r>[0040] 如上文所定义，本发明的肽和多肽包括所有"模拟物"和"肽模拟物"形式。术语 "模拟物"和"肽模拟物"是指一种合成的化学化合物，其具有与本发明的肽（例如抗原性 肽）或多肽基本上相同的结构和/或功能特征。该模拟物可以完全是由氨基酸的合成的非 天然类似物构成的，或可以是天然氨基酸和氨基酸的非天然类似物的一种嵌合分子。该模 拟物还可以具有任何量的保守取代，只要此类取代基本上不改变该模拟物的结构或活性。 [0041] "降低"是指引起总体减少20 %或更大、50 %或更大、或75 %、80 %、85 %、90 %、 95%、或更大的能力。对于治疗应用，"降低"可以是指与这种障碍（例如，τ蛋白病变、TBI、 或中风）相关的多肽或蛋白水平的下降。对于诊断或监测应用，"降低"可以是指通过诊断 或监测测定检测的蛋白或核酸水平的下降。
[0042] "升高或增加"是指与来自正常或参比样品的对照相比基因表达或蛋白表达的增 加（例如，与对照或正常参比样品相比增加至少2倍，例如从约2倍至约150倍，例如，从5 倍至150倍，从5倍至100倍、从10倍至150倍、从10倍至100倍、从50倍至150倍、从50 倍至100倍、从75倍至150倍、或从75倍至100倍）。基因表达或蛋白表达的增加或减少 可使用本领域中已知的或在本文中描述的任何有用的方法来确定（例如，如通过PCR、凝胶 电泳、ELISA确定的）。
[0043] "参比"是指用于比较目的的任何样品、标准、或水平。"正常参比样品"可以是一 种取自同一受试者的在一种障碍（例如，τ蛋白病变、外伤性脑损伤（ΤΒΙ)、中风、或其他神 经障碍）发作之前的先有样品，来自不患有该障碍的受试者、已经成功地治疗该障碍的受 试者的样品，或处于已知正常浓度的经纯化的参比多肽的样品。"参比标准或水平"是指衍 生自参比样品的一个值或数字。正常参比标准或水平可以是衍生自正常受试者的一个值或 数字，该正常受试者与受试者样品以至少一种下列标准匹配：年龄、体重、疾病阶段、和整体 健康状况。在一个实例中，例如，指示障碍的多肽或指示障碍的多肽构象的正常参比水平是 在一个血清样品中小于5ng/ml、小于4ng/ml、小于3ng/ml、小于2ng/ml，或在一个血清样品 中小于lng/ml。"阳性参比"样品、标准、或值是源自已知患有一种障碍（例如，τ蛋白病 变、ΤΒΙ、中风、或其他神经障碍）的受试者的样品、标准、值、或数字，该受试者与受试者样 品以至少一种下列标准匹配：年龄、体重、疾病阶段、和整体健康状况。例如，像针对指示一 种障碍的多肽的一个阳性参比值是大于5ng/ml血清、大于10ng/ml血清、大于20ng/ml、大 于30ng/ml、大于40ng/ml、或大于50ng/ml血清。
[0044] "特异性地结合"是指一种分子（例如，一种抗体）识别并且结合另一种分子（例 如，抗原），但基本上并不识别并且结合其他分子。在一个实例中，特异性地结合PT231- τ 的顺式构象的抗体不特异性地结合ρΤ231_τ的反式构象。如在此使用的，术语"特异性结 合"、"特异性地结合至"一种具体分子（例如，多肽、多肽上的一个表位、或多肽构象）或是 对这种具体分子"特异性的"可以例如通过以下分子展示，该分子具有对结合至其上的分子 至少约 10 4MUO 5MUO 6MUO 7MUO SM、10 9MUO 1QM、10 11MUO 12Μ、或更高的 Kd。
