行病理学检查以观察造模情况。病理检查证实造模成功后，将存活的肝纤 维化大鼠71只随机分为5组:模型对照组、PDTC阳性对照组(PDTC组）、满天星异红草苷高剂 量组(Ι0ΑΗ组）、满天星异红草苷中剂量组（Ι0ΑΜ组）、满天星异红草苷低剂量组（I0AL组）。具 体分组如下： 正常对照组 12只 模型对照组 14只 PDTC阳性对照组(PDTC组） 15只 满天星异红草苷低剂量组(I0AL组） 14只 满天星异红草苷中剂量组(Ι0ΑΜ组） 14只 满天星异红草苷高剂量组(Ι0ΑΗ组） 14只 造模16周后，开始给药，PDTC组灌胃给予PDTC 150mg/kg，Ι0Α高、中、低剂量组分别灌胃 给予IOA 100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg。模型组及正常对照组则灌胃给予等量生理盐水，每 天1次，每周称重1次，根据体重调整给药量，连续给药8周。另外，除正常组外，每只大鼠仍继 续腹腔注射猪血清，每只〇.5ml，每周2次。
[0019] 第8周给药结束时，大鼠眼球取血，处死，快速取出肝脏，一部分-80°C保存，另一 部分用10%福尔马林固定。
[0020] (2)检测指标 ① 肝组织病理学观察:常规病理检察； ② 血清ALT，AST，ALP和GGT的活力； ③ IL-l，IL-10，TNF-a，TGF-m的检测； ④ S0D和MDA的检测； ⑤ HA，LN，Hyp，ΡΙΠΝΡ，Col-I，Col-IV的检测； ⑥ 免疫组化检测肝组织NF-kB p50、TNF-a、ΜΜΡ-9、??ΜΡ-1和ICAM-1的表达； ⑦ RT-PCR检测肝组织Col-I、Col-m、NF-KB ρ65、ΙκΒ-α和TGF-βΙ mRNA的表达； ⑧ Western blot检测NF-κΒ p65、磷酸化NF-κΒ p65、NF_KB ρ50、ΙκΒ_α、磷酸化ΙκΒ-α、 ΙΚΚ-β和Col-I蛋白的表达。
[0021] (3)实验结果： 1、肝组织病理检查情况 通过病理学检查显示，正常组大鼠肝小叶结构清晰且完整，肝细胞索以中央静脉为中 心，向四周呈放射状排列，肝细胞未见变性、无炎细胞浸润，未见病理性改变，只有极少量 细小的蓝色纤维。模型组大鼠汇管区炎性细胞、坏死细胞增多，肝小叶结构紊乱，细胞索排 列紊乱，纤维间隔增厚，成纤维细胞大量增生，大量纤维生成，并可见假小叶形成。满天星异 荭草苷组大鼠可观察到肝组织病理损伤比模型模型组明显减轻。
[0022] 2、大鼠肝脏指数 模型组大鼠肝脏指数高于正常组大鼠，经药物干预后，I0AL、I0AM、I0AH均能显著降低 升高的肝指数，（P<〇.01) JDTC能降低升高的肝指数，但无显著性意义。结果见表1。
[0023] 3、血清厶1^，厶51'，厶1^，661'活性 与正常组相比较，模型组血清大鼠血清ALT、AST均高于正常组大鼠，经药物干预后， roTC与10AL、10ΑΜ、10ΑΗ血清中ALT、AST的含量均降低但无显著性意义;模型组大鼠 ALB/GLB (A/G )值低于正常组大鼠，给予药物后，PDTC与IOAM、IOAH血清A/G值升高但无显著性意义。 结果见表2。
[0024] 4、血清1^、拟、取口含量 模型组大鼠血清LN、HA、Hyp均高于正常组大鼠，经药物干预后，PDTC与Ι0ΑΗ均能显著降 低血清中LN、HA、Hyp的含量，其中I0AL、I0AM还能显著降低血清中HA、Hyp的含量(p<0.05或 p<0.01)。结果见表3。
[0025] 5、血清 Col-I、Col-IV、PinNP 含量 与正常组相比，模型组大鼠血清Col-I、Col-IV、PinNP含量均显著升高，经药物干预 后，？01'(：与1(^1^、1(^1、1(^!1均能显著降低血清中(：〇1-1、(：〇1-1￥、？111陬含量，（？<0.05或口 <0.01)。结果见表4。
[0026] 6、血清SOD和MDA含量 模型组大鼠 SOD低于正常组大鼠，MDA则高于正常组大鼠，给予药物后，PDTC与IOAL、 ΙΟΑΜ、Ι0ΑΗ均能升高SOD的含量，并降低MDA含量(p<0.05或p<0.01)。结果见表5。
[0027] 7、肝组织中S0D和MDA活性 模型组大鼠 S0D低于正常组大鼠，MDA则高于正常组大鼠，给予药物后，PDTC与Ι0ΑΜ、 Ι0ΑΗ均能升高S0D的含量，并降低MDA含量，同时I0AL还能显著性降低MDA含量(p<0.05或p <0.01)。结果见表6。
[0028] 8、肝组织了陬-〇、丁6卩-01、比-1、几-1〇含量 模型组大鼠肝组织TNF-a、IL-l、TGF-m含量均高于正常组大鼠，IL-10含量则低于正常 组大鼠，经药物干预后，PDTC与10AL、10ΑΜ、10ΑΗ均能显著降低肝组织中TNF-α、IL-1、TGF-βΙ 的含量，并提高肝组织中IL-10的含量(p<0.05或p<0.01)。结果见表7。
