专利名称：一种水溶性碳纳米颗粒的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及碳纳米材料中的碳纳米颗粒(carbon nanoparticles)的制备方法及 其具有高猝灭性能的应用，属于纳米技术领域。
背景技术：
碳纳米颗粒(CNPs)是最近兴起的一种新型的碳纳米材料，Sim等人于2006年首次 在美国化学协会(JACS)上报道了仅有5nm左右的发光碳纳米颗粒，他们没有确定出这种发 光碳纳米颗粒的结构，但从拉曼结果来看，碳颗粒中可能同时存在金刚石结构和石墨结构。 这一研究成果已经激起了人们对发光碳纳米颗粒的研究，因为这种发光碳纳米颗粒不仅无 毒、具有良好的生物相容性，而且它的发光强度可以和硅量子点发光相媲美，其发光稳定， 没有光猝熄现象，在生物标记以及生命科学里面具有重要的应用价值。最近，Liu等人在德 国“应用化学”杂志上报道了回流酸煮蜡烛灰制备发光碳纳米晶的简易方法。该方法获得 的碳纳米颗粒的尺寸不到2nm，可以同样发出多色可见光，但是碳纳米颗粒发光量子效率非 常低，仅有0. 8-1. 9%。到目前为止，对碳纳米颗粒发光只是进行初步的研究，但是还没有清 楚知道碳纳米颗粒的结构以及细小碳纳米颗粒发光的原因。碳纳米颗粒的生物分析应用从 目前文献报道来看，主要基于碳量子点本身的发光性质用于生物成像，Sim等人利用碳量子 点进行了活体成像及多光子成像。由于制备出的发光碳纳米颗粒量子产率低，半峰宽比较 宽，因而对其应用受到很大的限制，目前基于碳纳米颗粒性能的研究，研究了具有更小尺寸 的碳纳米颗粒(碳量子点)的光学性质的研究，而基于碳纳米颗粒的性能研究还很少。由于碳纳米颗粒同时具有碳材料性质和纳米尺寸效应，与具有平面结构的染料分 子作用较强，并且可以通过电子转移或能量转移等过程引起荧光猝灭，因此利用碳纳米颗 粒作为纳米猝灭剂，将为生物分子荧光识别提供潜在平台。Mao等人通过燃烧蜡烛的方法 得到蜡烛灰，然后再通过酸化处理以后得到了大小不同的碳纳米颗粒，一是发荧光的碳量 子点(小于2nm)，另外是比较大的不发荧光的碳纳米颗粒(20-200nm)；它们只对碳量子点 进行了深入的研究，而随后基于碳量子点的修饰和应用的报道(主要是细胞成像方面)也 出现很多，而关于大尺寸的碳纳米颗粒报道较少，2009年S. C. Ray等对碳纳米颗粒进行了 比较详细的表征分析。Mao和S. C. Ray都是利用燃烧收集的蜡烛灰，然后在水溶液中加入 浓硝酸再加热到100°C进行回流(大于12h)。但是此方法需要的温度较高，再加上浓硝酸 在100°C时可能已经分解成NO2，减弱了其的酸化功能，从而很难得到分散性很好的碳纳米 颗粒，不利于碳纳米颗粒的发展和应用。
发明内容
本发明的目的在于，为了克服现有技术的不足，提出一种水溶性碳纳米颗粒的制 备方法及应用，所述方法可以利用价格低廉的原料和简单的制备工艺过程，得到良好水溶 性的碳纳米颗粒，所制备的碳纳米颗粒可用做对Cy5，Rox, FAM, Cy5_DNA，Rox-DNA, FAM-DNA 进行荧光猝灭的高猝灭剂。
本发明的技术方案之一是，所述水溶性碳纳米颗粒的制备方法包括(a)采用燃烧蜡烛的方法收集蜡烛灰把烧杯放在燃烧的蜡烛上空收集黑烟，经 过一段时间烧杯里面沉积一层黑色固体后，从烧杯表面刮下该黑色固体；将这些黑色固体 放在真空干燥箱内烘干，去掉因为燃烧而产生的水份，得干燥的碳灰，储存在干燥环境中待 用；(b)碳纳米颗粒的酸化称取3. 5mg-4. 5mg干燥的碳灰放于IOmL的圆底烧瓶中， 加入2mL的浓硝酸(HHNO3)和2mL的DMF (N，N- 二甲基甲酰胺)或者DMSO (二甲基亚砜)， 在50°C-60°C油浴锅中加热回流11. 5小时-12. 