R
[0101] CDR I : SGYYWN (SEQ ID NO : 7)
[0102] CDR 2 :YISYDGSNNYNPSLKN(SEQ ID NO :8)
[0103] CDR 3 :LRRDAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO :9)
[0104] 顺式 mAb_#74
[0105] 轻链 CDR
[0106] CDRl :RASQDISNYLN(SEQ ID NO :10)
[0107] CDR2 :YTSRLHS (SEQ ID NO : 11)
[0108] CDR3 ：QQGNTLPffT (SEQ ID NO ：12)
[0109] 反式 mAb_#25
[0110] 重链 CDR
[0111] CDRl :DTYMH(SEQ ID NO :13)
[0112] CDR2 :RIDPANGNTRYDPKFQG(SEW ID NO :14)
[0113] CDR3 :RVGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO :15)
[0114] 反式 mAb_#25
[0115] 轻链 CDR
[0116] CDR I:KSSQSVLYSSDLKNYLA(SEQ ID NO :16)
[0117] CDR 2 :WASTRES (SEQ ID NO : 17)
[0118] CDR 3 :HQYLSSYT(SEQ ID NO :18)
[0119] 反式 mAb_#69
[0120] 轻链 CDR
[0121] CDR I :KSSQSLLYTGNQKNYLA(SEQ ID NO :19)
[0122] CDR 2 :WASTRES (SEQ ID NO : 20)
[0123] CDR 3 :QQYYSYPWT(SEQ ID NO :21)
[0124] 构象特异性抗体的产生和纯化
[0125] 本发明的抗原可用于通过本领域中已知的任何方法产生，例如，单克隆的、多克隆 的、嵌合的、人源化的、或重组构象-特异性抗体。这些方法包括由如以下文献描述的免 疫学方法：科勒（Kohler)和米尔斯坦（Milstein)(自然（Nature) 256 :495-497,1975 和 欧洲免疫学杂志（Eur.J. Immunol. )6 :511-519,1976)以及坎贝尔（Campbell)( "单克隆 抗体技术，嗤齿动物和人杂交瘤的产生和表征（Monoclonal Antibody Technology，The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas)'，，伯登（Burdon) 等人编辑，生化与分子生物学实验室技术（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology)，卷 13,愛思唯尔科学出版社（Elsevier Science Publishers)，阿姆 斯特丹，1985)，连同由休斯（Huse)等人，（science (科学）246 :1275-1281,1989)描述的重 组DNA方法。
[0126] 简言之，本发明的抗原可以与佐剂组合，给予至宿主动物（例如，兔、小鼠、山羊、 绵羊、或鸡）。此类抗原的给予可以通过多种方法中的任一种来完成，这些方法包括，但不 限于，皮下或肌内注射。一旦被给予，监测宿主动物中产生的抗体滴度的结果，这可以通过 在本领域中熟知的多种技术中的任何一种来进行（例如，常规抽血），其中分离抗血清（例 如，经由离心），并且此后筛选对于例如一种多肽或多肽片段的顺式或反式构象具有结合亲 和力的抗体的存在。筛选所希望的抗体可以通过以下技术完成，包括，例如，放射免疫测定、 ELISA、夹心免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、原位免疫测定（例如，使用胶体 金、酶、或放射性同位素标记）、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定（例如，凝胶凝集测定或血 细胞凝集测定）、补体固定测定、免疫荧光测定、蛋白质A测定、以及免疫电泳测定。
[0127] 可以对从宿主动物得到的抗血清进行亲和纯化以得出用于本发明的抗体。抗血清 可以通过常规技术纯化，例如将抗血清引入到一个分离柱中。本发明的这些抗原可以被固 定在柱上来分离和纯化构象-特异性抗体。例如，一种包含Ser/Thr-DMP基序的抗原肽（用 于产生一种顺式-特异性抗体）可以被固定在一个柱上并且用于从例如反式构象抗体纯化 所得顺式-特异性抗体。然后可以将该柱洗涤以去除对固定在该柱上的抗原不具有特异性 的抗体，其中将剩余的构象-特异性抗体最终从该柱洗脱。然后可以按照本领域技术人员 已知的常规实践储存分离的构象-特异性抗体。
[0128] 可替代地，可筛选抗体文库（例如，天然抗体文库、合成抗体文库、半合成抗体 文库，或组合文库）以用于鉴定构象-特异性抗体。此类文库可商购自多种来源（例 如，剑桥抗体公司（Cambridge Antibody)，剑桥，英国，基纳塔斯堤斯公司（Genetastix Corporation)，太平洋西北部实验室（Pacific Northwest Laboratory)，里奇兰 (Richland)，华盛顿特区（Washington)，和莫弗西斯公司（MorphoSys AG)，慕尼黑 (Munich)，德国（例如，HuCal GOLD))。参见，例如，美国专利号 6, 696, 248 ;6, 706, 484; 6, 828, 422 ;和7, 264, 963,将其通过引用结合在此。
[0129] 可以通过使用本领域技术人员已知的方法中的一种进行抗体文库的筛选，该方法 包括，例如，噬菌体展示、选择性感染噬菌体、多核糖体技术、和用于酶活性或蛋白质稳定性 的测定系统。可以，例如，通过相对应的核酸序列的测序，通过氨基酸测序、或通过质谱法鉴 定具有所希望的特性的抗体。通过用不同序列（例如，随机序列）代替子-序列并且然后重 复该筛选步骤一次或多次进行优化。可以对这些抗体针对以下项进行筛选，例如，对于一种 靶分子（例如，一种靶分子的顺式或反式构象）的优化的亲和力或特异性、优化的表达量、 优化的稳定性、或优化的溶解度。
[0130] 本发明的构象特异性抗体识别并且特异性地结合至其互补抗原的例如一个特定 构象（例如，顺式或反式构象）。例如，如在此所描述，该构象特异性抗体可以特异性地结合 至一种多肽（例如，Pinl底物的Ser/Thr-Pro基序，例如，ρΤ231- τ )的磷酸化或未磷酸化 Xaa-Pro基序的顺式构象上，但不会特异性结合于该多肽的磷酸化的或未磷酸化Xaa-Pro 基序的反式构象上。在这种情况下，构象-特异性抗体与其抗原之间的Kd是例如至少约 10 4MUO 5MUO 6MUO 7MUO SM、10 9MUO 10MUO ηΜ、或 10 12M 或更高。除 了结合特异性，构 象-特异性抗体与Xaa-Pro基序的一种构象（例如，顺式构象）具有比另一种构象（例如， 反式构象）高例如至少10至100倍的亲和力。该构象-特异性抗体与一种构象（例如，顺 式构象）的亲和力可以比另一种构象（例如，反式构象）高例如，至少IO 3倍、IO4倍、IO5倍、 IO6倍、10 7倍、10 8倍、10 9倍、或 10 10倍。