[0045] 术语"特异性地结合"还可以指如下结合，其中一种分子（例如，一种抗体）结合 至一种特定多肽（例如，一种含有Xaa-Pro基序的多肽，其中Xaa是任何氨基酸残基（例 如，丝氨酸或苏氨酸））、一种特定多肽上的一个表位、或一种特定多肽的一种构象（例如， Xaa-Pro基序的顺式构象，例如，顺式ρΤ231- τ )，并且基本上不会结合至任何其他多肽、 多肽表位、或多肽构象（例如，Xaa-Pro基序的反式构象，例如，反式ρΤ231- τ )。例如，构 象-特异性抗体与例如Ser/Thr-Pro基序的一种构象（例如，顺式构象）的亲和力可以比 与其另一种构象（例如，反式构象）的亲和力高至少10至100倍（例如，亲和力高IO 1倍、 IO2倍、IQ 3倍、IQ 4倍、IQ 5倍、IQ 6倍、IQ 7倍、IQ 8倍、IQ 9倍、或 IQ 10倍）。
[0046] "受试者"是指哺乳动物，包括但不局限于，人或非人类哺乳动物，如牛、马、犬、绵 羊、或猫。
[0047] "治疗"是指给予一种用于治疗目的的药物组合物，或向已经患有障碍的受试者给 予治疗以改善受试者的病症。"治疗τ蛋白病变、TBI、或中风"是指与τ蛋白病变、TBI、 或中风相关的症状得以例如减轻、降低、治愈，或者处于一种缓解状态。
[0048] "变体⑶R"是指⑶R可以在单个氨基酸位置（例如，1、2、3、4、5或更多个氨基酸取 代）发生改变，或与来自重链和轻链的不同CDR组合（例如，重链中的CDRl和3与轻链中 的CDRl和2的组合）。此类变体可以具有如在此描述的取代（示例性或优选的）。在此描 述的变体CDR将优选地保持所描绘抗体之间保守的残基同时具有显示在抗体之间改变的 残基变化。含有变体CDR的结合部分将保持它们特异性地结合如在此描述的P-τ蛋白表 位的一种顺式（或反式）构象的能力。
[0049] 本发明的其他特征和优点从以下详细说明、附图、和权利要求书将是清楚的。
[0050] 附图简要说明
[0051] 图1是一个图示，显示在阿尔茨海默病（AD)中针对τ蛋白病变ρΤ231_τ保护的 Pinl-催化的顺式至反式异构化，如通过在体外、细胞模型、离体和小鼠模型中操纵Pinl所 示，并且分析与AD相关联的SNP。
[0052] 图2是一个图示，显示顺式-和反式-特异性抗体的发展，揭示了顺式而非反 式ρΤ231_τ失去正常τ功能且获得毒性功能，并且是早期致病性构象，在轻度认知缺损 (MCI)以及AD中导致τ蛋白病变和记忆丧失。Pinl预防顺式ρΤ231_τ的积累（通过将 其转化为非病理性的反式）。
[0053] 图3Α-3Ε示出了与顺式和反式ρΤ231_τ小鼠单克隆抗体（mAb)的发展相关的数 据。使用pT231_Pip τ肽作为一种抗原来免疫小鼠，获得顺式（图3Α、3Β)和反式（图3C) ρΤ231- τ小鼠 mAb各自的两种杂交瘤克隆。图3D显示在使用诱导Pinl降解的小分子确认 的免疫印迹上，顺式和反式mAb识别ρΤ231- τ的能力（Cpdl比CpdlE更有效力，其中使用 非活性CpdlA类似物作为对照）。图3Ε显示如使用同种型ELISA试剂盒确定的mAb的免疫 球蛋白同种型。
[0054] 图4A-4I是免疫染色结果，显示人类AD和CTE发展过程中显著的顺式而非反式 P-τ (尤其是在神经炎中）。对相同人脑切片用具有不同IgG亚型的顺式和反式mAb进行 双重免疫染色。反式P-τ甚至是在正常对照中定位于非常有限数目的神经元胞体处（B和 0,而顺式P-τ在AD和CTE的进展期间早早显现和累积并且定位于神经炎（小图B、C、E、 F、HJPI)。
[0055] 图5A-5E是结果，显示顺式和反式mAb定位于预期的神经元区室并且顺式mAb以 PT231-依赖性方式在体外和离体减少τ水平。在图5A和5B中，SY5Y细胞用τ和P25/ Ckd5进行转染，随后将mAb添加到培养基中，之后用抗小鼠抗体进行染色（围绕圆圈轻轻涂 抹）。顺式mAb显示到达神经炎（图5A)并且反式mAb显示到达细胞本体（图5B)。图5C 是一个印迹，示出了只有在p25/Cdk5共转染于SY5Y细胞中时，顺式mAb减少内源和外源τ 的τ水平，但不减少Τ231Α水平。图是一个印迹，示出了顺式mAb减少离体τ -Tg小鼠 脑切片中的τ。图5Ε是一种印迹，示出了有或没有顺式或反式mAb时血清耗尽的SY5Y细 胞。顺式mAb强力地减少顺式ρΤ231-τ，而反式mAb减少反式ρΤ231 τ。IgG重链和轻链显 示，顺式和反式mAb进入细胞并且肌动蛋白用作上样对照。
