（null)小鼠展示年龄依赖性τ蛋白病变，而Pinl过表达抑制AD小鼠模型 中的τ蛋白病变。在人类MCI以及AD神经元中，Pinl由多种机制抑制，而预防其下调的 PinlSNP与延迟的AD发作相关联。还已经发现，位于19ρ13. 2处的人Pinl与晚发性AD相 关联，ρΤ231_τ在预缠结神经元中位于顺序ρ-τ表位的开始处，并且CSF ρΤ231_τ是一 种早期生物标记，它与记忆丧失相关并且追踪MCI转化为AD，并且将AD与额颞痴呆（FTD) 相区分。因此，PT231- τ在AD中是非常早期的疾病-起始事件。
[0011]自战争归来的老兵经历与众不同的创伤性脑损伤（TBI)，其特征与先前报道的在 患有持续多发性脑震荡的运动员中的神经退行性疾病相同。显现出在这些人中的TBI可以 触发慢性创伤性脑病（CTE)的发展，这是一种破坏性神经退行性障碍，对此没有已知的治 疗。CTE的神经病理学标志是过度磷酸化的τ (ρ-τ)广泛地异常积累为神经原纤维缠结 (τ蛋白病变），类似于在阿尔茨海默病（AD)和其他τ蛋白病变中所见的标志性损伤。因 此，针对ρ-τ的免疫疗法被证明是用于治疗τ蛋白病变的新选择。更确切地说，在本领域 存在着对构象特异性抗体的需求，这些抗体特异性地结合至P- τ的一种顺式或反式构象 上以靶向导致τ蛋白病变的早期致病性预缠结τ修饰。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明的特征在于一种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一种抗体或一种 单克隆抗体，其中该结合部分包括一个或多个具有SEQ ID NO :1-3的重链可变区、或其变体 以及一个或多个具有SEQ ID NO :4-6的轻链可变区、或其变体。在一个实施例中，该分离的 结合部分包括两个或更多个具有SEQ ID NO :1-3的重链可变区、或其变体以及两个或更多 个具有SEQ ID NO :4-6的轻链可变区、或其变体。在一个第二实施例中，该分离的结合部分 包括具有SEQ ID NO :1-3的重链可变区、或其变体以及具有SEQ ID NO :4-6的轻链可变区、 或其变体。在一个第三实施例中，该分离的单克隆抗体包括一个具有SEQ ID NO :22的重链 蛋白序列以及一个具有SEQ ID NO :23的轻链蛋白序列。
[0014] 本发明的特征还在于一种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一种抗体或一 种单克隆抗体，其中该结合部分包括一个或多个具有SEQ ID NO :7-9的重链可变区、或其变 体以及一个或多个具有SEQ ID NO :10-12的轻链可变区、或其变体。在一个实施例中，该分 离的结合部分包括两个或更多个具有SEQ ID NO :7-9的重链可变区、或其变体以及两个或 更多个具有SEQ ID NO :10-12的轻链可变区、或其变体。在一个第二实施例中，该分离的结 合部分包括具有SEQ ID NO :7-9的重链可变区、或其变体以及具有SEQ ID NO :10-12的轻 链可变区、或其变体。在一个第三实施例中，该分离的单克隆抗体包括一个具有SEQ ID NO: 24的重链蛋白序列以及一个具有SEQ ID NO :25的轻链蛋白序列。
[0015] 在本发明的一个方面，上述分离的结合部分特异性地结合到磷酸化-苏氨酸 231-τ蛋白（ρΤ231_τ)的顺式构象上。在本发明的另一个方面，上述分离的单克隆抗体是 单链抗体或其抗体片段。在又另一个方面，该分离的单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体、 或人抗体。在本发明的所有方面，将该分离的结合部分配制成药物组合物，该药物组合物包 括一种药学上可接受的载体。
[0016] 在另一个方面，本发明的特征还在于一种用于治疗τ蛋白病变、外伤性脑损伤 (ΤΒΙ)、或中风的方法，该方法包括将上述结合部分以足以治疗该τ蛋白病变、ΤΒΙ、或中风 的量给予至对其有需要的一位受试者，其中该单克隆抗体特异性地结合至ρΤ231_τ的顺 式构象上。