[0131] 本发明的特征还在于根据本发明方法开发的、基于若干种新单克隆抗体的抗体。 这些抗体的序列，及其互补决定区（CDR)在下文列出。
[0132] 顺式 mAb_#113
[0133] 重链 CDR
[0134] CDR I :SYWIH(SEQ ID NO :1)
[0135] CDR 2 :VIDPSDSYTRYNQKFKG(SEQ ID NO :2)
[0136] CDR 3 :WEVDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO :3)
[0137] SEQ ID NO :22(重链全长蛋白序列）
[0138] MGVSLQLLGT QDLTMRffSCI ILFLVATATG VNSQVQLQQP GAELVKPGAS VKMSCKASGY
[0139] TFTSYffIHffV KQRPGQGLEff IGVIDPSDSY TRYNQKFKGK ATLTVDTSSS TAYMQLSSLT
[0140] SEDSAVYYCT TffEVDYffGQG TTLTVSSAKT TPPSVYPLAP GSL
[0141] SEQ ID NO : 29 (重链全长核酸序列）
[0142] ATGGGGGTCTCTCTACAGTTACTAGGCACACAGGATCTCACCATGAGATGGAGCTGTATCATCCTCTTC TTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCAACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGC TTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTG GACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAGGTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAG GCCACGTTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGT CTATTACTGTACAACATGGGAGGTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACAACAC CCCCATCAGTCTATCCCCTGGCCCCTGGAAGCTTGGG
[0143] 顺式 mAb_#113
[0144] 轻链 CDR
[0145] CDR I :RSSQSLVHSDGNTYLH(SEQ ID NO :4)
[0146] CDR 2 :KVSNRFS(SEQ ID NO :5)
[0147] CDR 3 :SQSTHVPWT(SEQ ID NO :6)
[0148] SEQ ID NO : 23 (轻链全长蛋白序列）
[0149] MGTDQSPQAV SSGCLLKMKL PVRLLVLMFff IPASNSDVVM TQTPLSLPVS LGDQASISCR
[0150] SSQSLVHSDG NTYLHffYLQK PGQSPKLLIY KVSNRFSGVP DRFSGSGSGT DFTLKISRLE
[0151] AEDLGVYFCS QSTHVPffTFG GGTKLEIKRA DAAPTVSIFP PSSKLG
[0152] SEQ ID NO :30 (轻链全长核酸序列）
[0153] ATGGGGACTGATCAGTCTCCTCAGGCTGTCTCCTCAGGTTGCCTCCTCAAAATGAAGTTGCCTGTTAGG CTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAACAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGT CAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTCCACAGTGATGGAAACACCTATTTAC ATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCA GACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGACTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGT TTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATG CTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGG
[0154] 顺式 mAb_#74
[0155] 重链 CDR
[0156] CDR I : SGYYWN (SEQ ID NO :7)
[0157] CDR 2 :YISYDGSNNYNPSLKN(SEQ ID NO :8)
[0158] CDR 3 :LRRDAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO :9)
[0159] SEQ ID NO :24(重链全长蛋白序列）
[0160] MKVLSLLYLL TAIPGILSDV QLQESGPGLV KPSQSLSLTC SVTGYSITSG YYffNWIRQFP
[0161] GNKLEffMGYI SYDGSNNYNP SLKNRISITR DTSKNQFFLK LNSVTTEDTA TYYCAGLRRD
[0162] AYffGQGTLVT VSAAKTTPPS VYPLAPGSL
[0163] SEQ ID NO :31 (重链全长核酸序列）
[0164] ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAG GAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAG TGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTA GCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAG TTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCGGGGTTACGACGTGATGCTTACTGGGGCCAAGG GACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTGGCCCCTGGAAGCTTGGG
[0165] 顺式 mAb_#74
[0166] 轻链 CDR
[0167] CDR I :RASQDISNYLN(SEQ ID NO :10)
[0168] CDR 2 :YTSRLHS(SEQ ID NO :11)
[0169] CDR 3 :QQGNTLPWT(SEQ ID NO :12)
[0170] SEQ ID NO :25(轻链全长蛋白序列）
