专利名称：人胎盘干细胞提取物冻干粉及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种冻干粉，特别涉及一种人胎盘干细胞提取物冻干粉及其制备方法
与应用。
背景技术：
人胎盘干细胞提取物，是人胎盘干细胞经过特殊培养后分泌出的多种生命活性物质，包括蛋白质、多肽、细胞生长因子和生物活性因子等多种成分，经过特殊的分离提取工艺和加工手段，将其中的多种有效活性成分浓缩制成的冻干粉状物。人胎盘干细胞提取物中的多种生命活性成分具有复杂的生理作用，每种成分都可以对许多组织器官产生影响， 同时每种形式生理机能的提高也不是单一因子的作用，而是需要多种因子的相互协调作用，因此人胎盘干细胞提取物比单一的细胞因子具有更好的抗衰老、活化机体功能的功效。 长期使用胎盘干细胞提取物具有美容、抗衰老、活化机体机能、细胞新生、紫外损伤修复及提高肌肤免疫力等功效。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法。本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的人胎盘干细胞提取物冻干粉。本发明的再一目的在于提供所述的人胎盘干细胞提取物冻干粉的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，包含以下步骤(I)使用pH值7. O 7. 4、含血清的细胞培养基培养人胎盘间充质干细胞至70 90%融合时，弃其原含血清培养液，使用平衡盐溶液洗涤细胞；(2)去除平衡盐溶液，使用细胞培养基继续培养人胎盘间充质干细胞，培养至细胞培养基变色，收集上清；(3)过滤上清，浓缩上清；再将得到的浓缩上清除菌，得到人胎盘干细胞提取物原溶液；(4)在人胎盘干细胞提取物原溶液加入冻干赋形剂和水，过滤除菌，分装冻干，得到人胎盘干细胞提取物冻干粉；所述的细胞培养基优选为DMEM/F12培养基；步骤⑴中所述的血清优选为胎牛血清；所述的胎牛血清在所述的细胞培养基中的终浓度优选为体积百分比10% ；步骤(I)中所述的pH值7. O 7. 4、含血清的细胞培养基优选还含有抗细菌抗生素；所述的抗细菌抗生素优选为青霉素或链霉素中的一种或两种；
所述的青霉素在所述的细胞培养基中的终浓度优选为200U/ml ；所述的链霉素在所述的细胞培养基中的终浓度优选为200U/ml ；步骤⑴中所述的人胎盘间充质干细胞优选为传代次数为第7 8代的人胎盘间充质干细胞；
步骤(I)中所述的平衡盐溶液优选为Hank’ s液；
步骤(3)中所述的过滤优选为使用孔径为O. 45 μ m的滤膜过滤；
步骤(3)中所述的浓缩优选为采用截留分子量为3KD的过滤膜进行超滤浓缩； 步骤(3)中所述的浓缩程度优选为浓缩至原体积(即步骤(2)得到的上清)的 ,10 ；
步骤(3)中所述的除菌优选为使用孔径为O. 22 μ m的滤膜过滤除菌；
步骤(4)中所述的冻干赋形剂优选为甘露醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖或乳糖中的至
步骤(4)中所述的冻干赋形剂的用量优选为相当于所述的人胎盘干细胞提取物
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少一种
原溶液的最终重量的5 10% ;步骤(4)中所述的水优选为去离子水或超纯水；步骤(4)中所述的过滤除菌优选为使用孔径为O. 22 μ m的滤膜过滤除菌；步骤⑷所述的冻干的条件优选为于-20 -35°C、50 200Pa冻干24 36小时；一种人胎盘干细胞提取物冻干粉，通过上述制备方法制备得到；所述的人胎盘干细胞提取物冻干粉在化妆品和/或保健品中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本发明所提供的人胎盘干细胞冻干粉含有多种生命活性物质，对机体细胞分裂与增殖有极高的激发作用，对老化的机体有全面调节、恢复年轻之功效。它能大幅度提高机体代谢水平，增强生理机能，提高机体免疫力，延长青春期，美化肌肤，增长寿命，延缓衰老。(2)取材方便，原料来源充足。