11、31^/1111、21^/1111、或小于11^/1111血清的、处于顺式或反式构象的 ρΤ231_τ的血清水平在诊断患有一种障碍（例如，一种τ蛋白病变）的患者中被认为预示 出良好结果。大于51^/1111、1〇1^/1111、2〇1^/1111、3〇1^/1111、4〇1^/1111、或5〇1^/1111的、处于顺式或 反式构象的底物的血清水平在已经被诊断患有一种障碍的受试者中被认为诊断出较差结 果。
[0247] 对于基于处于具体构象的底物（例如，处于顺式或反式构象的一种ρΤ231- τ )的 相对水平进行的诊断，一个患有一种障碍（例如，一种τ蛋白病变）的受试者将显示处 于例如顺式构象的底物的量的改变（例如，增加10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80%、90%、或更多）或顺式和反式构象之间比率的改变。正常参比样品可以是，例如，在该 障碍或表明该障碍的症状的发展之前取自同一受试者的先有样品，来自不患有该障碍的受 试者的样品，来自不具有该障碍的症状的受试者的样品，或以已知正常浓度处于给定构象 (即，不指示该障碍）的经纯化的参比多肽的样品。
[0248] 本发明的特征还在于受试者的轻度认知缺损（MCI) τ蛋白病变（例如，AD、CTE)、 或TBI的早期诊断或倾向。这些方法和组合物包括顺式ρΤ231_τ和顺式：反式ρΤ231_τ 比率的检测和测量。升高水平的顺式ΡΤ231或顺式：反式比率将指示受试者是处于AD的 风险中并且这样一个受试者群体将受益于在此描述的顺式ρΤ231_τ靶向免疫疗法。本发 明的早期诊断和监测方法也可用于评估患者在潜在临床试验中的治疗反应。顺式：反式 ρΤ231_τ比率降低将指示该治疗有效于靶向MCI、τ蛋白病变（例如，AD、CTE)、或ΤΒΙ。此 类早期诊断可以在神经障碍的任何症状已经呈现（例如，在已知或疑似具有脑外伤（例如， 重复脑外伤）或神经疾病家族史的患者中）之前进行。
[0249] 标准方法可以用来测量任何体液中的底物水平，包括，但不限于，尿、血液、血清、 血浆、唾液、羊水、或脑脊液（CSF)。此类方法包括免疫测定、ELISA、蛋白质印迹、以及定量 酶免疫测定技术。
[0250] 出于诊断目的，可以标记构象特异性抗体。抗体的标记旨在涵盖通过偶联（例如， 物理连接）可检测物质至抗体进行的抗体的直接标记，连同通过使抗体与另一种直接标记 的试剂发生反应进行的该抗体的间接标记。例如，可以将该抗体标记有一种放射性或荧光 标记，该放射性或荧光标记在受试者中的存在和定位可以通过标准的成像技术检测。
[0251] 在此描述的诊断方法可以单独使用或与在此描述的任何其他诊断方法组合使用， 以用于更准确地诊断障碍（例如，一种τ蛋白病变）的存在或严重性。用于诊断此类障碍 的另外的方法的实例包括，例如，确定其他生物标记（例如，CSF t- τ、ρΤ181- τ、Αβ 42、或 Αρ〇Ε4)的水平、检查受试者的健康史、组织的免疫组织化学染色、计算机断层摄影（CT)扫 描、或培养生长。
[0252] 诊断试剂盒
[0253] 本发明还提供了一种诊断测试试剂盒。例如，一种诊断测试试剂盒可以包括多肽 (例如，特异性地结合至顺式ρΤ231_τ或反式ρΤ231_τ、其片段的构象特异性抗体）和用 于检测和/或评估该多肽（例如，抗体）和P-τ蛋白之间的结合的部件。可替代地，该试剂 盒可以包括顺式ρΤ231_τ或反式ρΤ231_τ多肽或顺式ρΤ231_τ或反式ρΤ231_τ片段， 以用于检测存在于受试者样品的血清、血液、或CSF中的顺式ρΤ231_τ或反式ρΤ231_τ。 在另一个实例中，本发明的诊断试剂盒可以用来鉴别顺式ρΤ231_τ或反式ρΤ231_τ多肽 水平相对于一个参比（例如存在于一种正常对照中的水平）的改变。这样一种试剂盒可以 包括一个参比样品或指示阳性参比或正常对照参比的标准曲线。
[0254] 为了检测，将该抗体或该顺式ρΤ231_τ或反式ΡΤ231多肽进行标记，并且该抗体 或顺式ρΤ231_τ或反式 ΡΤ231多肽进行底物结合，使得可以在抗体和顺式ρΤ231_τ或反 式ΡΤ231多肽之间结合之后，通过确定附接至该底物的标记的量确立多肽-抗体相互作用。 常规的免疫测定（例如，ELISA)可以用于检测抗体-底物相互作用并且可以配备有本发明 的试剂盒。本发明的多肽可以在生物样品，例如血液、血浆、CSF、或血清中检测。
[0255] 该诊断试剂盒可以包括用于使用该试剂盒的说明书。在一个实例中，该试剂盒包 括用于使用该试剂盒以诊断τ蛋白病变（例如、六0、〇^)、了81、和/或此1、或处于发展它 们的风险的说明书。在又另一个实例中，该试剂盒包括用于使用该试剂盒以监测治疗性治 疗、剂量方案、或处于发展一种τ蛋白病变（例如，AD、CTE)、ΤΒΙ、和/或MCI的风险中的 受试者的说明书。
[0256] 受试者监测
[0257] 在此描述的诊断方法也可以用来在治疗期间监测障碍的进展（例如，MCI、TBI、τ 蛋白病变（例如，AD、CTE))或用来确定治疗化合物的剂量。在一个实施例中，例如，反复测 量处于顺式或反式构象的、具有Ser/Thr-Pro基序的多肽（例如，ρΤ231-τ)的水平，作为 诊断该障碍和监测该障碍的治疗或管理的方法。为了监测受试者体内障碍的进展，可以将 受试者样品在若干个时间点获得并且然后可以进行比较。例如，诊断方法可以用于在治疗 之前、期间、和之后监测受试者。在这个实例中，使用本发明的构象-特异性抗体密切监测 受试者中处于顺式构象的ρΤ231_τ的水平，并且，如果处于顺式构象的ρΤ231_τ的水平在 治疗期间开始降低，可以修改用于治疗该障碍的治疗方案，如通过临床医师确定（例如，可 以改变治疗剂量或可以给予不同的治疗剂）。本发明的监测方法也可以用于，例如，在受试 者中评估一种具体药物或疗法的效力，确定剂量，或评估感染的进展、状态、或阶段。