[0017] 本发明的特征进一步在于一种用于在用在此所述的结合部分治疗的受试者中监 测治疗反应的方法，该方法包括：a.)确定从该受试者获得的样品中的顺式ρΤ231_τ或顺 式：反式ρΤ231_τ比率的水平，以及任选地b.)确定CSF t-τ、ρΤ181-τ、Αβ42、或ΑροΕ4 的水平，其中顺式ρΤ231_τ或顺式：反式ρΤ231_τ比率的水平的降低导致对该结合部分的 有效治疗反应，和/或其中CSF t-τ、ρΤ181_τ、Αβ42、或ApoE4的水平降低。
[0018] 本发明的特征还在于一种诊断受试者患有τ蛋白病变或具有τ蛋白病变的倾 向的方法，该方法包括：a.)确定从该受试者获得的样品中顺式ρΤ231_τ或顺式：反式 ρΤ231- τ比率的水平，b.)将该样品中顺式ρΤ231- τ或顺式：反式ρΤ231- τ比率的水平与 正常参比样品进行比较，其中与该正常参比样品相比顺式ρΤ231_τ的升高的水平或顺式： 反式ρΤ231_τ比率的增加导致诊断该受试者为患有τ蛋白病变，或具有τ蛋白病变的倾 向，并且以足以治疗该τ蛋白病变的量向该受试者给予本发明的结合部分，其中该结合部 分特异性地结合至顺式ρΤ231_τ上。
[0019] 在本发明的所有方面，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：进行性核 上性麻痹、慢性创伤性脑病（CTE)、额颞痴呆、额颞叶变性、帕金森氏病-痴呆-肌萎缩侧索 硬化复合征（Lytico-Bodig disease)、缠结主导型痴呆（tangle-predominant dementia)、 脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、皮克病、皮质基底节变性、和阿尔茨海默病。在某些方 面，该受试者有τ蛋白病变的倾向或是处于τ蛋白病变的一个早期阶段，其中该τ蛋白 病变的倾向或早期阶段是通过从该受试者获得的样品中顺式ΡΤ231- τ的升高的水平或顺 式：反式ρΤ231_τ的比率的增加确定的。在其他方面，τ蛋白病变的倾向或早期阶段也是 通过CSF卜1、奵181-1^|3 42、或4?(^4的水平确定的。在又另一个方面中，该受试者有 重复脑外伤病史的倾向。在本发明的所有方面，该样品选自下组，该组由以下各项组成：尿、 血液、血清、血浆、唾液、羊水、和脑脊液（CSF)。
[0020] 本发明的特征进一步在于一种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一种抗体 或一种单克隆抗体，其中该结合部分包括一个或多个具有SEQ ID NO :13-15的重链可变区、 或其变体以及一个或多个具有SEQ ID NO :16-18的轻链可变区、或其变体。在一个实施例 中，该分离的结合部分包括两个或更多个具有SEQ ID NO :13-15的重链可变区、或其变体以 及两个或更多个具有SEQ ID NO :16-18的轻链可变区、或其变体。在一个第二实施例中，该 分离的结合部分包括具有SEQ ID NO :13-15的重链可变区、或其变体以及具有SEQ ID NO: 16-18的轻链可变区、或其变体。在一个第三实施例中，该分离的单克隆抗体包括一个具有 SEQ ID NO :26的重链蛋白序列以及一个具有SEQ ID NO :27的轻链蛋白序列。
[0021] 本发明的特征还在于一种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一种抗体或一 种单克隆抗体，其中该结合部分包括一个或多个具有SEQ ID NO :19-21的轻链可变区、或其 变体。在一个实施例中，该分离的结合部分包括两个或更多个具有SEQ ID NO :19-21的轻 链可变区、或其变体。在一个第二实施例中，该分离的结合部分包括具有SEQ ID NO :19-21 的轻链可变区、或其变体。在一个第三实施例中，该分离的单克隆抗体包括一个具有SEQ ID NO :28的轻链蛋白质序列。
[0022] 在本发明的某一方面，上述分离的结合部分特异性地结合到ρΤ231- τ的反式构 象上。在另一个方面，该分离的单克隆抗体是单链抗体或其抗体片段。在又另一个方面，该 分离的单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在另一个方面，将上述结合部分配制 成包括一种药学上可接受的载体的药物组合物。