5小时，得反应液；然后把反应液倒入5mL离 心管内离心，离心后分成两层，上层是黄褐色液体，下层是黑色固体，去掉上层液体后再加 入二次水，混勻再离心去掉上层液体，如此反复5次(目的是尽量去掉反应中残留的硝酸， 以免干扰后续的应用)，即得酸化的碳纳米颗粒溶液，溶液中含有水溶性的碳纳米颗粒。本发明的技术方案之二是，所述水溶性碳纳米颗粒作为荧光猝灭剂的应用为在 Tris-HCl缓冲溶液中加入所述酸化的碳纳米颗粒溶液，使缓冲溶液中的染料或标记上染料 的DNA产生荧光猝灭；所述染料或标记上染料的DNA为以下所列的任意一种染料:RB,Cy3, Rox，FAM，Py, TPP ；标记上染料的 DNA :Cy3-DNA, Rox-DNA, FAM-DNA, Py-DNA, TPP-DNA0以下对本发明做出进一步说明。本发明的水溶性碳纳米颗粒作为荧光猝灭剂应用时，所用Tris-HCl缓冲溶液为 含 IOmM Mg2+、50mM K+，pH = 7. 4 的缓冲溶液；在一定量的Tris-HCl缓冲溶液(IOmM Mg2+，50mMK+，pH = 7. 4)中，加入浓度为 60nM的染料溶液，再依次加入不同体积的碳纳米颗粒(总体积小于30 μ L)，摇勻、放置 lOmin，对不同染料采用不同的激发波长，测量染料的荧光发射光谱，记录加碳纳米颗粒前 后荧光强度变化情况，计算碳纳米颗粒对荧光的猝灭效率。由以上可知，本发明为一种水溶性碳纳米颗粒的制备方法及应用，它对原有的制 备方法进行了显著的改进，在较低的温度(仅为50°C -60°C )下，得到了水溶性很好的碳纳 米颗粒；并且，所制备的碳纳米颗粒可以作为一种高猝灭剂，对罗丹明B(RB)，芘(Py)，卟啉 (TPP)，花青素 3 (Cy3)，Rox,荧光素(FAM)，Cy3_DNA，Rox-DNA, FAM-DNA, Py-DNA, TPP-DNA 具 有荧光猝灭效应，猝灭率高。
图1-1为实施例1中制得的酸化和未酸化的碳纳米颗粒扫描电镜图，其中A为未 酸化的碳纳米颗粒，B为酸化的碳纳米颗粒；图1-2为实施例1中制得的酸化和未酸化的碳纳米颗粒红外图谱；图2为实施例2中酸化的碳纳米颗粒对Cy3的荧光强度的猝灭图；图3为实施例3中为酸化的碳纳米颗粒对FAM的荧光强度的猝灭图；图4为实施例4中为酸化的碳纳米颗粒对Py的荧光强度的猝灭；图5为实施例5中酸化的碳纳米颗粒对RB的荧光强度的猝灭图；图6为实施例6中酸化的碳纳米颗粒对TPP的荧光强度的猝灭图7为实施例7中酸化的碳纳米颗粒对Cy3_DNA的荧光强度的猝灭图；图8为实施例8中酸化的碳纳米颗粒对FAM-DNA的荧光强度的猝灭图；图9为实例9中为酸化的碳纳米颗粒对ROX-DNA的荧光强度的猝灭图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。实施例1 把烧杯放在燃烧的蜡烛上空收集黑烟，经过一段时间烧杯里面沉积一 层黑色固体后，从烧杯表面刮下该黑色固体；将这些黑色固体放在真空干燥箱内烘干，去掉 因为燃烧而产生的水份，得干燥的碳灰，储存在干燥环境中待用；称取4mg干燥的碳灰于 IOmL的圆底烧瓶中，加入2mL的浓硝酸和2mL的DMF，在60°C油浴锅中加热回流12小时；回 流结束后把反应液倒入5mL离心管内离心，离心后分成两层，上层是黄褐色液体，下层是黑 色固体；去掉上层液体后再加入二次水，混勻再离心去掉上层液体，如此反复5次(目的是 尽量去掉反应中残留的硝酸，以免干扰后续的应用)后，加入2ml 二次水而配成浓度为2mg/ ml的酸化碳纳米颗粒溶液，以便后续使用。浓度为2mg/ml的酸化碳纳米颗粒溶液，即每毫 升酸化碳纳米颗粒溶液中含有2mg碳纳米颗粒。红外谱图分析从图1-2的酸化与未酸化碳纳米颗粒的红外谱图中可以看出，碳 纳米颗粒被酸化后，在1720CHT1处出现一个C = O的伸缩振动峰，并且1250CHT1处的峰增强 很多，是由于C-O伸缩振动引起的，3400CHT1处O-H的伸缩振动峰也明显增强；综合以上红 外谱图，可以确定碳纳米颗粒表面经过酸化后，表面出现了 -C00H。实施例2 取 Tris-HCl 缓冲溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 积为800 μ L的荧光池中，加入染料Cy3到该荧光池中，使染料Cy3的浓度为60nM ；测试其 荧光强度，接着加入10 μ L的酸化碳纳米颗粒溶液(该酸化碳纳米颗粒溶液的浓读为每毫 升溶液含酸化碳纳米颗粒2mg，即浓度为2mg/ml，后同)，摇勻、放置lOmin，再测试并记录其 荧光强度，计算得到碳纳米颗粒对荧光的猝灭效率为96. 28% ；如图2。实施例3 取 Tris-HCl 缓冲溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 积为800 μ L的荧光池中，加入染料FAM于荧光池中，使染料FAM的浓度为60ηΜ，测试其荧光 强度；接着加入IOyL的酸化碳纳米颗粒溶液(2mg/ml)，摇勻、放置lOmin，再测试并记录其 荧光强度，计算得到碳纳米颗粒对荧光的猝灭效率70. 85%，如图3。实施例4 取 Tris-HCl 缓冲溶液(IOmM Mg2+，50mMK+，pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 积为800 μ L的荧光池中，加入染料Py于荧光池中，使染料Py的浓度为60ηΜ，测试其荧光强 度；接着加入IOyL的酸化碳纳米颗粒溶液(2mg/ml)，摇勻、放置lOmin，再测试并记录其荧 光强度，计算得到碳纳米颗粒对荧光的猝灭效率为92. 67%，如图4。实施例5 取 Tris-HCl 缓冲溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 积为800 μ L的荧光池中，加入染料RB于荧光池中，使染料RB的浓度为60ηΜ，测试其荧光强 度；接着加入IOyL的酸化碳纳米颗粒溶液(2mg/ml)，摇勻、放置lOmin，再测试并记录其荧 光强度，计算得到碳纳米颗粒对荧光的猝灭效率为98. 57%，如图5。实施例6 取 Tris-HCl 缓冲溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 积为800 μ L的荧光池中，加入染料Pul in于荧光池中，使染料Pul in的浓度为60nM，测试其荧光强度；接着加入IOyL的酸化碳纳米颗粒溶液(2mg/ml)，摇勻、放置lOmin，再测试并记 录其荧光强度，计算得到碳纳米颗粒对荧光的猝灭效率94. 91 %，如图6。实施例7 取 Tris-HCl 缓冲溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 积为800 μ L的荧光池中，加入染料Cy3-DNA于荧光池中，使染料Cy3_DNA的浓度为60nM，测 试其荧光强度；接着加入5μ L的酸化碳纳米颗粒溶液(2mg/ml)，摇勻、放置lOmin，再测试 并记录其荧光强度，计算得到碳纳米颗粒对荧光的猝灭效率97. 9 %，如图7。实施例8 取 Tris-HCl 缓冲溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 积为800 μ L的荧光池中，加入染料FAM-DNA于荧光池中，使染料FAM-DNA的浓度为60ηΜ，测 试其荧光强度；接着加入5μ L的酸化碳纳米颗粒溶液(2mg/ml)，摇勻、放置lOmin，再测试 并记录其荧光强度，计算得到碳纳米颗粒对荧光的猝灭效率99. 6 %，如图8。