胎盘的采集简便易行，不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。过去胎盘通常作为废物丢弃，现在通过一定的科技手段从胎盘中提取胎盘间充质干细胞并经特殊传代培养，再通过一定的科技手段提取人胎盘干细胞冻干粉不仅技术可行，更是宝贵的生命资源再利用。(3)安全性。试验结果显示，人胎盘干细胞冻干粉性质稳定、功效显著，不易突变， 动物实验证明无毒无致瘤性、致畸性，使用安全可靠。(4)数量充足，使用方便。人胎盘间充质干细胞增殖能力强，培养后数目可达10亿以上，由此提取的人胎盘干细胞提取物数量充足，可以供多人多次使用。经特殊工艺制成的胎盘干细胞提取物冻干粉储存期长，不易降解，使用方便。
图I是人胎盘间充质干细胞的流式细胞仪检测图。图2是人胎盘间充质干细胞的流式细胞仪检测图。图3是人胎盘干细胞提取物SDS-PAGE结果图，其中
泳道I为Marker ;泳道2为胎盘干细胞提取物。图4是人胎盘干细胞提取物对HDF细胞存活率的影响图。图5是人胎盘干细胞提取物对HDF细胞形态的影响图。图6是不同处理方式小鼠皮肤组织中羟脯氨酸含量/正常对照组小鼠皮肤组织中羟脯氨酸含量对比结果图，其中**表示P彡O. 01，*表示P彡O. 05 ;1-阴性对照；2_模型组；3_人胎盘干细胞提取物高剂量组(lOOyg/ml) ;4-胎盘干细胞提取物低剂量组(lyg/ml) ;5_VitC高剂量组 (100 μ g/ml) ；6-VitC 低剂量组(I μ g/ml)。图7是不同处理方式小鼠皮肤组织中I型胶原纤维含量/正常对照组小鼠皮肤组织中I型胶原纤维含量对比结果图，其中**表示P彡O. 01，*表示P彡O. 05 ;1-阴性对照；2_模型组；3_人胎盘干细胞提取物高剂量组(100 μ g/ml) ;4-胎盘干细胞提取物低剂量组(I μ g/ml) ;5_VitC高剂量组 (100 μ g/ml) ；6-VitC 低剂量组(I μ g/ml)。图8是不同处理方式小鼠全血中总抗氧化能力/正常对照组小鼠全血中总抗氧化能力对比结果图，其中**表示P彡O. 01，*表示P彡O. 05 ;1-阴性对照；2_模型组；3_人胎盘干细胞提取物高剂量组(100 μ g/ml) ;4-胎盘干细胞提取物低剂量组(I μ g/ml) ;5_VitC高剂量组 (100 μ g/ml) ；6-VitC 低剂量组(I μ g/ml)。图9是不同处理方式小鼠血浆中T-SOD酶活性/正常对照组小鼠血浆中T-SOD酶活性对比结果图，其中**表示P彡O. 01，*表示P彡O. 05 ;1-阴性对照；2_模型组；3_人胎盘干细胞提取物高剂量组(100 μ g/ml) ;4-胎盘干细胞提取物低剂量组(I μ g/ml) ;5_VitC高剂量组 (100 μ g/ml) ；6-VitC 低剂量组(I μ /ml)。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I(一)人胎盘间充质干细胞(humanplacenta-derived mesenchymal stem cells, hPMSCs)的原代分离、培养、传代及鉴定(I)人胎盘间充质干细胞的原代分离、培养，传代从广东省广州市三甲医院妇产科手术台获得足月、剖宫产、健康母体胎盘，经检验检疫合格后(证实无HIV、HBV等传染性疾病)，在无菌条件下剥除母体蜕膜，剪取小块胚胎蜕膜侧胎盘组织，放入含抗生素的D-Hank' s液(青霉素200U/ml，链霉素200U/ml，pH7. 2) 中,洗尽血液,剔除血管,并剪成I. O 2. 0mm3小块，将组织块按适当密度接种于培养皿，加入含有体积分数15% FBS的DMEM/F12培养液(青霉素200U/ml，链霉素200U/ml，pH7. 2)， 放置于37°C、体积分数5%的CO2饱和湿度培养箱内培养，每3d补加新鲜培养液。当显微镜下观察到组织块周围有呈集落生长的成纤维状细胞时，去除组织块，添加培养液继续培养。约20d后细胞生长达约80 %融合时，用含质量百分比O. 25 %的胰蛋白酶和质量百分比O.02% EDTA的消化液消化，按I X IO4ceIVcm2传代培养，培养液换为体积分数10% FBS的 DMEM/F12培养基(青霉素200U/ml，链霉素200U/ml，pH7. 