本发明涉及生物有机肥
技术领域：
，尤其涉及一种具有生防功能的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：我国是农业大国，在农作物的整个物候期中，农作物的虫害、病害是影响其产量的重要因素，病虫害的发生使农作物严重减产甚至是绝收，因此，在农作物的整个物候期中对病虫害的有效控制尤为重要。但我国农业主要以化学农药、化学杀菌剂防治病虫害，化学农药虽然可有效防治病虫害，但长期过分依赖于化学农药的结果是农田土质变化，肥力下降，农作物产品残留、品质下降以及食品和环境污染。为减少化学农药使用量，国际上呈现一种致力于开发出生物农药或具有生防特性的微生物菌肥的趋势。国内外相关专家在研发中发现部分微生物及其代谢产物兼有生防和营养的双重功能，因此将分别具有营养和生防功能的微生物复配到肥料中，以实现研发出同时具有促长和生防双功能的微生物菌肥。现有技术中有关土传病害的生防应用报道很多，如中国专利cn201510769449.9公开了利用猪粪和蘑菇渣生长生物有机肥的方法，选用枯草芽孢杆菌对猪粪和蘑菇渣进行腐熟，再复配具有拮抗或抑制作用有害真菌的益生菌，该方法益生菌的存活率较低，为了保证存活率必需使用大量的益生菌，增加了成本；中国专利cn201410514541.6公开了一种利用微生物发酵法制备猪粪生物有机肥的工艺，该方法在堆肥配料中添加了10％～20％海藻，使得制备的生物有机肥具有海藻肥的优点，但制备工艺复杂，不便农业生产实际操作；中国专利cn201010228347.3、cn201310666396.9、cn20130308892.7均提供了用于堆腐发酵的秸秆腐熟菌剂，而秸秆堆腐发酵具有费劳力、成本高的缺点。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有生防功能的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。本发明提供的复合微生物菌剂能促进作物根际发育，既为作物提供全方面营养，还能提高作物抗病能力。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种具有生防功能的复合微生物菌剂，由包括以下质量份的原料制备而成：猪粪30～45份、菇渣20～35份、秸秆20～35份、球孢白僵菌beauveriabassiana5～15份、哈茨木霉菌20～35份和荧光假单胞菌10～25份；所述球孢白僵菌beauveriabassiana的有效活菌数为≥5亿/ml。优选地，由包括以下质量份的原料制备而成：猪粪40份、菇渣30份、秸秆25份、球孢白僵菌beauveriabassiana5～15份、哈茨木霉菌20～35份和荧光假单胞菌10～25份。优选地，所述球孢白僵菌beauveriabassiana为球孢白僵菌beauveriabassiana三炬-22，保藏编号为cgmccno.17974。本发明还提供了上述技术方案所述的具有生防功能的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：将猪粪、菇渣和秸秆混合，得到预混料；将球孢白僵菌beauveriabassiana与所述预混料混合，进行第一发酵，得到第一发酵料；将哈茨木霉菌与所述预混料混合，进行第二发酵，得到第二发酵料；将所述第一发酵料和第二发酵料混合，得到初次发酵料；将荧光假单胞菌与所述初次发酵料混合，进行第三发酵，得到所述具有生防功能的复合微生物菌剂。优选地，所述第一发酵和第二发酵的过程中控制含水量为20％～45％。优选地，所述第一发酵和第二发酵的时间均为15～20天。优选地，所述第三发酵的时间为5～7天。本发明还提供了上述技术方案所述的具有生防功能的复合微生物菌剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的具有生防功能的复合微生物菌剂在促进作物根际发育中的应用。本发明还提供了上述技术方案所述的具有生防功能的复合微生物菌剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的具有生防功能的复合微生物菌剂在抑制植物病害中的应用。优选地，所述植物病害由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌或齐整小核菌引起。本发明提供了一种具有生防功能的复合微生物菌剂，由包括以下质量份的原料制备而成：猪粪30～45份、菇渣20～35份、秸秆20～35份、球孢白僵菌beauveriabassiana5～15份、哈茨木霉菌20～35份和荧光假单胞菌10～25份；所述球孢白僵菌beauveriabassiana的有效活菌数为≥5亿/ml。