[0056] 图6Α-6Ε是结果，显示顺式而非反式mAb强力地抑制由P- τ和血清耗尽诱导的微 管破坏和神经毒性。图6Α显示用p25、Cdk5和τ +GFP转染的SY5Y细胞，并且图6Β和6C 显示将SY5Y细胞用GFP- τ或Τ231Α τ突变体转染，接着添加顺式或反式ρΤ231- τ mAb，之 后针对微管破坏（图6A)和神经毒性（图6B)对微管（MT)和细胞核进行免疫染色。在图 6C中通过时程活细胞共聚焦成像确认来自免疫染色的结果。图6D是免疫染色图像，针对的 是在顺式或反式mAb的存在下经受血清耗尽持续72小时的SY5Y细胞的MT。图6E是细胞 形态的免疫染色图像，显示在顺式或反式mAb的存在下经受血清耗尽持续72小时的SY5Y 细胞的神经毒性。
[0057] 图7A-7B显示CSF顺式ρΤ231- τ的显著存在，其中顺式/反式比率在AD患者中 一致地升高。图7Α显示在来自8个健康对照和五个晚期AD患者的脑脊液（CSF)中，通过 ELISA使用顺式-和反式抗体测定的顺式和反式ρΤ231-τ。图7Β显示顺式/反式比率（nd: 不可检测的，na :不适用）。
[0058] 图8显示实验产生的两种顺式mAb (#113, #74)(分别是SEQ ID NO :23和25)和两 种反式mAb (#25, #69)(分别是SEQ ID NO :27和28)的轻链的比对，其中在所述实验中如先 前描述于中村（Nakamura)等人，细胞（Cell) 149 :232-244,2012中的，将小鼠用74%的顺 式ρΤ231_Ρ?ρτ肽进行免疫。⑶R 1-3用标记有⑶R 1-3的框指示。阴影框指示相似的残 基并且空心框指示一致的残基。
[0059] 图9显示实验产生的两种顺式mAb (#113, #74)(分别是SEQ ID NO :22和24)和 一种反式mAb(#25)(SEQ ID N0:26)的重链的比对，其中在所述实验中如先前描述于中村 (Nakamura)等人，细胞（Cell) 149 :232-244, 2012 中的，将小鼠用 74% 的顺式 pT231-Pip τ 肽进行免疫。⑶R 1-3用标记有⑶R 1-3的框指示。阴影框指示相似的残基并且空心框指 示一致的残基。
[0060] 图10是一系列免疫染色的结果，显示中风后在受损脑区域中的神经元中的显著 的顺式而非反式P- τ。将相同的小鼠脑切片用具有不同IgG亚型的顺式和反式mAb进行双 重免疫染色。顺式P-τ (浅色）仅在受损区域早早显现，但在非受损区域不显现。
[0061] 图11是一个图示，显示了顺式pT231_TmAb如何可以用于对TBI/CTe和MCI/AD 中的τ蛋白病变的早期诊断和治疗。
[0062] 图12Α-12Ε是这样的结果，其显示顺式而非反式mAb有效地中和P-τ诱导微管破 坏、神经元死亡、以及神经元胁迫（如营养耗尽）后细胞凋亡的能力。营养耗尽诱导顺式而 非反式ρΤ231-τ，但这两种异构体都有效地通过它们各自的mAb处理被去除（图12Α)。顺 式mAb有效地抑制胁迫-诱导的微管破坏（图12B)、由活和死细胞染料染色显示的神经元 死亡（图12C)、以及通过PARP裂解（图12D)或膜联蛋白V FCAS (图12E)的细胞凋亡，而 反式mAb增强这些表型。