[0023] 最后，本发明的特征还在于一种试剂盒，用于诊断受试者为患有τ蛋白病变或具 有τ蛋白病变的倾向，该试剂盒包括：特异性地结合到 ΡΤ231_τ的顺式构象上的、在此所 述的结合部分，特异性地结合到ΡΤ231- τ的反式构象上的、在此所述的结合部分以及用于 使用这些结合部分来诊断该受试者患有τ蛋白病变或具有τ蛋白病变的倾向的说明书。
[0024] "佐剂"是指引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，佐剂用于增强 对一种或多种疫苗抗原或抗体的免疫应答。可以将佐剂在给予疫苗之前、与其组合、或之后 给予至受试者。用作佐剂的化学化合物的实例包括，但不局限于、铝化合物、油、嵌段聚合 物、免疫刺激复合物、维生素和矿物质（例如，维生素 Ε、维生素 Α、硒、以及维生素 Β12)、Qui 1 A(阜苷）、细菌和真菌细胞壁组分（例如，脂多糖（Iipopolysaccaride)、脂蛋白、以及糖蛋 白）、激素、细胞因子、和共刺激因子。
[0025] "足以...的量"是指当给予到一个患有一种障碍（例如，τ蛋白病变、外伤性脑 损伤（TBI)、中风、或其他神经障碍）的受试者时，足以引起与该障碍相关的症状的定性或 定量减少的量。
[0026] "抗体"是指单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性 抗体、以及抗体片段。该抗体可以是，例如，一种构象-特异性抗体（例如，一种抗体，该抗 体结合至Xaa-Pro基序的顺式或反式构象上，其中Xaa是一种氨基酸）。一种抗体特异性结 合到一种抗原。该抗体还可以是一种非免疫球蛋白结合多肽。
[0027] "抗原"是指抗体可以选择性地结合至其上的一个分子。靶抗原可以是一种蛋白 质（例如，一种抗原肽）、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原、或其他天然存在的或合成的化合 物。靶抗原可以是一种多肽（例如，一种包含Xaa-Pro基序（例如，磷酸化的或未磷酸化的 Ser/Thr-Pro基序）的多肽）或肽模拟物（例如，一种包含Xaa-高脯氨酸基序（例如，磷酸 化的或未磷酸化的Ser/Thr-高脯氨酸基序）的多肽）。还可以将一种抗原给予动物，以在 动物中产生一种免疫应答。
[0028] "结合亲和力"是指在一个分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶体（例 如，抗原或抗原肽）之间的总的非共价相互作用的强度。除非另外指明，否则如在此使用， "结合亲和力"是指反映在结合对的成员（例如，抗体和抗原）之间的特异性相互作用的固 有结合亲和力。分子X对于其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数（K d)表示。可以通 过本领域中已知的标准方法测量亲和力，包括在此描述的那些。低亲和力复合物含有一种 通常倾向于很容易地与抗原解离的抗体，而高-亲和力复合物含有一种通常倾向于保持结 合至抗原更长持续时间的抗体。
[0029] "结合部分"是指一种抗体（例如，一种多克隆抗体、一种单克隆抗体、一种人源化 抗体、一种嵌合抗体），一种人抗体，抗体片段，受体，配体，一种非免疫球蛋白结合多肽，或 与靶分子（例如，一种多肽、蛋白质（例如，顺式PT231-τ或反式ρΤ231-τ )，或包含其的辄 合物）或携带该靶分子（例如，一种细胞表面抗原，例如，一种受体或配体）的一种细胞或 组织特异性地结合的试剂的小分子部分。
[0030] "生物样品"或"样品"是指固体和流体样品。生物样品可以包括细胞、蛋白或细 胞膜提取物、血液或生物流体（包括，例如，腹水液或脑液（例如，脑脊液（CSF))。固体生 物样品的实例包括取自以下各项的样品：粪便、直肠、中枢神经系统、骨、乳腺组织、肾组织 (renal tissue)、子宫颈、子宫内膜、头部或颈部、胆囊、腮腺组织、前列腺、脑、脑垂体、肾脏 组织（kidney tissue)、肌肉，食道、胃、小肠、结肠、肝、脾、胰、甲状腺组织、心脏组织、肺组 织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、和胸腺。 生物流体样品的实例包括取自以下各项的样品：血液、血清、CSF、精液（serum)、前列腺流 体、精液（seminal fluid)、尿液、唾液、痰液、粘液、骨髓、淋巴液、和眼泪。样品可以通过标 准方法获得，包括，例如，静脉穿刺和手术活检。在某些实施例中，该生物样品是一种通过针 穿活检获得的乳腺、肺、结肠、或前列腺组织样品。
