GGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTT ACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACC ATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCGTGGACGTTCGGTGG AGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG
[0338] 实例2 :稳健的顺式、而非反式ρΤ231- τ较早出现于MCI/AD和CTE脑的轴突内， 并且随着疾病进展进一步累积
[0339] 为了检查顺式ρΤ231- τ在AD和CTE脑中何时出现以及出现在何处，我们用顺式 和反式mAb、随后通过同种型二级抗体进行了脑切片的双重免疫染色，反式mAb仅在少量神 经元胞体（甚至在正常脑内）处染色，顺式mAb并不染色正常脑，但是在MCI神经元的直神 经突中有力地检测到信号，其在AD神经元的变形神经突中进一步累积和定位（图4A-4C)。 值得注意的是这个模式与通过描述于中村（Nakamura)等人，细胞（Cell) 149:232-244， 2012)中的多克隆顺式和反式抗体检测到的类似，不仅证实了顺式和反式mAb的特异性，而 且也表明，顺式、而非反式mAb靶向人MCI以及AD中的早期致病性构象。麦基博士（Dr. McKee)提供的8个运动-和8个老兵相关的CTE的染色脑切片（李亮（Liliang)等人， 外科研究（J Surg Res) 160:302-307, 2010;陈（Chen)等人，癌症研究（Cancer Res) 73: 3951-3962,2013)显示稳健的顺式、而非反式ρ-τ在II期神经突是容易检测到的并且在 III期进一步累积（图4D-4I)。通过与轴突标记物神经丝或树突标记物ΜΑΡ2共染色，这些 顺式-阳性神经突被证实为轴突。值得注意的是，极罕见有神经元具有顺式及反式P-τ这 二者，支持它们是体内易互变的。因此，顺式非常早地出现在AD和CTE中。
[0340] 实例3 :顺式和反式mAb进入神经元并且到达不同神经元区室，并且顺式mAb以一 种PT232依赖性的方式在体外和离体减少τ水平
[0341] 为了确定顺式和反式mAb是否可以进入神经元并且到达预期神经元区室，用τ和 p25/Cdk5 ( τ激酶）或载体对照转染人SY5Y神经元，随后将mAb添加至培养基48小时，然 后经受仅用第二抗体进行的免疫染色或免疫印迹。不仅在神经元，而且在不同神经元区室 中容易地检测到了顺式和反式mAb两者。顺式mAb主要在神经突中检测到，而反式mAb主 要在胞体中检测到（图5A和5B)，如在MCI以及AD脑中所预期的（图4)。更令人感兴趣 的是，顺式mAb仅在p25/Cdk5过表达后显著减少内源和外源τ的总水平，对τΤ231Α突变 体没有明显效果（图5C)。将顺式mAb添加至人野生型τ-Tg小鼠海马体切片的培养基中 还极大地降低了 τ水平（图f5D)。此外，当SY5Y神经元经受血清耗尽（一种类似于创伤 性脑损伤（TBI)的胁迫条件）时，发现在SY5Y神经元中的顺式ρΤ231-τ通过血清耗尽以 时间-依赖性方式明显增加，但是这种增加被顺式、而非反式mAb有效地消除（图5Ε)。因 此，顺式mAb在体外和离体减少τ水平。
[0342] 实例4 :顺式而非反式mAb强力地抑制神经元中的由P- τ诱导的微管破坏和神经 毒性
[0343] 为了检查顺式mAb是否可以影响P- τ诱导微管破坏和神经毒性的能力，我们用 p25/Cdk5、τ和GFP共转染SY5Y细胞并且添加顺式或反式mAb持续48-72小时，随后免疫 染色微管蛋白和DNA (图6A)。此外，我们用Cdk5-p25和GFP- τ或其T231A突变体共转染 SY5Y神经元，然后添加顺式或反式mAb，随后进行针对细胞形态和神经毒性的活细胞共聚 焦成像（图6B和6C)。两个测定清楚地表明顺式、而非反式mAb强力地抑制由ρ-τ诱导的 神经元中的微管破坏（图6Α)和神经毒性（图6Β和6C);在对照和反式mAb处理的细胞中 大多数GFP-τ-阳性细胞死亡，其中细胞核周围的微管（MT)网塌陷（图6A)。大多数顺式 mAb-处理的GFP- τ -阳性细胞存活良好，在神经突中甚至具有MT网（图6B，图6C中的箭 头）。当添加至培养基时，顺式而非反式mAb还有效地抑制SY5TY神经元中由血清耗尽诱导 的微管破坏和神经毒性（图6D和6E)。
[0344] 实例5 :顺式ρΤ231- τ显著存在于AD患者的细胞外脑脊液（CSF)中
[0345] CSF ρΤ231- τ是一种早期AD生物标记。为了测定CSF ρΤ231- τ构象，在CSF中 使用INNOTEST h τ ELISA试剂盒（Innogenetics公司）用顺式或反式Ab作为检测抗体测 量顺式和反式ΡΤ231- τ。在所有8个对照CSF中，没有可检测出的顺式ρΤ231- τ，但是在 8个案例的3个中检测到少量的反式ρΤ231- τ (图7Α)，这可预期，因为反式与神经原纤维 缠结（NFT)不相关。引人注目地，在晚期AD患者中，反式并且尤其是顺式ρΤ231-τ显著增 加（图7Α)，这与在脑组织所见的一致（图4)。此外，尽管顺式或反式水平中存在一个宽的 个体间差异，顺式：反式比率在AD患者中是非常相似的（图7Β)。
[0346] 实例6 :评估顺式τ mAb终止脑损伤和其扩散在TBI小鼠模型中的潜力和血清顺 式ρΤ231_τ水平鉴别患有显著TBI的患者的潜力
[0347] 我们已经开发了创新的肽化学以产生第一顺式和反式ρΤ231- τ抗体，使Pinl-催 化的构象变化可视化（图11)。值得注意的是，顺式而非反式ρΤ231_τ在MCI神经元早期 出现并且随着AD进展仅在具有退化神经元的轴突中进一步积累，与认知缺陷良好相关。此 外，顺式而非反式ΡΤ231- τ丧失其正常的微管-组装能力，并且获得毒性功能，对去磷酸化 和降解产生抗性，并且倾向于聚集（图11)。因此顺式ρΤ231- τ在MCI以及AD中是一种早 期和致病性事件。我们现在已经开发了中和性的顺式和反式ρΤ231_τ单克隆抗体（mAb)， 它们在神经元并且甚至在小鼠 TBI脑中高度有效于消除其对应P- τ异构体。
[0348] 鉴于我们使用顺式τ mAb治疗单一严重TBI小鼠的有前景的疗效结果，通过追踪 在脑、CSF和血清中的顺式ρΤ231-τ，我们将在处于不同严重程度的重复性轻度TBI的小鼠 模型中系统地评估顺式τ mAb用以终止脑损伤及其扩散的潜力及其剂量需求，及其与顺式 mAb治疗后在不同时间时的行为和病理变化的关系。
[0349] 鉴于血清τ水平显现与TBI严重性相关，并且我们的初步结果表明顺式P- τ (用 反式作为对照）可以是一种优于总τ的生物标记，我们将进一步改进我们的ELISA以在严 重急性TBI后的30-50位患者以及匹配的对照中测定顺式和反式P-τ和总τ。 38 41这可 能最终提供一种灵敏方法以用于针对顺式τ mAb治疗鉴定TBI患者。
[0350] 预期的结果将构成针对τ蛋白病变中非常早期、分泌的和毒性的顺式ρΤ231_τ 的创新的构象-特异性生物标记和免疫疗法，增加了停止或预防处于早期阶段的TBI、CTE 以及AD患者中τ蛋白病变和记忆丧失的难得机会的。
[0351] 实例7 :顺式mAb不仅有效地消除顺式ρΤ231- τ诱导，而且还中和在不同神经元 胁迫下其诱导轴突微管破坏，线粒体运输缺陷和最终细胞凋亡的能力