本发明通过优化配比，充分发挥复配菌剂的多功能作用，相互之间无拮抗作用，使有效活菌数达到最大，该复合微生物菌剂既具有产生促进作物生长的活性物质，能向农作物供肥，能向作物根系土壤引植有益微生物优势群体；同时，该微生物菌剂中的哈茨木霉菌是一种生防菌常用来预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌、齐整小核菌等病原菌引起的植物病害，能有效防止作物土传病害的发生，具有生防功能。因此本发明实现肥田壮苗、促生防病及优质高产的目的，生产的微生物菌剂，在使用中，可减少用肥次数和使用成本，产生药肥互相促进、互相提高的增效作用，具有显著的环保价值、社会效益和经济效益。实施例的数据表明，本发明提供的复合微生物菌剂能促进作物根际发育，既为作物提供全方面营养，还能提高作物抗病能力，对由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌、齐整小核菌等病原菌引起的植物病害具有很好的抑制作用，同时还可以有效减少作物表面害虫发生率。生物保藏说明球孢白僵菌，拉丁文为beauveriabassiana，于2019年6月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.17974。具体实施方式本发明提供了一种具有生防功能的复合微生物菌剂，由包括以下质量份的原料制备而成：猪粪30～45份、菇渣20～35份、秸秆20～35份、球孢白僵菌beauveriabassiana5～15份、哈茨木霉菌20～35份和荧光假单胞菌10～25份；所述球孢白僵菌beauveriabassiana的有效活菌数为≥5亿/ml。在本发明中，所述复合微生物菌剂优选由包括以下质量份的原料制备而成：猪粪40份、菇渣30份、秸秆25份、球孢白僵菌beauveriabassiana5～15份、哈茨木霉菌20～35份和荧光假单胞菌10～25份。本发明对所述猪粪的来源没有特殊限定。本发明对所述菇渣的来源没有特殊限定。在本发明中，所述菇渣能够提供多种菌体蛋白、代谢产物和未被利用的营养物质。本发明对所述秸秆的来源没有特殊限定。在本发明中，所述秸秆能够提供纤维、有机质和氮、磷、钾、钙和镁等元素。在本发明中，所述球孢白僵菌beauveriabassiana优选为球孢白僵菌beauveriabassiana三炬-22，保藏编号为cgmccno.17974，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述球孢白僵菌能够防治玉米螟、松毛虫、番薯象鼻虫、棉花红蜘蛛等多种农林害虫。本发明中所述哈茨木霉菌和荧光假单胞菌于市场购买所得。在本发明中，所述哈茨木霉菌占据生态位能够抑制白粉病病原菌的大量繁殖，阻碍病原菌的侵染，结合球孢白僵菌的诱导抗病性，使得病情指数明显降低，起到防治白粉病效果。在本发明中，所述荧光假单胞菌能够向作物根系土壤引植有益微生物优势群体，使营养供应充足、植株生长健壮，同时使叶片浓绿有光泽，根系发达，增产效果极显著。本发明还提供了上述技术方案所述的具有生防功能的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：将猪粪、菇渣和秸秆混合，得到预混料；将球孢白僵菌beauveriabassiana与所述预混料混合，进行第一发酵，得到第一发酵料；将哈茨木霉菌与所述预混料混合，进行第二发酵，得到第二发酵料；将所述第一发酵料和第二发酵料混合，得到初次发酵料；将荧光假单胞菌与所述初次发酵料混合，进行第三发酵，得到所述具有生防功能的复合微生物菌剂。在本发明中，所述第一发酵和第二发酵的过程中优选控制含水量为20％～45％。在本发明中，所述第一发酵和第二发酵的过程中优选保持湿润状态，定时观察含水量变化，及时补充水分。在本发明中，所述第一发酵和第二发酵的过程中优选待堆体温度达到55℃以上，用翻抛机进行翻抛。在本发明中，所述第一发酵和第二发酵的时间优选均为15～20天。在本发明中，所述第三发酵的时间优选为5～7天。在本发明中，所述球孢白僵菌beauveriabassiana、哈茨木霉菌和荧光假单胞菌优选以菌液的形式进行添加，所述球孢白僵菌beauveriabassiana和哈茨木霉菌优选以pda培养基为斜面培养基得到菌液，所述荧光假单胞菌优选以无氮培养基为斜面培养基得到菌液。本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物菌剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的复合微生物菌剂在促进作物根际发育中的应用。