2)，细胞代数记为Pl代，待细胞达到80 90%融合后，消化，按I X IO4ceIVcm2传代培养，细胞代数记为P2代，以后均按照以上方法传代培养，通过不断传代检测其增殖能力。(2)人胎盘间充质干细胞的鉴定收集P3代细胞，通过流式细胞仪鉴定细胞表面抗原，检测得到细胞能够表达 ⑶29、⑶44、⑶59等干细胞特征性表面抗原(图I)，未表达⑶28、⑶31、⑶34、⑶45等细胞表面抗原(图2)，这与文献报告的间充质干细胞特征一致，说明所分离培养细胞为人胎盘间充质干细胞。( 二)人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备流程(I)人胎盘间充质干细胞培养无血清上清的收集鉴定正确无误的人胎盘间充质干细胞用T-75培养瓶传代扩增，直至第7 8代 (P7 P8)，培养液为含10% (v/v)FBS (胎牛血清)的DMEM/F12培养基(青霉素200U/ml、 链霉素200U/ml，pH7. 2)。每代当细胞增殖至约80%左右融合时，弃其原含血清培养液， Hank’ s液洗2遍，每次5ml。尽量将洗涤的Hank’ s液用吸管吸尽，然后添加无血清、无抗生素的DMEM/F12，培养72h后收集其上清，4°C保存。使用胰酶消化液(0.25% (w/w)胰蛋白酶+0.02% (w/w)EDTA)消化细胞，按I : 2比例传代。当细胞增殖至约80%左右融合时， 继续无血清条件培养收集其上清并传代，直至细胞因无血清培养而增殖明显放慢且形态出现明显变化时，停止其无血清培养。各个批次传代细胞的无血清上清分批收集完毕后，置于-20°C保存，待处理。(2)人胎盘干细胞提取物溶液的制备将多次收集的人胎盘间充质干细胞无血清上清(约1000ml)从_20°C取出，置于室温解冻。O. 45 μ m滤器过滤人胎盘间充质干细胞无血清上清。然后采用截留分子量为3KD 的过滤膜进行人胎盘间充质干细胞无血清上清的浓缩，直至剩余回流液体积约为100 200ml为止。最后将回流液用无菌的O. 22 μ m滤膜过滤除菌后，即为所得的人胎盘干细胞提取物原溶液。(三)人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备测胎盘干细胞提取物蛋白原液浓度，根据测得的人胎盘干细胞提取物蛋白原液浓度，按需冻干溶液的最终重量计加入5 10%冻干赋形剂甘露醇和50 60°C的去离子水混匀并调节蛋白质浓度至终浓度为50.0±0.5118/1111，过滤除菌，按11111量/支分装冻干(冻干温度为-20 -35°C，真空度为50 200Pa，冻干时间为24 36小时)，即制得人胎盘干细胞提取物冻干粉。最终得到的人胎盘干细胞提取物冻干粉蛋白的含量为 50.0±0.5yg/支。(四)人胎盘干细胞提取物冻干粉质量标准⑴外观肉眼观察人胎盘干细胞提取物冻干粉产品为白色、粉末状。按标示量用Iml去离子水溶解后为澄清、透明的淡红色溶液。⑵pH值的测定采用精密pH测试仪检测样品的pH值。首先对pH测试仪进行校正，再对人胎盘干细胞提取物冻干粉水溶液进行检测。人胎盘干细胞提取物水溶液的产品PH值在6. 5 7. 5 之间。(3)蛋白质电泳分析人胎盘干细胞提取物配制12% Tricine-SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶。然后取按标示量配制好的人胎盘干细胞提取物冻干粉水溶液20 μ I加入2 X上样缓冲液，80°C加热40min。加入处理好的样品，每孔20μ l，8mA电流稳流进行电泳约6h，得出的结果如图3所示，人胎盘干细胞提取物的分子量大约为40KD。(4)人胎盘干细胞提取物冻干粉蛋白质含量为50. O ±O. 5 μ g/支。蛋白含量测定方法①标准BSA蛋白溶液取牛血清白蛋白(BSA)标准品，准确稀释至lmg/mL(含质量百分比O. 02%置氣纳)，为标准蛋白质备液。使用时取标准蛋白质贮备液，准确稀释至O. 25g/L，为标准蛋白质工作液(工作液室温24小时内稳定)，即用现配。②取6支管作为标准管绘制标准曲线(concentration/OD值)，按表加入
权利要求