[0029] 9、免疫组化法测定 NF-KBp50、TNF-a、ΜΜΡ-9、??ΜΡ-1 和 ICAM-1 蛋白 正常对照组大鼠肝细胞胞浆内较少表达NF-κΒ p50、TNF-a、ΜΜΡ-9、??ΜΡ-1和ICAM-1，模 型组大鼠肝组织细胞胞浆中的NF-kB p50、TNF-a、HMP-l和ICAM-1蛋白的表达均显著高于 正常组，而模型组大鼠肝组织细胞胞浆中MMP-9蛋白的表达低于正常组，但无显著性差异。 经药物治疗后，PDT与I0AH、I0AM、I0AL均显著下调肝组织细胞胞浆中NF-κΒ p50、TNF-a、 ??ΜΡ-1和ICAM-1蛋白的表达(p<0.01)。然而给药后，PDTC与I0AH、I0AM、I0AL则能上调肝组 织细胞胞浆中MMP-9蛋白的表达(p<0.01)。结果见表8。
[0030] 1〇、1^-?〇?检测肝组织(：〇1-1、(：〇1-111、陬-仙？65、1咄-〇和了6卩-011111?熟的表达 模型组大鼠肝组织Col-I、Col-m、NF-KB p65和TGF-βΙ mRNA的表达高于正常组大 鼠，ΙκΒ-α mRNA的表达低于正常组大鼠，经药物干预后，PDTC与I0AH、I0AM、I0AL能明显降低 Col-I、Col-m、NF-KB p65 和TGF-βΙ mRNA的表达，升高ΙκΒ-α mRNA的表达(ρ〈0·05)。结果 见表9。
[0031] ll、Western blot检测肝脏的NF-κΒ ρ65、磷酸化NF-κΒ p65、NF_KB ρ50、ΙκΒ_α、磷 酸化ΙκΒ-α、ΙΚΚ-βΧο1-Ι蛋白的表达 Western blot分析结果显示，模型组大鼠肝组织中NF-κΒ ρ65、Ρ- NF-κΒ p65、NF-KB ?5〇、？-1咄-€[、11(1(-0、(：〇1-1的相对表达量显著高于正常组(？<〇.〇1)，经药物处理后?〇1'(：与 10八!1、1(^1、1(^1^均能显著下调肝组织陬-仙？65、？-陬-仙口65、陬-仙？50、？-1咄-〇、11?-i3、Col-I的表达(p<0.01)。此外，模型组大鼠肝组织中ΙκΒ-α的相对表达量显著高于正常组 (?<0.01)，经药物处理后，1(^!1、1(^1均能显著上调1仙-€[的表达( ？<0.05，？<0.01)。结果 如表10、11。
【主权项】
1. 满天星异荭草苷在制备治疗免疫性肝纤维化药物中的应用，所述的满天星异荭草苷 是按照以下方法制备而得的： 提取方法:干燥的满天星10 kg粉碎后，用80L的75%乙醇回流提取3次，合并3次乙醇提 取液，回收乙醇，得到乙醇提取物315.7g;乙醇提取物加入630ml蒸馏水摇匀成悬浮液，接着 分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取方法简述如下：首先，用630ml石油醚萃取， 弃石油醚液;接着，用630ml乙酸乙酯萃取，弃乙酸乙酯液;最后，用630ml正丁醇萃取，回收 正丁醇，得正丁醇萃取物177.6 g; 纯化方法:正丁醇萃取物上D101型大孔树脂，先用5倍量水洗脱后，再用10倍量90%的 甲醇洗脱，回收甲醇，得粗提物;将粗提物溶于甲醇，与等量硅胶拌样，上样于硅胶柱，以甲 醇-乙酸乙脂-水不同比例即3:3:2; 4:3:2; 5:3:2; 6:3:2;7:3:2 ;8:3:2;9:3:2; 10:3:2， 进行梯度洗脱； 薄层色谱跟踪，合并相似馏分； 合并用比例为4:3: 2; 5:3: 2; 6:3: 2; 7 :3:2的甲醇-乙酸乙脂-水洗脱的馏分，再经3次 硅胶柱层析后再次合并相似馏分，回收洗脱剂，得淡棕色结晶28.3 mg。2. 所述的满天星异荭草苷应用于治疗免疫性肝脏炎症。3. 所述的满天星异荭草苷应用于治疗免疫性慢性肝损伤。4. 所述的满天星异荭草苷应用于治疗免疫性肝纤维化。
【专利摘要】本发明公开了一种中药活性成分满天星异荭草苷在制备治疗免疫性肝纤维化药物中的应用研究。首次对满天星异荭草苷治疗免疫性肝纤维化进行了研究，通过动物实验表明，满天星异荭草苷可作用于免疫性肝损伤的多个环节或多个靶点，主要通过NF-κB信号转导通路达到作用。可有效的抑制脂质过氧化反应、减轻肝组织病理损伤、抑制胶原沉积、抑制基质金属蛋白酶、阻断NF-κB信号转导通路，使肝损伤明显减轻，对防治肝损伤具有独特优势。满天星异荭草苷对猪血清引起的肝损伤具有明显抑制作用，是治疗免疫性肝纤维化的一种非常有潜在价值的新药。
【IPC分类】A61P37/02, A61P1/16, A61K36/10, A61K31/7048
【公开号】CN105616434
【申请号】CN201610088645
【发明人】黄权芳, 林兴, 吕淑娟, 陈永欣, 黄仁彬, 张士军, 韦玲, 梁春宏
【申请人】黄权芳
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月17日