一种提高银纳米粒子抗菌活性的方法与流程

本发明属于抗菌材料技术领域，具体涉及一种提高银纳米粒子抗菌活性的方法。

背景技术：

银纳米粒子作为一种广谱的抗菌剂，具有低毒，不易使微生物产生耐药性的特点，被广泛应用于食品、生物医药及环境保护等领域。然而，银纳米粒子比表面积大，属于热力学不稳定体系，极易形成尺寸较大的团聚体，影响其抗菌性能。研究表明，银纳米粒子的抗菌活性主要与其粒子尺寸和稳定性相关。银纳米粒子的尺寸越小，其比表面积越大，粒子与微生物表面接触的几率增加，其抗菌活性越强；此外，粒子稳定性越高，分散性越好，越不易发生聚集，其抗菌活性越强。因此，降低银纳米粒子的尺寸并提升其稳定性是改善银纳米粒子抗菌活性的重要手段。

目前，为解决银纳米粒子团聚而导致抗菌活性降低的问题，专利cn10304227a采用了聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和明胶作为保护剂，制得了一种银纳米粒子溶胶，该溶胶改善了银纳米粒子的分散性，克服了银纳米粒子在使用过程中的团聚现象，增强了其抗菌活性。但该方法较为复杂，难以实现产业化，且仅改善了银纳米粒子的稳定性，并未有效降低银纳米粒子的实际尺寸，抗菌活性的提升有限。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种提高银纳米粒子抗菌活性的方法，解决银纳米粒子抗菌剂稳定性差的问题。

本发明提供的这种提高银纳米粒子抗菌活性的方法，包括以下步骤：

1)银纳米粒子的制备：配制硝酸银和柠檬酸钠的水溶液，混合后，避光震荡，然后加入硼氢化钠冰水混合物，持续震荡，制得黄色的银纳米粒子的溶液；

2)富含胞嘧啶的单链寡核苷酸溶液的制备：将富含胞嘧啶的寡核苷酸用超纯水溶解，得到富含胞嘧啶的单链寡核苷酸溶液；

3)银纳米粒子的刻蚀和包覆：将步骤1)中的银纳米粒子的溶液与步骤2)中富含胞嘧啶的单链寡核苷酸溶液进行混合，持续震荡，直至溶液的黄色逐渐退去，得到稳定的包覆有富含胞嘧啶的单链寡核苷酸的银纳米粒子分散液。

所述步骤1)中，硝酸银溶液的浓度为1～100mm，柠檬酸钠溶液的浓度为2～4m，硼氢化钠冰水混合物的浓度为20～100mm。

所述步骤1)中，柠檬酸钠溶液与硝酸银溶液的体积比为0.5～1:0.5～1，硼氢化钠冰水混合物与硝酸银溶液的体积比为0.5～1:0.5～1。

所述步骤1)中，避光震荡时间为10～120min，持续震荡时间为0.5～5h。

所述步骤2)中，富含胞嘧啶的单链寡核苷酸中含有胞嘧啶碱基的个数为6～25个，且连续的胞嘧啶碱基的个数为3个及以上。

所述步骤2)中，富含胞嘧啶的单链寡核苷酸溶液浓度为5～25μm。

所述步骤3)中，银纳米粒子溶液与富含胞嘧啶的单链寡核苷酸溶液的体积比为0.5～1:0.5～1。

所述步骤3)中，持续震荡时间为10～90min。

本发明的有益效果是：本发明利用了富含胞嘧啶的单链寡核苷酸序列，能够附着在银纳米粒子表面，对银纳米粒子进行包覆和刻蚀，使得银纳米粒子尺寸减小，稳定性和分散性显著增强，从而增强其抗菌效果，延长其抑菌时间。本方法非常简单，原料环保，而且易实现大批量的生产。

附图说明

图1为实施例1制备的银纳米粒子和包覆有25μm的含有12个胞嘧啶碱基的寡核苷酸(dc12)的银纳米粒子粒径分布图；

图2为实施例1中dc12的浓度对银纳米粒子抗菌活性的影响；

图3为实施例2中银纳米粒子与包覆有18个胞嘧啶碱基的寡核苷酸(dc18)的银纳米粒子抗菌活性图。

具体实施方式

实施例1

实验材料：柠檬酸钠、硝酸银、硼氢化钠、含有12个胞嘧啶碱基的寡核苷酸(dc12)。

溶液配置：浓度为3m的柠檬酸钠水溶液、30mm硝酸银水溶液、60mm硼氢化钠冰水混合溶液；浓度为25μm、10μm、5μm的寡核苷酸水溶液。

将柠檬酸钠水溶液与硝酸银水溶液按照1:1的体积比混合，避光震荡30min后，加入与硝酸银溶液等体积的硼氢化钠冰水混合物，持续震荡3h，得到银纳米粒子的溶液。

按照体积比为1:1，将银纳米粒子溶液分别与25μm、10μm、5μmdc12溶液混合均匀，持续震荡60min，得到稳定的包覆有dc12的银纳米粒子分散液。

图1为银纳米粒子和包覆有25μmdc12的银纳米粒子粒径分布图。由图可知，相对于银纳米粒子，包覆有dc12的银纳米粒子的尺寸明显减小。尺寸减小源于dc12对银纳米粒子的刻蚀。此外，dc12对银纳米粒子进行包覆，增加了银纳米粒子的电负性，使粒子间的斥力增加，从而增强了银纳米粒子的分散性和稳定性。