[0063] 图13A和13B是这样的结果，其显示顺式而非反式mAb完全阻断分泌的顺式P- τ 在受体神经元中诱导神经毒性。在营养耗尽后48小时，顺式而非反式P-τ被分泌到培养 基中（图13Α)。将在48小时收集的细胞培养基用顺式或反式mAb或对照进行孵育，随后使 用蛋白G去除该mAb，之后添加到受体神经元持续3天（图13B)。
[0064] 图14是一系列免疫染色的结果，显示顺式而非反式mAb完全阻断人AD脑裂解物 在受体神经元中诱导神经毒性。人AD脑裂解物用顺式或反式mAb孵育、随后使用蛋白G去 除该mAb，之后添加到受体神经元持续3天。
[0065] 图15A-1?是结果，显示顺式P- τ随着TBI严重性增加并且在TBI小鼠脑中在其 他τ表位之前很久显现。图15Α是一个印迹，表明顺式P-τ随着TBI严重性增加，如在采 用不同的重物坠落高度造成的TBI之后2周对脑样品进行的免疫印迹所示。图15Β和图 15C是免疫染色结果，显示稳健的顺式而非反式P-τ以一种时间依赖性方式在TBI后显现， 如针对顺式或反式P-τ和DNA通过免疫染色所示。图1?示出了 TBI 2周后脑中稳健的 顺式口-1而非4了8、了63、41'100、或？册1的存在。
[0066] 图16A-16C是结果，显示顺式mAb有效地消除顺式ρΤ231- τ诱导并且在小鼠脑 在单次严重TBI之后抑制细胞死亡。IP或IV注射生物素-顺式mAb后72小时，针对生物 素-顺式mAb对小鼠脑切片进行染色（图16A)。将三只小鼠经受单次严重TBI，并用顺式 mAb或对照IgG每四天一次持续三次进行处理，然后在TBI两周后针对顺式ρ-τ和总τ (图 16Β)或针对裂解的PARP作为细胞凋亡的标记进行免疫印迹（图16C)。
[0067] 图17Α和17Β是结果，显示单次严重TBI后顺式mAb有效地恢复微管破坏、线粒体 破坏和强迫性行为缺陷。使小鼠经受单次严重TBI并用顺式mAb或对照IgG每四天一次共 三次持续两周进行处理以用于电子显微术分析（图17A)，并且随后每周一次持续两个月进 行行为测试（图17B)。
[0068] 详细说明
[0069]总体而言，本发明涉及用于产生和使用构象-特异性抗体或其片段的多种方法和 组合物。我们已经发现，顺式而非反式ρΤ231_τ是一个极早期致病性构象，在AD中导致τ 蛋白病变和记忆丧失。我们已研发了一种定量ELISA测定以表明，顺式P- τ在对照脑脊液 (CSF)中不可检测，顺式和反式ρ-τ两者在AD中均升高，其中顺式水平大大高于反式，并且 顺式：反式比率是增加的且在AD患者中类似。这些结果连同在此描述的构象-特异性抗体 的产生提供了一种新颖的方法来诊断和治疗AD和处于早期致病性阶段的其他τ蛋白病变 (通过检测顺式ΡΤ231- τ，采用反式ρΤ231- τ作为内部对照）。
[0070] PPI酶和PPI酶底物的顺式/反式构象
[0071] 脯氨酸是一种氨基酸残基，独特之处在于其采用顺式或反式构象的能力。由于其 异构化的相对大的能量屏障（ε U= 14至24kcal mol ^，非催化性异构化是一个缓慢的 过程，但是可以被PPI酶加速。PPI酶有助于蛋白质折叠并且包括，例如，亲环蛋白（Cyp)、 FK506-结合蛋白（FKBP)和细小蛋白样PPI酶（例如，Essl和Pinl)。
[0072] Pinl (与NIMA(从未存在于有丝分裂A中）_1具有相互作用的蛋白质）特异性地 异构化某些多肽的磷酸化Ser/Thr-Pro (pSer/Thr-Pro)基序，这是重要的，因为脯氨酸-定 向激酶（例如，蛋白激酶，磷酸化脯氨酸残基之前的某些Ser/Thr残基）并且磷酸酶是构 象-特异性的且通常仅作用于反式构象。Pinl具有双结构域结构，包括一个N-末端醫结 构域和一个C-末端PPI酶结构域，并且结构-功能分析已经显示Pinl针对特异性pSer/ Thr-Pro基序的独特底物特异性是由于由Wff结构域和PPI酶结构域两者提供的相互作用造 成的。Pinl的PPI酶活性促进以下项的调节，例如，生长-信号应答、细胞周期进展、细胞胁 迫应答、神经元功能和免疫应答。