[0352] 我们发现各种神经元胁迫（如缺氧或营养耗尽）有力地以时间-依赖性方式诱导 顺式ρΤ231-τ，进而MT网破坏和最终通过细胞凋亡进行的细胞死亡，如通过活（绿色）/死 (红色）细胞测定试剂盒（艾碧康公司（Abeam))和膜联蛋白5FACS显示的（图12A-12E)。我 们的活细胞视频成像也证实了时间-依赖性的MT塌陷以及线粒体的轴突运输的缺陷（数 据未显示）。引人注目地，顺式mAb治疗几乎完全消除顺式P-τ诱导、并且还有效地挽救轴 突MT破坏、线粒体运输缺陷、和细胞凋亡，而反式mAb去除反式P-τ并加速这些表型（没 有交叉-耗尽）（图12)。顺式P- τ诱导细胞凋亡的能力与如下先前证据是一致的：人AD 神经元中存在半胱天冬酶和细胞凋亡（热尔韦（Gervais)等人，细胞（Cell)97 :395-406, 1999)。类似地，顺式mAb消除顺式ρ-τ并减少总τ的能力与我们的如下发现是一致的： 顺式P-τ是比反式更稳定（中村（Nakamura)等人，细胞（Cell) 149 :232-244, 2012)，并且 抗体复合物可以由TR頂21识别以用于蛋白降解（马勒里（Mallery)等人，美国科学院院 刊（PNAS) 107 :19985-1998590,2010 ;麦克尤恩（McEwan)等人，生物测定（Bioessays)33: 803-809,2011)。
[0353] 实例8 :顺式而非反式mAb有效阻止自受胁迫神经元分泌的顺式ρΤ231_τ肽在受 体神经元中诱导神经毒性
[0354] 因为丰富的ρΤ231- τ存在于AD患者的CSF中并且培养的神经元经由一种非常规 机制分泌τ进入培养基，我们检查了在受胁迫后神经元是否分泌顺式和反式ρ-τ。实际 上，当顺式及反式P- τ这二者连同肌动蛋白释放时，受胁迫神经元在40小时处分泌顺式而 非反式ΡΤ231- τ进入培养基，之后在72小时处细胞死亡（图13Α)。更重要的是，当添加 至健康神经元持续3天后，该含顺式的培养基通过细胞凋亡杀死神经元。用顺式而非反式 mAb进行该培养基的预处理，随后用蛋白G耗尽mAb，完全挽救了神经元死亡（图13Β)。
[0355] 实例9 :顺式而非反式mAb有效阻止人AD或CTE脑裂解物在受体神经元中诱导神 经毒性
[0356] 为了检查人AD脑是否还包含毒性顺式ρΤ231- τ，我们添加人AD脑裂解物至培养 的神经元中并在受体神经元中检测到顺式ρΤ231_τ而非顺式-τ (当使用对照脑裂解液 时）。更重要的是，AD而非正常脑裂解物诱导受体神经元中的细胞凋亡，所述细胞凋亡通过 用顺式而非反式mAb预处理AD脑裂解物而得以完全挽救（图14)。用人CTE脑裂解物也获 得相似结果。
[0357] 实例10 :顺式ρΤ231- τ随着TBI的严重性增加并且在TBI小鼠脑中在缠结-相 关表位之前很久即出现在轴突中
[0358] 为了检查顺式P- τ和TBI严重性之间的关系，我们在不同高度使用重物坠落装置 以在小鼠中诱导不同严重性的闭合性头部脑损伤（模拟运动-相关的ΤΒΙ)，测试了 TBI 48 小时后脑中的顺式P-τ。TBI 48小时后，顺式和总τ随着TBI严重性的增加有力地增加 (图15Α)，这与我们的发现即顺式P- τ对降解具有抗性相一致。爆破-诱导的TBI (模仿 军事-相关的ΤΒΙ) 48小时后，还发现了稳健的顺式P- τ。时程研究显示在严重TBI后，12 小时后顺式而非反式ρ-τ出人意料地被诱导并且随时间继续增加，维持至少2周（图15Β 和15C)。顺式-阳性神经突再次为轴突而非树突（dentrite)。值得注意的是，在WT小鼠中 TBI 后，使用我们已使用的 mAb，包括 AT8、AT180、TG3、AT100、MCI、Alz50 或 PHFl (图 15D)， 我们不能找到任何缠结-相关的表位，如果有的话，其出现耗时长。