[0031] "构象-特异性抗体"是识别并且特异性地结合至其互补抗原的一种具体构象（例 如，一种构象同分异构体或构象异构体）的一种抗体或其片段。例如，如在此所描述，构象 特异性抗体可以特异性地结合至Xaa-Pro基序的顺式构象（例如，顺式ρΤ231- τ )，但不会 特异性地结合至Xaa-Pro基序的反式构象（例如，反式ρΤ231- τ )，其中Xaa是任何氨基酸 残基（例如，丝氨酸或苏氨酸）。在这种情况下，该构象-特异性抗体对Xaa-Pro基序的顺 式构象具有比对反式构象高例如至少10至100倍的亲和力。相反地，构象-特异性抗体可 以特异性地结合至Xaa-Pro基序的反式构象，但不会特异性地结合至Xaa-Pro基序的顺式 构象，其中Xaa是任的何氨基酸残基（例如，丝氨酸或苏氨酸）。在某些实施例中，该Ser/ Thr-Pro基序可以是磷酸化的（即，pSer/Thr-Pro)。
[0032] "障碍"是指可以根据在此描述的本发明的方法进行治疗、抑制、诊断、或者筛选的 任何病症。
[0033] "片段"是指一种核酸或多肽（例如，抗体）的一部分，包含该核酸或多肽的整个 长度的至少例如 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多。一个核 酸片段可以包含例如 10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、 800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、2500、3000、4000、4500、或 5000 个核苷 酸或更多个核苷酸，直到该核酸全长。一个多肽片段可以包含例如1〇、20、30、40、50、60、70、 80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、或500个氨基酸或更多个氨基酸，直到该多肽 全长。可用于本发明的治疗方法的片段包括，例如，保留生物活性的构象-特异性抗体的片 段（例如，结合至一种特异性构象状态的片段）。可以如在此所述的以及如本领域中已知的 对片段进行修饰。
[0034] "人源化抗体"是指一种能够结合至预定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列变体或其 片段。抗体可以含有两个轻链，连同该重链的至少可变结构域。抗体还可以包括重链的CHl、 铰合部、CH2、CH3、或CH4区。人源化抗体包含一个框架区（FR)和一个互补决定区（⑶R)， 该框架区基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列，该互补决定区基本上具有非人免疫球蛋 白的氨基酸序列。
[0035] 通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。总体而言，人 源化抗体可以包含至少一个、并且通常是两个可变结构域（例如，Fab、FaM、F(aM )2、 Fabc、或Fv)的基本上全部，其中CDR区的全部或基本上全部与非人免疫球蛋白的那些相 对应，并且FR区的全部或基本上全部与人免疫球蛋白共有序列的那些相对应。人源化抗 体可以包含典型地是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区（Fe)的至少一部分。"互补决定 区（CDR) "是指在免疫球蛋白轻链和重链每一者内的可变区中的三个高变序列。"框架区" 是指位于免疫球蛋白轻链和重链的三个高变序列的任一侧上的氨基酸序列。参见，例如， 琼斯（Jones)等人，自然（Nature) 321 :522-525(1986);理查曼（Riechmann)等人，自然 (Nature) 332 :323-329 (1988);和普雷斯塔（Presta)，结构生物学新见（(：11^0?.5廿11(^· Biol.) 2 :593-596 (1992)，以及美国专利号4, 816, 567和5, 530, 101，将它们通过引用结合 在此。