[0073] Pinl的示例性底物（各自包含能够异构化的基序），列于表1中。还列出了底物 异构化的功能性结果。
[0074] 表1. Pinl 底物
[0079] 还已经论述了磷酸化-独立的脯氨酰基异构化的重要性。例如，PPI酶Cyp A催 化在Crk蛋白的Gly237-Pro238位置处的脯氨酰基键的顺式-反式异构化。以磷酸化-独 立的方式异构化的其他PPI酶底物包括但不限于，类固醇受体、c-Myb、H3P30、H3P38、Itk、 5-羟色胺类型3 (5-HT3)受体，噬菌体尖端蛋白G3P、人免疫缺陷病毒-I (HIV-I)病毒颗粒 的Gag聚蛋白、细胞内f丐释放通道、Crk II/Crk L蛋白、中心体蛋白55kDa(Cep55)、逆转录 病毒Rel蛋白、PKB/Akt、人T细胞白血病病毒类型l(HTLV-l)Tax癌蛋白、Stat3、HER 2/ Neu、缺刻蛋白（Notch)、FAK、F0X0、PML、C/EBP、以及 SMRT。PPI 酶活性的失调（例如，PPI 酶活性的上调或下调（例如，增加或减少PPI酶活性））可以，例如，导致PPI酶底物中存在 的更大顺式或反式含量的Ser/Thr-Pro基序，这可影响PPI酶底物的功能并且导致例如，细 胞增殖障碍、神经障碍、哮喘、衰老相关障碍和τ蛋白病变的发展（例如，参见图1和2)。
[0080] 构象-特异性抗体
[0081] 本发明描述了用于产生和使用构象-特异性抗体或其片段的方法和组合物。构 象-特异性抗体可以，例如，特异性地结合至一种多肽的顺式或反式构象上。在一个具体的 实施例中，本发明的构象-特异性抗体可以结合至一种多肽（例如，顺式ρΤ231_τ或反式 ρΤ231-τ)的磷酸化或未磷酸化的Xaa-Pr0基序的顺式或反式构象上。Xaa-Pr 0基序可以 是一种多肽（例如，一种Pinl底物（例如，ρΤ231- τ ))的磷酸化Ser/Thr-Pro基序。一种 构象特异性抗体与其抗原（例如，一种Pinl底物，例如ρΤ231- τ )的结合可用于治疗、诊断 或监测一种障碍或一种障碍的进展。
[0082] 用于制备和使用用于治疗目的的抗体的方法在此进行了描述，并且，例如，描述 于在美国专利号 6, 054, 297 ;5, 821，337 ;6, 365, 157 ;和 6, 165, 464、国际申请号 PCT/US 2012/035473、以及美国专利【申请号】13/504,700中，将其通过引用结合在此。
[0083] 抗原
[0084] 本发明的构象特异性抗体可以使用免疫原性抗原（例如、抗原肽）产生，免疫原 性抗原包含，例如，一种磷酸化的或未磷酸化的Xaa-Pro基序，其中Xaa是固定为一个特 定构象（例如，顺式或反式构象）或混合的顺式和反式构象的任何氨基酸残基（例如，丝 氨酸或苏氨酸）或能够顺式/反式异构化的任何其他基序或氨基酸序列。例如，本发明 的磷酸化或未磷酸化的、含Ser/Thr-Pro的抗原性肽的顺式或反式含量可以通过（Z)-和 (E)-稀经模拟物的立体选择性合成通过斯蒂尔-维蒂希（Still-Wittig)和爱尔兰-克莱 森（Ireland-Claisen)重排（有机化学杂志（J. Org. Chem. )，68 :2343-2349, 2003 ;通过引 用结合在此）固定。可替代地，本发明的磷酸化或未磷酸化的、含Ser/Thr-Pro的抗原性 肽的顺式或反式含量可以通过用脯氨酸类似物取代脯氨酸氨基酸残基来增加或固定。脯 氨酸类似物包括但不限于高脯氨酸、六氢吡啶羧酸（Pip)、二甲基脯氨酸（DMP)、氮杂环丁 烷-2-羧酸（Aze)、叔丁基-L-脯氨酸（TBP)、反式-4-氟-L-脯氨酸（t-4F-Pro)、以及顺 式-4-氟-L-脯氨酸（c-4F-Pro)。给定抗原的顺式或反式含量可以通过，例如，核磁共振 (NMR)分析进行分析。