[0258] 实例
[0259] 实例1 :顺式和反式ρΤ231- τ小鼠单克隆抗体（mAb)的产生和其DNA序列的确定
[0260] 为了开发顺式和反式ρΤ231_ τ小鼠 mAb，如先前描述于中村（Nakamura)等人，细 胞（Cell) 149 :232-244,2012中的，用74%的顺式pT231-Pip τ肽进行小鼠免疫。该方法产 生480种杂交瘤克隆，然后将这些克隆进行表征。在通过ELISA，使用ρΤ231-τ肽（这些肽 都是野生型顺式+反式（pT231-Pro)、锁定为顺式（pT231-Dmp)或反式（pT231-Ala)或非磷 酸化（T231-Pro)，描述于中村（Nakamura)等人，细胞（Cell) 149 :232-244, 2012中）筛选的 第一批96种杂交瘤培养上清液中，鉴别出两种顺式杂交瘤克隆，#113和#74,它们识别野生 型和顺式ρΤ231_τ肽，但既不识别反式也不识别非磷酸化肽（图3A、3B);鉴别出两种反式 杂交瘤克隆，#25和#69,它们识别野生型和反式ρΤ231- τ肽，但既不识别顺式也不识别非 磷酸化肽（图3C)。包括mAb重链和轻链的CDR的核酸和蛋白序列如下所示。此外，顺式是 稳定的并且反式被降低，如通过在用Pinl抑制剂、Cpdl和更低活性的IE处理的细胞中，用 无活性CpdlA作为对照分别对顺式mAb-#113和反式mAb-#25检测的（图3D)。图3E显示 mAb的IgG亚类，如使用同种型ELISA试剂盒（伊格尔公司（Eagle))确定的。使用Y RACE RT-PCR技术确定这些mAb的重链和轻链的DNA序列，如在布拉德伯里（Bradbury)等人，老 化神经生物学（Neurobiol Aging) 16:465-475,1995中所述。BLAST搜索显示，这四个mAb 克隆是完全新颖的。预测的蛋白序列在框架区内是高度保守的，在互补决定区（CDR) 1-3中 存在明显不同（图8和9)。值得注意地是，两个顺式mAb克隆包含两个反式mAb中不存在 的一些保守的残基，并且反之亦然（图8和9)。
[0261] 顺式 mAb_#113
[0262] 重链 CDR
[0263] CDRl : SYWIH (SEQ ID NO :1)
[0264] CDR2 :VIDPSDSYTRYNQKFKG(SEQ ID NO :2)
[0265] CDR3 :WEVDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO :3)
[0266] SEQ ID NO : 22 (重链全长蛋白序列）
[0267] MGVSLQLLGT QDLTMRffSCI ILFLVATATG VNSQVQLQQP GAELVKPGAS VKMSCKASGY
[0268] TFTSYffIHffV KQRPGQGLEff IGVIDPSDSY TRYNQKFKGK ATLTVDTSSS TAYMQLSSLT
[0269] SEDSAVYYCT TffEVDYffGQG TTLTVSSAKT TPPSVYPLAP GSL
[0270] SEQ ID NO : 29 (重链全长核酸序列）
[0271] ATGGGGGTCTCTCTACAGTTACTAGGCACACAGGATCTCACCATGAGATGGAGCTGTATCATCCTCTTC TTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCAACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGC TTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTG GACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAGGTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAG GCCACGTTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGT CTATTACTGTACAACATGGGAGGTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACAACAC CCCCATCAGTCTATCCCCTGGCCCCTGGAAGCTTGGG
[0272] 顺式 mAb_#113
[0273] 轻链 CDR
[0274] CDRl :RSSQSLVHSDGNTYLH(SEQ ID NO:4)
[0275] CDR2 ：KVSNRFS(SEQ ID NO ：5)
[0276] CDR3 :SQSTHVPWT(SEQ ID NO :6)
[0277] SEQ ID NO : 23 (轻链全长蛋白序列）
[0278] MGTDQSPQAV SSGCLLKMKL PVRLLVLMFff IPASNSDVVM TQTPLSLPVS LGDQASISCR