本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物菌剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的复合微生物菌剂在促进作物生长中的应用。本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物菌剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的复合微生物菌剂在提高作物产量中的应用。本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物菌剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的复合微生物菌剂在抑制植物病害中的应用。在本发明中，所述植物病害优选由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、黑根霉、柱孢霉、核盘菌或齐整小核菌引起。本发明优选根据不同作物，进行一定比例将所述复合微生物菌剂撒施在作物根部，或者作物种植前期以一定比例进行穴施。为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的复合微生物菌剂及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例中检测方法-委托农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检测测试中心根据国标gb20287-2006、ny/t2321-2013进行检测。实施例1：1、原料混合：猪粪、菇渣、秸秆按照质量比40:30:25准备好，堆放在发酵池中，并混合均匀；2、将备好的球孢白僵菌beauveriabassiana三炬-22，生物保藏编号为cgmccno.17974、哈茨木霉菌发酵液分别以5％、20％的接种量，分别撒入上述混合原料中，混合均匀。3、控制含水量20％，分别进行初次发酵。发酵过程中保持湿润状态，定时观察含水量变化，及时补充水分。待堆体温度达到55℃以上，用翻抛机进行翻抛，初次发酵时间为15天，发酵后将两种发酵物进行混合得到初次发酵料。4、将单独发酵得到的荧光假单胞发酵液按10％的接种量均匀撒入初次发酵料中，并用翻抛机混合均匀，再进行二次发酵，发酵时间5天，即得所需复合微生物菌剂。上述荧光假单胞发酵液的斜面培养基为无氮培养基，球孢白僵菌beauveriabassiana三炬-22、哈茨木霉菌的斜面培养基为pda培养基。供试植物为：荷兰豆、蕹菜两种作物。处理1：空白对照处理2：常规施肥处理3：常规施肥+施用灭活后的复合微生物菌剂处理4：常规施肥+施用复合微生物菌剂以上处理均重复3次。具体施肥方法：荷兰豆：复合微生物菌剂处理于移栽期(10月14日)、坐果期(12月13日)进行施肥。处理1：空白对照，不施肥；处理2：常规施肥；处理3：常规施肥+施用灭活后的复合微生物菌剂，以150kg/亩施用灭活后的复合微生物菌剂；处理4：常规施肥+复合微生物菌剂：用法及用量与施用灭活后的复合微生物菌剂相同。调查结果从采收开始分别对各小区产量进行登记，并统计产量。7月7日和7月27日对黄瓜白粉病进行调查。在采收结束期(1月15日)进行生物产量统计。蕹菜：蕹菜播种前(2019年5月2日)釆用基施方法，整地后均匀撒施，覆盖薄土后播下种子；处理1：空白对照，不施肥；处理2：常规施肥；处理3：常规施肥+施用灭活后的复合微生物菌剂，以90kg/亩施用灭活后的复合微生物菌剂；处理4：常规施肥+复合微生物菌剂：用法及用量与施用灭活后的复合微生物菌剂相同。生长期间其他施肥、农药管理方法一致。蕹菜于2019年6月6日采收，釆集检测各处理土样的土壤微生物学及土壤化学性状并实测蕹菜产量。(3)结果如下所示荷兰豆：1、不同处理对荷兰豆营养物质的影响。(vc含量、蛋白质、纤维素)不同处理对荷兰豆营养物质的影响结果如表1所示，由表1可知，处理4维生素c含量最高，为19.65mg/100g，比处理3、2、1分别增加了1.49mg/100g、2.63mg/100g和3.67mg/100g；处理4蛋白质含量最高，为1.46g/100g，比处理3、2、1分别增加了0.11g/100g、0.17mg/100g和0.25mg/100g；处理4纤维素的含量有所降低，但与其它处理差异不显著。维生素c是蔬菜营养品质的一个重要指标，维生素c含量的高低和人类健康有着极为密切的关系。