[0359] 实例11 :在小鼠中严重TBI后，顺式mAb不仅消除顺式ρΤ231- τ，而且还恢复轴突 MT破坏、线粒体运输缺陷、细胞凋亡和甚至脑功能
[0360] 为了检查顺式mAb是否进入并消除顺式ρΤ231_τ及其在TBI小鼠脑内的毒性，我 们首先腹腔内或静脉内给予生物素化的顺式mAb至Β6小鼠并且在之后3天检测顺式mAb。 注射的mAb是脑中容易检测到的（图9A)。接下来严重TBI后我们用腹腔内250 μ g顺式 mAb每4天一次持续3次处理小鼠，并且在14天之后进行脑分析。引人注目地，顺式mAb有 效阻止TBI-诱导的顺式ρΤ231_τ诱导并在小鼠脑中减少总τ (图9B)。此外，顺式mAb而 非对照IgG的治疗有效地恢复轴突MT破坏和线粒体破坏（图10A)和甚至细胞凋亡，如通 过PARP裂解测定的（图9C)。
[0361] 为了检查顺式mAb是否恢复了严重TBI后脑的功能，我们使用了高架十字迷宫，其 被广泛用于测定小鼠中焦虑-相关的强迫行为。严重TBI 2个月后，用IgG处理的小鼠显示 出在闭臂中的活动减少并且在开臂中的活动增加，反映焦虑-相关的强迫行为，指示额皮 质-相关的功能障碍，但顺式mAb-处理的小鼠和假处理的小鼠 （shame mice)没有显著不同 (图10B)，表明顺式mAb能够恢复TBI-诱导的脑功能。因此，顺式mAb高度有效于消除顺式 ρ-τ及其神经毒性，并在神经元和TBI小鼠模型中恢复脑功能，与表明TmAb可以进入脑 中神经元的先前工作一致（言曼达（Yanamandra)等人，神经元（Neuron) 80 (2) :402_414， 2013;克里希纳穆尔蒂（Krishnamurthy)等人，精神病疗法前沿（Front Psychiatry)2: 59,2011 ;穆罕默德（Mohamed)等人，神经科学研究（J Neurosci Res)69 :110-116,2002) 并且与表明mAb可以触发细胞中的靶向降解的先前工作一致（马勒里（Mallery)等人， 美国科学院院刊（PNAS) 107:19985-1998590,2010;麦克尤恩（McEwan)等人，生物测定 (Bioessays)33 :803_809,2011)〇
[0362] 其他实施例
[0363] 从前述说明中，将清楚的是，可以对本文所述的发明作出变更和修改以使其适应 于各种用途和状况。这样的实施例也在下述权利要求书的范围内。
[0364] 在本说明书中提到的所有出版物、专利申请、以及专利都通过引用结合在此，其程 度如同每个单独的出版物、专利申请或专利被具体地并且单独地指明通过引用结合在此。
[0365] 从前述说明书，本领域技术人员可以很容易地确定本发明的实质特征；可以对本 发明作不同变化和变更，以使它适应不同用途和条件。因此，其他实施例也在权利要求书范 围内。
【主权项】
1. 一种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一种抗体或单克隆抗体，其中所述部 分包括一个或多个具有SEQIDNO:1-3的重链可变区、或其变体以及一个或多个具有SEQ IDNO:4-6的轻链可变区、或其变体。2. 如权利要求1所述的分离的结合部分，其中所述结合部分包括两个或更多个具有 SEQIDN0:l-3的重链可变区、或其变体以及两个或更多个具有SEQIDN0:4-6的轻链可 变区、或其变体。3. 如权利要求1所述的分离的结合部分，其中所述结合部分包括具有SEQIDNO:1-3 的重链可变区、或其变体和具有SEQIDNO:4-6的轻链可变区、或其变体。4. 如权利要求1所述的分离的结合部分，其中所述单克隆抗体包含一个具有SEQID NO:22的重链蛋白序列以及一个具有SEQIDNO:23的轻链蛋白序列。