[0279] SSQSLVHSDG NTYLHffYLQK PGQSPKLLIY KVSNRFSGVP DRFSGSGSGT DFTLKISRLE
[0280] AEDLGVYFCS QSTHVPffTFG GGTKLEIKRA DAAPTVSIFP PSSKLG
[0281] SEQ ID NO : 30 (轻链全长核酸序列）
[0282] ATGGGGACTGATCAGTCTCCTCAGGCTGTCTCCTCAGGTTGCCTCCTCAAAATGAAGTTGCCTGTTAGG CTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAACAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGT CAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTCCACAGTGATGGAAACACCTATTTAC ATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCA GACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGACTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGT TTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATG CTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG
[0283] 顺式 mAb_#74
[0284] 重链 CDR
[0285] CDR I : SGYYWN (SEQ ID NO :7)
[0286] CDR 2 :YISYDGSNNYNPSLKN(SEQ ID NO :8)
[0287] CDR 3 :LRRDAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO :9)
[0288] SEQ ID NO :24(重链全长蛋白序列）
[0289] MKVLSLLYLL TAIPGILSDV QLQESGPGLV KPSQSLSLTC SVTGYSITSG YYffNWIRQFP
[0290] GNKLEffMGYI SYDGSNNYNP SLKNRISITR DTSKNQFFLK LNSVTTEDTA TYYCAGLRRD
[0291] AYffGQGTLVT VSAAKTTPPS VYPLAPGSL
[0292] SEQ ID NO :31 (重链全长核酸序列）
[0293] ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAG GAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAG TGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTA GCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAG TTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCGGGGTTACGACGTGATGCTTACTGGGGCCAAGG GACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTGGCCCCTGGAAGCTTGGG
[0294] 顺式 mAb_#74
[0295] 轻链 CDR
[0296] CDR I :RASQDISNYLN(SEQ ID NO :10)
[0297] CDR 2 :YTSRLHS(SEQ ID NO :11)
[0298] CDR 3 :QQGNTLPWT(SEQ ID NO :12)
[0299] SEQ ID NO :25(轻链全长蛋白序列）
[0300] MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP
[0301] DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPffTFGG
[0302] GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSKLG
[0303] SEQ ID NO :32 (轻链全长核酸序列）
[0304] ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAG ATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACAT TAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTAC ACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAA GAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAAT CAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGGG
[0305] 反式 mAb_#25