实施例9 取 Tris-HCl 缓冲溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 积为800 μ L的荧光池中，加入染料ROX-DNA于荧光池中，使染料ROX-DNA的浓度为60ηΜ，测 试其荧光强度；接着加入5μ L的酸化碳纳米颗粒溶液(2mg/ml)，摇勻、放置lOmin，再测试 并记录其荧光强度，计算得到碳纳米颗粒对荧光的猝灭效率99. 92 %，如图9。实施例10 取 Tris-HCl 缓冲溶液(IOmM Mg2+, 50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 积为800 μ L的荧光池中，加入染料于荧光池中，使染料的浓度为60ηΜ，测试其荧光强度；接 着加入5μ L的酸化碳纳米颗粒溶液(2mg/ml)，摇勻、放置lOmin，再测试并记录其荧光强 度，计算得到碳纳米颗粒对荧光的猝灭效率，如表1。表一为实例10中为酸化的碳纳米颗粒对几种染料和标记上染料的DNA的荧光强 度的猝灭的比较。表一
权利要求
一种水溶性碳纳米颗粒的制备方法，其特征是，它包括(a)采用燃烧蜡烛的方法收集蜡烛灰把烧杯放在燃烧的蜡烛上空收集黑烟，经过一段时间烧杯里面沉积一层黑色固体后，从烧杯表面刮下该黑色固体；将这些黑色固体放在真空干燥箱内烘干，去掉因为燃烧而产生的水份，得干燥的碳灰，储存在干燥环境中待用；(b)碳纳米颗粒的酸化称取3.5mg 4.5mg干燥的碳灰放于10mL的圆底烧瓶中，加入2mL的浓硝酸和2mL的DMF或者DMSO，在50℃ 60℃油浴锅中加热回流11.5小时 12.5小时，得反应液；然后把反应液倒入5mL离心管内离心，离心后分成两层，上层是黄褐色液体，下层是黑色固体，去掉上层液体后再加入二次水，混匀再离心去掉上层液体，如此反复5次，即得酸化的碳纳米颗粒溶液。
2.权利要求1所述水溶性碳纳米颗粒作为荧光猝灭剂的应用，其特征是，在Tris-HCl 缓冲溶液中加入所述酸化的碳纳米颗粒溶液，使缓冲溶液中的染料或标记上染料的DNA产 生荧光猝灭；所述染料或标记上染料的DNA为以下所列的任意一种染料RB，Cy3, Rox, FAM, Py, TPP ；标记上染料的 DNA :Cy3_DNA，Rox-DNA, FAM-DNA, Py-DNA，TPP-DNA。
3.根据权利要求2所述水溶性碳纳米颗粒作为荧光猝灭剂的应用，其特征是，所述 Tris-HCl缓冲溶液是含IOOmM K+、5mM Mg2+,pH = 7.4的缓冲溶液；所用染料溶液的浓度为 60nM,酸化的碳纳米颗粒溶液的浓度为2mg/ml。
4.根据权利要求3所述水溶性碳纳米颗粒作为荧光猝灭剂的应用，其特征是， Tris-HCl缓冲溶液的用量是400 μ L，酸化的碳纳米颗粒溶液的用量是5 μ L-IO μ L。全文摘要
一种水溶性碳纳米颗粒的制备方法及应用，方法包括采用燃烧蜡烛的方法收集蜡烛灰；将蜡烛灰放于圆底烧瓶中，加入浓硝酸和DMF，在50℃-60℃油浴锅中加热回流约12小时，得反应液；把反应液倒入离心管内离心后取黑色固体，去掉上层液体后再加入二次水，混匀再离心去掉上层液体，如此反复5次，即得酸化的碳纳米颗粒溶液；应用是在Tris-HCl缓冲溶液中加入所述酸化的碳纳米颗粒溶液，使缓冲溶液中的染料或标记上染料的DNA产生荧光猝灭。所述方法可以利用价格低廉的原料和简单的制备工艺过程，得到良好水溶性的碳纳米颗粒，所制备的碳纳米颗粒可用做对相关染料进行荧光猝灭的高猝灭剂。
文档编号C01B31/02GK101935033SQ20101027460
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者刘金华, 李继山, 杨荣华 申请人:湖南大学