抗菌活性评价：

将浓度为25μm、10μm、5μm的dc12包覆的银纳米粒子，以及未处理的银纳米粒子(dc12未包覆的银纳米粒子)采用等体积的超纯水稀释后，分别与含大肠杆菌(od600＝0.01)和枯草芽孢杆菌(od600＝0.01)的培养液等体积混合，并于37℃下震荡培养4h，然后将培养后的溶液转移至固态培养基上均匀涂板，37℃下孵育12h，观察细菌菌落数，结果如图2。从图中可知，随着dc12浓度的增加，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌落数减少，表明含胞嘧啶的单链寡核苷酸的浓度越高，对银纳米粒子的刻蚀和包覆效果越好，使得银纳米粒子的粒径减小、分散性变好，因而其抗菌活性增强。

实施例2

实验材料：柠檬酸钠、硝酸银、硼氢化钠、含有18个胞嘧啶碱基的寡核苷酸(dc18)。

溶液配制：浓度为2m的柠檬酸钠水溶液、1mm硝酸银水溶液、20mm硼氢化钠冰水混合溶液；浓度为25μm的dc18溶液。

将柠檬酸钠水溶液与硝酸银水溶液按照1:2的体积比混合，避光震荡10min后，加入硼氢化钠冰水混合物，硼氢化钠冰水混合物与硝酸银溶液体积比为1:2，然后持续震荡5h，得到银纳米粒子的溶液。

按照体积比为2:1将银纳米粒子的溶液与浓度为25μmdc18溶液混合均匀，并持续震荡90min，得到稳定的包覆有单链寡核苷酸的银纳米粒子分散液。

抗菌活性评价：

采用杜氏磷酸盐缓冲液作为空白组，未处理过的银纳米粒子用水稀释1.5倍后作为对照组，包覆有dc18的银纳米粒子分散液作为控制组。将上述空白组、对照组、控制组分别与含大肠杆菌(od600＝0.01)和枯草芽孢杆菌(od600＝0.01)的培养液等体积混合，并于37℃下震荡培养4h，然后将培养后的溶液转移至固态培养基上均匀涂板，37℃下孵育8h，观察细菌菌落数，其结果如图3所示。由图3可知，相对于空白组，对照组仅对大肠杆菌有较小的抑制作用，对枯草芽孢杆菌的抑菌效果不明显；控制组对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果非常明显，平板上没有细菌生长。

实施例3

实验材料：柠檬酸钠、硝酸银、硼氢化钠、含有23个碱基且每3个胞嘧啶连续的寡核苷酸(dc3tc3tc3tc3tc3tc3)。

溶液配制：浓度为4m的柠檬酸钠水溶液、100mm硝酸银水溶液、100mm硼氢化钠冰水混合溶液；浓度为15μm的dc3tc3tc3tc3tc3tc3溶液。

将柠檬酸钠水溶液与硝酸银水溶液按照2:1的体积比混合，避光震荡120min后，加入硼氢化钠冰水混合物，硼氢化钠冰水混合物与硝酸银溶液体积比为2:1，然后持续震荡0.5h，得到银纳米粒子的溶液。

按照体积比为1:2，将银纳米粒子的溶液与浓度为15μmdc3tc3tc3tc3tc3tc3溶液混合均匀，并持续震荡10min，得到稳定的包覆有dc3tc3tc3tc3tc3tc3的银纳米粒子分散液。

实施例4

实验材料：柠檬酸钠、硝酸银、硼氢化钠、含有6个胞嘧啶碱基的寡核苷酸(dc6)。

溶液配制：浓度为2m的柠檬酸钠水溶液、1mm硝酸银水溶液、20mm硼氢化钠冰水混合溶液；浓度为20μm的dc6溶液。

将柠檬酸钠水溶液与硝酸银水溶液按照1:1的体积比混合，避光震荡40min后，加入硼氢化钠冰水混合物，硼氢化钠冰水混合物与硝酸银溶液体积比为1:1，然后持续震荡4h，得到银纳米粒子的溶液。

按照体积比为1:1将银纳米粒子的溶液与浓度为20μmdc6的溶液混合均匀，并持续震荡60min，得到稳定的包覆有dc6的银纳米粒子分散液。