[0085] 本发明的抗原性肽可以包含一种磷酸化或未磷酸化Xaa-Pro基序，其中Xaa是能 够顺式/反式异构化的任何氨基酸残基（例如，丝氨酸或苏氨酸）。该抗原性肽可以包含 Pinl底物（其实例被提供于表1中）的Xaa-Pro基序的氨基酸残基，其中该脯氨酸残基被 一个脯氨酸类似物取代。该抗原性肽还可以包含一种全长多肽的Xaa-Pro基序的氨基酸残 基。该抗原性肽可以进一步包含围绕该全长多肽的Xaa-Pro基序的另外的残基。例如，该 抗原性肽可以包含到全长多肽的Xaa残基的3-10个氨基酸残基N-末端以及到全长多肽的 脯氨酸的3-10个氨基酸残基C-末端。本发明的抗原肽可以是，例如，至少4、5、6、7、或8个 氨基酸残基的长度。该抗原性肽可以是8和20个氨基酸残基之间的长度（例如，8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个氨基酸残基的长度）或可以是超过20个氨基酸残 基的长度。
[0086] 通过本领域技术人员已知的多种方法中的任一种可产生和纯化此类抗原。通过， 例如，固相化学合成、体外转录/翻译、或通过重组技术可以产生和纯化抗原性肽。抗原性 肽可以任选地被化学偶联到一种载体蛋白质上或肽可以产生为融合蛋白以增加抗原性。抗 原性肽可以基于它们诱导构象-特异性抗体产生的能力进行筛选。在这个方面，此类筛选 技术可以包括，但不局限于，酶联免疫吸附测定（ELISA)、免疫沉淀、或其他免疫测定。
[0087] 在构象-特异性抗体生产中有用的示例性抗原包括包含一种磷酸化的或未磷酸 化的 Ser/Thr-高腫氨酸、Ser/Thr-Pip、Ser/Thr-DMP、Ser/Thr-Aze、Ser/Thr-TBP、Ser/ Thr-t-4F-Pro、Ser/Thr-c-4F_Pro基序的抗原。此类抗原的具体实例包括，例如，pT668_Pip 和 PT668-DMP APP 肽（VDAAV-pT668-Pr〇-EERHLSK)、pT231-Pip τ 肽、以及 pT231-DMP τ 肽 (KVAVVR-pT231-Pr〇-PKSPS)。其他示例性抗原也描述于美国专利申请公开号2008/0058276 中，将其通过引用结合在此。此类肽可以用作抗原以产生，例如，多克隆或单克隆抗体（例 如，兔或小鼠单克隆抗体）。
[0088] 在优选实施例中，本发明的抗原将结合至具有以下序列的可变区：
[0089] 顺式 mAb_#113
[0090] 重链 CDR
[0091] CDR I :SYWIH(SEQ ID NO :1)
[0092] CDR 2 :VIDPSDSYTRYNQKFKG(SEQ ID NO :2)
[0093] CDR 3 :WEVDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO :3)
[0094] 顺式 mAb_#113
[0095] 轻链 CDR
[0096] CDR I :RSSQSLVHSDGNTYLH(SEQ ID NO :4)
[0097] CDR 2 :KVSNRFS(SEQ ID NO :5)
[0098] CDR 3 :SQSTHVPWT(SEQ ID NO :6)
[0099] 顺式 mAb_#74
[0100] 重链 CD