5. -种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一种抗体或一种单克隆抗体，其中所 述结合部分包括一个或多个具有SEQIDNO:7-9的重链可变区、或其变体以及一个或多个 具有SEQIDNO:10-12的轻链可变区、或其变体。6. 如权利要求5所述的分离的结合部分，其中所述结合部分包括两个或更多个具有 SEQIDNO:7-9的重链可变区、或其变体以及两个或更多个具有SEQIDNO:10-12的轻链 可变区、或其变体。7. 如权利要求5所述的分离的结合部分，其中所述结合部分包括具有SEQIDNO:7-9 的重链可变区、或其变体和具有SEQIDNO:10-12的轻链可变区、或其变体。8. 如权利要求1所述的分离的结合部分，其中所述单克隆抗体包括一个具有SEQID NO:24的重链蛋白序列以及一个具有SEQIDNO:25的轻链蛋白序列。9. 如权利要求1-8中任一项所述的分离的结合部分，其中所述结合部分特异性地结合 到磷酸化-苏氨酸231-τ蛋白（ρΤ231-τ)的顺式构象上。10. 如权利要求1-8中任一项所述的分离的结合部分，其中该单克隆抗体是一种单链 抗体或一种抗体片段。11. 如权利要求10所述的分离的结合部分，其中该单克隆抗体是一种嵌合抗体、一种 人源化抗体、或一种人抗体。12. -种药物组合物，该药物组合物包括如权利要求1-11中任一项所述的结合部分以 及一种药学上可接受的载体。13. -种治疗τ蛋白病变、创伤性脑损伤（ΤΒΙ)、或中风的方法，所述方法包括将如权 利要求1-8中任一项所述的结合部分以足以治疗所述τ蛋白病变、ΤΒΙ、或中风的量给予至 对其有需要的一位受试者，其中所述结合部分特异性地结合至ΡΤ231-τ的顺式构象上。14. 如权利要求13所述的方法，其中所述τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成： 进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病（CTE)、额颞痴呆、额颞叶变性、帕金森氏病-痴呆-肌 萎缩侧索硬化复合征、缠结主导型痴呆、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、皮克病、皮质 基底节变性、和阿尔茨海默病。15. 如权利要求13所述的方法，其中所述受试者是有所述τ蛋白病变的倾向或是处于 所述τ蛋白病变的一个早期阶段。16. 如权利要求15所述的方法，其中所述τ蛋白病变的所述倾向或早期阶段是通过从 所述受试者获得的样品中顺式ρΤ231_τ的升高的水平或顺式：反式ρΤ231_τ的比率的增 加确定的。17. 如权利要求16所述的方法，进一步包括确定以下各项的水平：CSFt-τ、 ρΤ181-τ、Αβ42、或ApoE4 水平。18. 如权利要求16所述的方法，其中所述样品选自下组，该组由以下各项组成：尿、血 液、血清、血浆、唾液、羊水、和脑脊液（CSF)。19. 如权利要求13所述的方法，其中所述受试者有重复脑外伤病史的倾向。20. -种用于在用如权利要求1-8中任一项所述的结合部分治疗的受试者中监测治疗 反应的方法，所述方法包括： a. 确定从所述受试者获得的样品中顺式ρΤ231_τ或顺式：反式ρΤ231_τ比率的水 平，并且任选地 b. 确定CSFt-τ、ρΤ181_τ、Αβ42、或ΑροΕ4 的水平， 其中顺式ρΤ231_τ或顺式：反式ρΤ231_τ比率的水平的降低导致对所述结合部分的 有效治疗反应。21. 如权利要求20所述的方法，其中CSFt-τ、ρΤ181-τ、Αβ42、或ΑροΕ4的所述水平 降低。22. -种诊断受试者为患有τ蛋白病变或具有τ蛋白病变的倾向的方法，所述方法包 括： a. 确定从所述受试者获得的样品中顺式ρΤ231_τ或顺式：反式ρΤ231_τ比率的水 平， b. 