[0171] MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP
[0172] DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPffTFGG
[0173] GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSKLG
[0174] SEQ ID NO :32 (轻链全长核酸序列）
[0175] ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAG ATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACAT TAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTAC ACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAA GAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAAT CAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGCTTGGGG
[0176] 反式 mAb_#25
[0177] 重链 CDR
[0178] CDR I :DTYMH(SEQ ID NO :13)
[0179] CDR2 :RIDPANGNTRYDPKFQG(SEW ID NO :14)
[0180] CDR 3 :RVGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO :15)
[0181] SEQ ID NO :26(重链全长蛋白序列）
[0182] MKCSffVIFFL MAVVTGVTSE VQLQQSGAEL VKPGASVKLS CTASGFNIKD TYMHffVKQRP
[0183] EQGLEffIGRI DPANGNTRYD PKFQGKATIT SDTSSNTAYL QLSSLTSEDT AVYYCARRVG
[0184] YYFDYffGQGT TLTVSSAKTT PPSVYPLVPG SL
[0185] SEQ ID NO :33 (重链全长核酸序列）
[0186] ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCACTTCAGAGGTTCAGC TGCAGCAGTCTGGGGCAGAACTTGTGAAACCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACA TTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTG CGAATGGTAATACTAGATATGACCCAAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACATCAGACACATCCTCCAACACAG CCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGCGGGTGGGGTACTACT TTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCCCTGG TCCCTGGAAGCTTGGG
[0187] 反式 mAb_#25
[0188] 轻链 CDR
[0189] CDR I :KSSQSVLYSSDLKNYLA(SEQ ID NO :16)
[0190] CDR 2 :WASTRES(SEQ ID NO :17)
[0191] CDR 3 :HQYLSSYT(SEQ ID NO :18)
[0192] SEQ ID NO :27(轻链全长蛋白序列）
[0193] MESQTQVFLS LLLffVSGTCG NIMMTQSPSS LAVSAGEKVT MSCKSSQSVL YSSDLKNYLA
[0194] WYQQKPGQSP TLLIYffASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVQAEDLA VYYCHQYLSS
[0195] YTFGGGTKLE IKRADAAPTV SIFPPSSK
[0196] SEQ ID NO :34(轻链全长核酸序列）
[0197] ATGGAATCACAGACTCAGGTCTTCCTCTCCCTGCTGCTCTGGGTATCTGGTACCTGTGGGAACATTATG ATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTGT TTTATACAGTTCAGATCTGAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTACACTGCTGATCT ATTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACC ATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGTACACGTTCGGAGGGGG GACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTAAGC
[0198] 反式 mAb_#69
[0199] 轻链 CDR
[0200] CDR I:KSSQSLLYTGNQKNYLA(SEQ ID NO :19)
[0201] CDR 2 :WASTRES(SEQ ID NO :20)
[0202] CDR 3 :QQYYSYPWT(SEQ ID NO :21)
[0203] SEQ ID NO :28 (轻链全长蛋白序列）
[0204] MDSQAQVLML LLLffVSGTCG DIVMSQSPSS LAVSVGEKVT MSCKSSQSLL YTGNQKNYLA
[0205] WYQQKPGQSP KLLIYffASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVKAEDLA VYYCQQYYSY
[0206] PffTFGGGTKL EIKRADAAPT VSIFPPSSKL G
[0207] SEQ ID NO :35 :(轻链全长核酸序列）
[0208] ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTG ATGTCACAATCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCT TTTATATACTGGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTT ACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACC ATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCGTG