表面洗脱，离屯、后取上清液，向上清液中加入憐酸对硝基苯醋（P-NPP)，置 于36. 5°C恒溫箱中30min后加入1M的化0H溶液终止反应，通过在酶标仪上测量其在405皿 波长处的吸光度来计算反应生成的对硝基苯酪的量。最终用经过细胞内蛋白总量标准化的 对硝基苯酪的量来衡量ALP活性，而细胞内蛋白总量是通过BCA蛋白法进行测量的。
[0054] 图8是经上述实施例1改性处理得到的碳纤维增强聚酸酸酬与未改性碳纤维增强 聚酸酸酬的rBMSCS细胞碱性憐酸酶（AL巧活性测试实验统计结果。由图8可见：经上述实 施例1改性处理得到的碳纤维增强聚酸酸酬表面的rBMSCS细胞碱性憐酸酶（AL巧活性明 显好于未改性碳纤维增强聚酸酸酬表面细胞碱性憐酸酶活性，显示出改性样品能促进干细 胞的早期成骨分化。 阳0对实施例7 rBMSCs干细胞的胶原（(DLL)分泌检测方法如下：（1)将灭菌好的样品放入24孔细胞 培养板中，向每孔中滴加ImL密度为lXl〇YmL(7天）（0. 5X104/mL(14天））的rBMSCs细 胞悬液，并置于5%C〇2饱和湿度的36. 5°C培养箱中恒溫培养7、14天。（2)细胞培养7、14 天后，将样品移至新的24孔板内并用PBS清洗样品表面，然后向每孔中加入0. 5mL含0. 1% 天狼星红的饱和苦味酸混合液，在4°C下染色1她。（3)用0. 1M的醋酸溶液反复清洗样品表 面直至溶液澄清。（4)向每孔加入由0. 2M的氨氧化钢和甲醇按体积比1 :1配制而成的洗 脱液，将样品表面的染料洗脱下来。（5)从每孔取出100μL洗脱液放入96孔板中，利用酶 标仪度Ι0-Τ邸，ELX800)测量各孔在570皿波长下的吸光度值。
[0056] 图9是经上述实施例1改性处理得到的碳纤维增强聚酸酸酬与未改性碳纤维增强 聚酸酸酬的rBMSCS干细胞胶原（(DLL)分泌测试实验统计结果。由图9可见：经上述实施例 1改性处理得到的碳纤维增强聚酸酸酬表面的rBMSCS细胞胶原（(DLL)分泌明显高于未改 性碳纤维增强聚酸酸酬表面细胞胶原分泌，表明改性样品能促进干细胞的早期成骨分化。
[0057] 实施例8 rBMSCs干细胞细胞外基质巧CM)矿化分泌检测方法如下：（1)将灭菌好的样品放入 24孔细胞培养板中，向每孔中滴加ImL密度为lXl〇VmL(7天）（0. 5X104/mL(14天））的 rBMSCs细胞悬液，并置于5%C〇2饱和湿度的36. 5°C培养箱中恒溫培养7、14天。（2)细胞培 养7、14天后，将样品移至新的24孔板内并用PBS清洗样品表面，然后向每孔中加入0. 5mL 75vol. %的酒精，在室溫下固定细胞比。（3)向每孔加入40mM的茜素红溶液，在室溫下对 细胞进行染色lOmin。（4)用超纯水反复清洗样品表面直至无红色析出。（5)向每孔加入 0. 5mL含10%氯化十六烧化晚的憐酸钢溶液溶解样品表面的染料。（6)从每孔取出100μL 洗脱液放入96孔板中，利用酶标仪度ΙΟ-ΤΕΚ，ELX800)测量各孔在600nm波长下的吸光度 值。
[0058] 图10是经上述实施例1改性处理得到的碳纤维增强聚酸酸酬与未改性碳纤维增 强聚酸酸酬的rBMSCS干细胞细胞外基质巧CM)矿化测试实验统计结果。由图10可见：经 上述实施例1改性处理得到的碳纤维增强聚酸酸酬表面的rBMSCS干细胞细胞外基质巧CM) 矿化明显高于未改性碳纤维增强聚酸酸酬表面的rBMSCS干细胞细胞外基质矿化，表明改 性样品能促进干细胞后期成骨分化。
[0059] 实施例9 选用金黄色葡萄球菌（Staphylococ州Saureus),采用抗菌实验评估经上述实施例1改性所得碳纤维增强聚酸酸酬材料的抗菌性，利用扫描电子显微镜观察材料表面细菌 形貌。具体步骤如下：（1)将使用75 %乙醇灭菌的样品置于培养板中，吸取60μL密度 为107c化/mL的菌液接种于样品表面，保持湿度大于90 %，置于36. 5°C厌氧恒溫箱中培养 2地。似取出样品，用2%戊二醒在室溫下固定24小时，用PBS清洗立遍。做用梯度酒精 (30%、50%、75%、90%、95%和100% )对已固定的细菌进行脱水处理。（4)将试样依次置 于不同配比的酒精和六甲基二娃胺烧（HMD巧的混合溶液（酒精：HMDS= 2:1、1:1、1:2和 100%HMD巧中进行干燥，处理时间各lOmin。试样喷金后用沈Μ观察样品表面的细菌形态。
[0060]另外，利用金黄色葡萄球菌（Staphylococ州Saureus,S.aureus,ATCC25923)通 过涂板实验评价材料的抗菌活性。具体步骤如下：取金黄色葡萄球菌接种于营养琼脂板表 面，在36. 5°C厌氧恒溫箱中培养4她，连续传至第Ξ代无杂菌者作为实验用菌种。刮下菌 种并接种于营养琼脂培养基，继续培养2地。参照细菌标准比浊管，将菌液稀释为107c化/ mL。将待测样品置于75%乙醇水溶液中震荡消毒化。吸取60μL菌液接种于样品表面，置 于36. 5°C和90%湿度的厌氧恒溫箱中培养。24h后用4. 5mL生理盐水将样品表面的细菌洗 下，并稀释至特定浓度。取稀释后的菌液100μL接种于营养琼脂培养皿，于36. 5°C厌氧恒 溫箱培养1化后，记录存活菌落数。
[0061] 图11是经上述实施例1改性处理得到的碳纤维增强聚酸酸酬与未改性样细菌形 貌图。由图11可知：改性样品表面细菌数量明显少于对照组材料表面细菌数量，涂板实验 结果表明实施例1改性处理后，材料对金黄色葡萄球菌的抑制率达到62. 7%，，表明改性材 料对金黄色葡萄球菌具有一定抗菌性。
[0062] 产业应用性：经过本发明改性方法处理得到的碳纤维增强聚酸酸酬材料表面机械 性质得到显著提高，尤其是表面弹性模量与人骨弹性模量更为匹配，另外经过本发明改性 方法处理得到的碳纤维增强聚酸酸酬材料表面具有较好的生物活性和促进干细胞成骨分 化的能力，rBMSCs细胞在改性表面增殖和成骨分化明显高于未改性表面，能满足医用碳纤 维增强聚酸酸酬材料所需的生物活性和成骨性能要求。
【主权项】
1. 一种注入锆离子对聚醚醚酮表面进行改性的方法，其特征在于，所述方法包括：使 用等离子体浸没离子注入技术，在聚醚醚酮的表面进行锆离子注入，得到改性后的聚醚醚 酮材料。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用等离子体浸没离子注入技术在聚醚 醚酮的表面进行锆离子注入时，使用纯金属锆作为阴极。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述锆离子注入的工艺参数包括：本 底真空度为3X10 3~5X10 3Pa，注入电压为15~40kV，注入脉宽为50~600μs，注入 脉冲频率为5~10Hz，阴极源触发脉宽为500~2000μs，注入时间为30~180分钟。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述注入脉宽为200~600μs，所述注入 时间为60~180分钟。5. 根据权利要求3或4中任一项所述的方法，其特征在于，所述本底真空度为5X10 3 Pa，所述注入电压为15kV，所述注入脉冲频率为10Ηζ，所述注入脉宽为500μs，所述注入 时间为2小时。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚醚醚酮为纯聚醚醚酮 材料或碳纤维增强聚醚醚酮材料。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚醚醚酮为纯聚醚醚酮材料，锆离子 注入纯聚醚醚酮表面形成纳米膜或纳米颗粒。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚醚醚酮为碳纤维增强聚醚醚酮材 料，锆离子注入碳纤维增强聚醚醚酮表面形成具有纳米颗粒和岛状结构的多级纳米结构。
【专利摘要】本发明涉及一种锆离子注入改善医用聚醚醚酮材料生物活性的方法，所述方法包括：使用等离子体浸没离子注入技术，在聚醚醚酮的表面进行锆离子注入，得到改性后的聚醚醚酮材料。本发明利用等离子体浸没离子注入技术对聚醚醚酮材料进行锆离子注入改性，在材料表面引入微纳结构的同时，也引入生物活性成分氧化锆，以提高聚醚醚酮的机械性能、生物活性和成骨性能，同时也赋予材料一定的抗菌性。
【IPC分类】C23C14/48
【公开号】CN105331946
【申请号】CN201510797209
【发明人】刘宣勇, 李剑
【申请人】中国科学院上海硅酸盐研究所
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月18日