1.一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于包含以下步骤(1)使用pH值7.O 7. 4、含血清的细胞培养基培养人胎盘间充质干细胞至70 90% 融合时，弃其原含血清培养液，使用平衡盐溶液洗涤细胞；(2)去除平衡盐溶液，使用细胞培养基继续培养人胎盘间充质干细胞，培养至细胞培养基变色，收集上清；(3)过滤上清，浓缩上清；再将得到的浓缩上清除菌，得到人胎盘干细胞提取物原溶液；(4)在人胎盘干细胞提取物原溶液加入冻干赋形剂和水，过滤除菌，分装冻干，得到人胎盘干细胞提取物冻干粉。
2.根据权利要求I所述的人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于所述的细胞培养基为DMEM/F12培养基。
3.根据权利要求I所述的人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于步骤 (I)中所述的血清为胎牛血清；步骤(I)中所述的pH值7. O 7. 4、含血清的细胞培养基含有抗细菌抗生素。
4.根据权利要求3所述的人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于所述的胎牛血清在所述的细胞培养基中的终浓度为体积百分比10% ；所述的抗细菌抗生素为青霉素或链霉素中的一种或两种。
5.根据权利要求4所述的人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于所述的青霉素在所述的细胞培养基中的终浓度为200U/ml ；所述的链霉素在所述的细胞培养基中的终浓度为200U/ml。
6.根据权利要求I所述的人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述的人胎盘间充质干细胞为传代次数为第7 8代的人胎盘间充质干细胞；步骤(I)中所述的平衡盐溶液为Hank’ s液。
7.根据权利要求I所述的人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的过滤为使用孔径为O.45 μ m的滤膜过滤；步骤(3)中所述的浓缩为采用截留分子量为3KD的过滤膜进行超滤浓缩；步骤(3)中所述的浓缩程度优选为浓缩至即步骤(2)得到的上清体积的1/5 1/10 ； 步骤(3)中所述的除菌为使用孔径为O. 22 μ m的滤膜过滤除菌。
8.根据权利要求I所述的人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的冻干赋形剂为甘露醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖或乳糖中的至少一种；步骤(4)中所述的冻干赋形剂的用量为相当于所述的人胎盘干细胞提取物原溶液重量的5 10% ;步骤(4)中所述的水为去离子水或超纯水；步骤(4)中所述的过滤除菌为使用孔径为O. 22 μ m的滤膜过滤除菌；步骤(4)所述的冻干的条件为于-20 -35°C、50 200Pa冻干24 36小时。
9.一种人胎盘干细胞提取物冻干粉，通过权利要求I 8任一项所述的制备方法得到。
10.权利要求9所述的人胎盘干细胞提取物冻干粉在化妆品和/或保健品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人胎盘干细胞提取物冻干粉及其制备方法与应用。本发明通过培养人胎盘间充质干细胞，得到其上清，浓缩、冻干，得到人胎盘干细胞提取物冻干粉。该人胎盘干细胞提取物冻干粉性质稳定、功效显著，不易突变，动物实验证明无毒无致瘤性、致畸性，使用安全可靠；而且人胎盘间充质干细胞增殖能力强，培养后数目可达10亿以上，由此提取的人胎盘干细胞提取物数量充足，经特殊工艺制成的人胎盘干细胞提取物冻干粉储存期长，不易降解，使用方便。该人胎盘干细胞冻干粉经检测，能有效在化妆品、保健品等中进行应用。
文档编号A61Q19/08GK102600057SQ201210072079
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者任哲, 舒辉萍, 赵振岭, 陈海佳 申请人:广州赛莱拉生物科技有限公司