[0306] 重链 CDR
[0307] CDR I :DTYMH(SEQ ID NO :13)
[0308] CDR2 :RIDPANGNTRYDPKFQG(SEW ID NO :14)
[0309] CDR 3 :RVGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO :15)
[0310] SEQ ID NO :26(重链全长蛋白序列）
[0311] MKCSffVIFFL MAVVTGVTSE VQLQQSGAEL VKPGASVKLS CTASGFNIKD TYMHffVKQRP
[0312] EQGLEffIGRI DPANGNTRYD PKFQGKATIT SDTSSNTAYL QLSSLTSEDT AVYYCARRVG
[0313] YYFDYffGQGT TLTVSSAKTT PPSVYPLVPG SL
[0314] SEQ ID NO :33 (重链全长核酸序列）
[0315] ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCACTTCAGAGGTTCAGC TGCAGCAGTCTGGGGCAGAACTTGTGAAACCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACA TTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTG CGAATGGTAATACTAGATATGACCCAAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACATCAGACACATCCTCCAACACAG CCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGCGGGTGGGGTACTACT TTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCCCTGG TCCCTGGAAGCTTGGG
[0316] 反式 mAb_#25
[0317] 轻链 CDR
[0318] CDR I:KSSQSVLYSSDLKNYLA(SEQ ID NO :16)
[0319] CDR 2 :WASTRES (SEQ ID NO : 17)
[0320] CDR 3 :HQYLSSYT(SEQ ID NO :18)
[0321] SEQ ID NO : 27 (轻链全长蛋白序列）
[0322] MESQTQVFLS LLLffVSGTCG NIMMTQSPSS LAVSAGEKVT MSCKSSQSVL YSSDLKNYLA
[0323] WYQQKPGQSP TLLIYffASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVQAEDLA VYYCHQYLSS
[0324] YTFGGGTKLE IKRADAAPTV SIFPPSSK
[0325] SEQ ID NO :34(轻链全长核酸序列）
[0326] ATGGAATCACAGACTCAGGTCTTCCTCTCCCTGCTGCTCTGGGTATCTGGTACCTGTGGGAACATTATG ATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTGT TTTATACAGTTCAGATCTGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTACACTGCTGATCT ATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACC ATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGG GACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGC
[0327] 反式 mAb_#69
[0328] 轻链 CDR
[0329] CDR I:KSSQSLLYTGNQKNYLA(SEQ ID NO :19)
[0330] CDR 2 :WASTRES(SEQ ID NO : 20)
[0331] CDR 3 :QQYYSYPWT(SEQ ID NO :21)
[0332] SEQ ID NO : 28 (轻链全长蛋白序列）
[0333] MDSQAQVLML LLLffVSGTCG DIVMSQSPSS LAVSVGEKVT MSCKSSQSLL YTGNQKNYLA
[0334] WYQQKPGQSP KLLIYffASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVKAEDLA VYYCQQYYSY
[0335] PffTFGGGTKL EIKRADAAPT VSIFPPSSKL G
[0336] SEQ ID NO :35 :(轻链全长核酸序列）
[0337] ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTG ATGTCACAATCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCT TTTATATACTGGCAATCAAAAGAACTACTT