研究结果发现，荷兰豆施用复合微生物菌剂后，荷兰豆中的营养物质有显著提高，提高了产品品质。表1复合微生物菌剂对荷兰豆营养品质的影响处理vc含量(mg/100g)蛋白质(g/100g)纤维素(g/100g)115.98±0.26d1.21±0.09d0.72±0.02a217.02±0.31c1.29±0.10c0.67±0.04a318.16±0.29b1.35±0.08b0.65±0.03a419.65±0.39a1.46±0.13a0.64±0.02a注：同列不同字母表示差异达5％显著水平。2、不同处理对荷兰豆产量的影响；不同处理对荷兰豆产量的影响结果如表2所示，试验过程发现，荷兰豆喷施复合微生物菌剂后，随着复合微生物菌剂中荧光假单胞菌向作物根系土壤引植有益微生物优势群体，营养供应充足、植株生长健壮，叶片浓绿有光泽，根系发达，增产效果极显著；处理4每666.7m2平均产量是1671.2kg，比处理3每666.7m2平均产量1571.2kg增加100.0kg，增产6.36％；比处理2每666.7m2平均产量1446.7kg增加224.5kg，增产15.52％；比处理1每666.7m2平均产量1375.6kg增加295.6kg，增产21.49％。对试验处理小区产量方差分析(见表2)，f＝19.683＞f0.01＝7.59，说明处理间产量差异达极显著水平。表2复合微生物菌剂对荷兰豆产量的影响注：同列不同字母表示差异达5％显著水平。3、不同处理对荷兰豆白粉病的影响田间试验调查结果(表3)表明，复合微生物菌剂对荷兰豆的白粉病具有良好的防治作用，其中处理4效果最好，白粉病防治效果达68.30％。田间试验还发现病情指数与植株长势存在一定相关。处理1的病情最为严重，处理2相比处理1，病情指数有小幅下降；处理4、3的病情指数呈现明显下降的情况，推测是由于复合微生物菌剂中的哈茨木霉菌占据生态位抑制了白粉病病原菌的大量繁殖，阻碍了病原菌的侵染，结合球孢白僵菌的诱导抗病性，使得病情指数明显降低，起到防治白粉病效果。表3复合微生物菌剂对荷兰豆白粉病的防治效果蕹菜：1、不同处理对蕹菜产量的影响田间调查表明，处理4施用复合微生物菌剂后能促进蕹菜生长，特别是叶片和根系的生长，蕹菜长势旺盛。处理4蕹菜比处理3蕹菜叶片较厚，叶色浓绿；处理4平均株高62.8cm比处理3平均株高增加4～6cm。不同处理蕹菜产量情况表(见表4)，处理4每666.7m2平均产量是1662.3kg，比处理3每666.7m2平均产量1526.7kg增加135.6kg，增产8.88％；比处理2每666.7m2平均产量1426.7kg增加235.6kg，增产16.5％；比处理1每666.7m2平均产量1420.1kg增加242.2kg，增产17.05％。对试验处理小区产量方差分析(见表4)，f＝18.54＞f0.01＝7.59，说明处理间产量差异达极显著水平。表4不同处理蕹菜产量情况表注：同列不同字母表示差异达5％显著水平。对试验处理小区产量方差分析(见表5)，f＝18.54＞f0.01＝7.59，说明处理间产量差异达极显著水平。对试验处理小区产量进行lsd法多重比较(见表5)，结果表明：处理4与处理3、2、1产量差异达极显著水平，处理3与处理2、1产量差异达极显著水平，处理2与处理1产量差异不显著，说明蕹菜施用复合微生物菌剂有极显著的增产效果。表5不同处理蕹菜产量方差分析表2、不同处理对土壤微生物学特性的影响2.1复合微生物菌剂对土壤微生物量碳、氮的影响复合微生物菌剂对土壤微生物量碳、氮的影响结果如表6，从表6可以看出，处理4施用复合微生物菌剂后土壤微生物量碳(smb-c)为263±28.5mg/kg，比处理1、2、3显著提高，比处理3施用灭活后的复合微生物菌剂(208±31.4mg/kg)平均提高55mg/kg，提高了26.44％；处理4施用复合微生物菌剂后土壤微生物量氮(smb-n)为40.6±6.13mg/kg，比处理1、2、3显著提高，比处理3施用灭活后的复合微生物菌剂(17.3±6.79mg/kg)平均提高23.3mg/kg，提高了134.7％；处理4施用复合微生物菌剂后土壤微生物碳氮比为6.91±1.19比处理1、2、3显著降低，比处理3施用灭活后的复合微生物菌剂(12.6±3.11)平均降低5.69。试验结果表明，施用含活性微生物的复合微生物菌剂能够显著提高土壤微生物量碳(smb-c)和土壤微生物量氮(smb-n)并显著降低土壤微生物碳氮比。表6不同处理土壤微生物学特性变化注：同列不同字母表示差异达5％显著水平。以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12