[0036] 如本文使用的，术语"单克隆抗体"指从基本上均质抗体群体中获得的抗体（即构 成群体的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变）。单克隆抗体是 高度特异性的，其针对单个抗原性位点。此外，与常规（例如多克隆）抗体制剂（其典型 地包括针对不同决定簇（例如，表位）的不同抗体）不同，每种单克隆抗体针对抗原上的 单个决定簇。修饰语"单克隆"指示获得自基本上均质的抗体群体的抗体的特征，并且不应 理解为要求通过任何具体方法产生抗体。例如，根据本发明所用的单克隆抗体可通过科勒 (Kohler)等人（参见，例如，自然（Nature) 256 :495,1975)首次描述的杂交瘤方法或可以 通过重组DNA方法（参见，例如美国专利号4, 816, 567)制备。还可以使用例如，在克拉克 森（Clackson)等人（自然（Nature) 352 :624_628,1991)和马克思（Marks)等人（分子生 物学杂志（J. Mol. Biol.) 222 :581-597,1991)中描述的技术自噬菌体抗体文库分离单克隆 抗体。
[0037] "神经障碍"是指由发育异常、障碍、损伤、或毒素导致的神经系统的结构或功能的 紊乱。示例性的神经障碍包括阿尔茨海默病（AD)、轻度认知缺损（MCI)、帕金森氏病（PD)、 多发性硬化症（MS)、肌肉营养不良、皮质基底节变性、拳击员痴呆、唐氏综合征、额颞痴呆、 强直性肌营养不良、尼曼-皮克病、皮克病、朊病毒病、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全 脑炎、惊厥性障碍（例如，癫痫）、血管性痴呆、年龄相关性痴呆、头部创伤、中风、神经纤维 瘤、路易小体病、肌萎缩性侧索硬化（ALS)、外周神经病、以及黄斑变性。
[0038] "药学上可接受的载体"是指一种载体，其对于所治疗的受试者是生理学上可接 受的，同时保持与其一起给予的组合物（例如，构象-特异性抗体）的治疗特性。一种 示例性的药学上可接受的载体物质是生理盐水。其他生理学上可接受的载体以及它们 的配制品是本领域技术人员已知的并且描述于，例如，雷明顿药物科学（Remington' s Pharmaceutical Sciences)(第 20 版，Α·真纳罗（A. Gennaro)编辑），2000,利平科特 威廉姆斯&威尔金斯出版社，费城，宾夕法尼亚州（Lippincott，Williams&Wilkins， Philadelphia，PA))〇
[0039] "蛋白质"、"多肽"、"多肽片段"或"肽"是指多于两个氨基酸残基的任何链，无论翻 译后修饰（例如，糖基化或磷酸化）、构成一种天然存在的多肽或肽的全部或部分、或构成 一种非天然存在的多肽或肽。当已经使用物理的、机械的、或化学方法从细胞成分去除多肽 时，一种多肽或肽可以被认为是"分离的"或"基本上纯的"。一种"分离的多肽"（例如，一 种分离的抗体）、"基本上纯的多肽"、或"基本上纯的和分离的多肽"典型地被认为是从细 胞成分去除的并且是基本上纯的（当它按重量计至少60%不含与其天然相关联的蛋白质 和天然存在的有机分子时）。该多肽可以是至少75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、或99 %纯的 (按重量计）。一种基本上纯的多肽（例如，一种基本上纯的抗体或其片段）可以通过标准 技术获得，例如，通过从一种天然来源（例如，细胞系或生物流体）提取，通过编码该多肽的 重组核酸的表达，或通过化学合成该多肽。可以通过任何适当的方法，例如柱层析、聚丙烯 酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量纯度。可替代地，如果已经通过人为干预将多肽改变，或 者置于不是它的天然位点的位置，或者如果将它导入一种或多种细胞，那么多肽被认为是 分离的。