将所述样品中顺式ρΤ231_τ或顺式：反式ρΤ231_τ比率的所述水平与正常参比 样品进行比较，其中与所述正常参比样品相比顺式ρΤ231_τ的升高的水平或顺式：反式 ρΤ231_τ比率的增加导致诊断所述受试者为患有所述τ蛋白病变，或具有所述τ蛋白病 变的倾向，并且 c. 以足以治疗所述τ蛋白病变的量向所述受试者给予如权利要求1-8中任一项所述 的结合部分。23. 如权利要求20或22所述的方法，其中所述样品选自下组，该组由以下各项组成： 尿、血液、血清、血浆、唾液、羊水、和脑脊液（CSF)。24. -种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一种抗体或一种单克隆抗体，其中所 述结合部分包括一个或多个具有SEQIDNO:13-15的重链可变区、或其变体以及一个或多 个具有SEQIDNO:16-18的轻链可变区、或其变体。25. 如权利要求24所述的分离的结合部分，其中所述结合部分包括两个或更多个具有 SEQIDNO:13-15的重链可变区、或其变体以及两个或更多个具有SEQIDNO:16-18的轻 链可变区、或其变体。26. 如权利要求24所述的分离的结合部分，其中所述结合部分包括具有SEQIDNO: 13-15的重链可变区、或其变体以及具有SEQIDNO:16-18的轻链可变区、或其变体。27. 如权利要求24所述的分离的结合部分，其中所述单克隆抗体包含一个具有SEQID NO:26的重链蛋白序列以及一个具有SEQIDNO:27的轻链蛋白序列。28. -种分离的构象-特异性结合部分，任选地为一种抗体或一种单克隆抗体，其中所 述结合部分包括一个或多个具有SEQIDNO:19-21的轻链可变区、或其变体。29. 如权利要求28所述的分离的结合部分，其中所述结合部分包括两个或更多个具有 SEQ ID NO :19-21的轻链可变区、或其变体。30. 如权利要求28所述的分离的结合部分，其中所述结合部分包括具有SEQ ID NO : 19-21的轻链可变区、或其变体。31. 如权利要求28所述的分离的结合部分，其中所述单克隆抗体包含一个具有SEQ ID NO :28的轻链蛋白序列。32. 如权利要求24-31中任一项所述的分离的结合部分，其中所述结合部分特异性地 结合到ρΤ231-τ的反式构象上。33. 如权利要求24-31中任一项所述的分离的结合部分，其中该单克隆抗体是一种单 链抗体或一种抗体片段。34. 如权利要求33中任一项所述的分离的结合部分，其中该单克隆抗体是一种嵌合抗 体、一种人源化抗体、或一种人抗体。35. -种药物组合物，该药物组合物包括如权利要求24-34中任一项所述的结合部分 以及一种药学上可接受的载体。36. -种试剂盒，用于诊断受试者为患有τ蛋白病变或具有τ蛋白病变的倾向，该试 剂盒包括： a. 特异性地结合到ρΤ231- τ的顺式构象上的、如权利要求1-8中任一项所述的结合部 分， b. 特异性地结合到ρΤ231_τ的反式构象上的、如权利要求24-31中任一项所述的结合 部分，以及 c. 用于使用a.和b.中的结合部分来诊断所述受试者为患有所述τ蛋白病变或具有 所述τ蛋白病变的倾向的说明书。
【专利摘要】本发明特征在于用于产生和使用构象-特异性抗体或其片段的方法和组合物。
【IPC分类】A61K38/10
【公开号】CN105283196
【申请号】CN201480015102
【发明人】K.P.卢, X.Z.周
【申请人】贝丝以色列女执事医疗中心
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2903091A1, EP2968548A2, US20160031977, WO2014152157A2, WO2014152157A3, WO2014152157A8