专利名称：包含改造恒定区的抗体和融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明公开内容涉及基因工程抗体和融合蛋白的领域。更具体而言，本发明公开内容涉及包含如下区域的抗体和/或融合蛋白，该区域包含来源于IgG2的部分和来源于IgG4的部分。
2.相关技术背景通过B淋巴细胞生产抗体并预防感染。抗体的基本结构由通过二硫键连接在一起的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。定位于每条链氨基末端的第一个结构域的氨基酸序列是可变的，从而提供发现于每个个体的广谱抗体结合特异性。这些区域被称作可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区。每条链的其它结构域的氨基酸序列相对来说是不变的，被称作恒定重链(CH)区和恒定轻链(CL)区。抗体的主要种类有IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些种类可以进一步分为亚类(同种型)。例如，IgG具有四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在各种人抗体种类中，只有人IgG1、IgG2、IgG3和IgM已知可以有效激活补体系统。
抗体种类的差异源于重链的差异。已知在抗体成熟的过程中发生种类转换。基本的抗体分子是双功能结构，其中可变区结合抗原，而剩余的恒定区引起特定的效应子功能。铰链区对蛋白酶剪切尤其敏感。依赖于切割的精确位点，这种蛋白酶解生成2个或3个片断。铰链区允许抗原结合区(每个由一条轻链和一条重链的前两个结构域组成)相对于抗体的其它部分(包括剩余的重链结构域)自由运动或旋转。尽管恒定区不参与形成抗原结合位点，恒定结构域和铰链区的排列赋予抗体分子部分灵活性，这允许它与抗原结合。
抗原和抗体之间通过形成如氢键、静电力和范德华力的多种键和吸引力发生相互作用。这些作用相加形成了可观的结合能量，使抗体能够与抗原结合。已知抗体结合的亲和力和强度影响其生理及病理特性。
基因工程技术的出现促生了生产无限量单一抗体(单克隆抗体)的多种途径，这些抗体取决于其同种型，具有不同程度的效应子功能。例如，某些鼠同种型(IgG1、IgG2)以及人同种型(特别是IgG1)能够有效的与细胞(如单核细胞、B细胞及NK细胞)上的Fc受体结合，从而激活这些细胞以释放细胞因子。此类抗体同种型也能够活化补体，导致局部或全身性炎症事件。当向体内注射带有当这些Fc受体结合恒定区的抗体时，由于通过Fc受体-抗体衔接(engagement)而活化包括淋巴细胞或单核细胞的多种细胞型，因此导致肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞间素2(IL-2)和/或其它细胞因子的短暂但重要的全身性释放。细胞因子的释放通常伴随有高烧、寒战和头痛，但较少发展为更加严重的和可能威胁生命的症状，如肺水肿、脑膜炎、神经毒性、低血压以及呼吸窘迫症(细胞因子释放综合症或CRS)。鼠抗体OKT3是一个曾被注意到引起导致CRS的显著细胞因子释放的抗体。人CD3的一部分由至少四个不变多肽链组成，它们与位于T细胞表面的T细胞受体(TCR)非共价结合，通常被称为T细胞受体复合物。T细胞受体复合物在由抗原结合到T细胞受体所引起的T细胞活化过程中起重要作用。某些抗CD3抗体(如OKT3)在没有抗原-TCR连接的情况下能够活化T细胞。这种活化依赖于mAb的Fc部分和佐细胞的Fc受体的相互作用，使T细胞上的CD3复合物发生交联。除非结合到塑料(人为促进CD3交联)或结合到具有Fc受体的细胞上，在体外可溶的抗CD3单克隆抗体不会刺激T细胞繁殖。
需要减少抗体介导的细胞活化事件，例如在这些没有获准和/或有害的事件中降低细胞因子的释放。很多实验室已试图通过改造的抗体来降低如OKT3中观察到的与有效效应子功能相关的负面效应，所述抗体具有表现如降低的Fc受体结合、缺乏补体激活之类特征的不同恒定区。
因此，通过掺入独特的恒定区来降低改造抗体的效应子功能是本发明的目标。
发明概述此处描述了具有改造的重链恒定区的重组抗体。改造的恒定区包括来源于IgG2的部分和来源于IgG4的部分。优选地，来源于IgG2的部分至少包括重链恒定区1和铰链区，来源于IgG4的部分包括重链恒定区2的大部分和整个重链恒定区3。具有依照本发明公开内容的改造重链恒定区且结合细胞表面分子的抗体或可溶性分子降低了Fc受体与抗体衔接所致的不需要的抗体介导细胞活化和炎症事件(包括降低补体活化)。
在另一方面，本发明公开内容涉及生产抗体重链的方法，其包括如下步骤(a)产表达载体，其具有的DNA序列包含编码具有可变区和恒定区的抗体重链的序列；(b)使所述恒定区包含来源于一种或多种人IgG2抗体的第一部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的第二部分；(c)用该载体转染宿主细胞；(d)培养转染的细胞系以产生改造的抗体重链分子，它与抗体轻链相联形成有功能的抗体分子。
在另一方面，本发明公开内容涉及通过用具有改造的重链恒定区的抗体与细胞表面分子相结合或与结合于细胞表面分子的可溶性分子相结合来降低抗体介导的细胞活化和炎症事件的方法，所述改造的重链恒定区具有来源于一种或多种人IgG2抗体的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的另一部分，它与轻链相结合形成功能性抗体分子。
在另一个实施方案中，依照本发明公开内容包含来源于IgG2的部分和来源于IgG4的部分的改造恒定区被用作融合蛋白的Fc区。该融合蛋白包含与Fc区融合的非Fc组分，所述Fc区通过改造而包含来源于IgG2的部分和来源于IgG4的部分。优选地，来源于IgG2的部分至少包括重链恒定区1和铰链区，来源于IgG4的部分包括重链恒定区2的大部分和整个重链恒定区3。优选地，依照本发明公开内容的融合蛋白保持非Fc组分的功能，并且/或者与单独的非Fc组分相比增加了其半衰期，并且/或者缺乏不必要的抗体Fc介导的细胞活化和炎症特性(包括由于Fc受体与抗体衔接和补体活化所产生的事件)。
本发明还提供了编码这种融合蛋白的重组DNA分子。通过在转染的哺乳动物细胞中异源表达，融合蛋白以稳定形式有效分泌，并且展现出所需的抗体和非Fc组分原有分子的特性。这些融合蛋白可用于与单克隆抗体相关的常规应用，包括流式细胞术、免疫组织化学、基于细胞的测定法和免疫沉淀。
附图简述
图1A、B和C示分别意性的表示嵌合的(图1A)、人源化的(图1B)和守全人源的(图1C)重组抗体，它们具有依照本发明公开内容的改造的重链恒定区。
图2显示依照本发明公开内容的改造重链恒定区的氨基酸序列(SEQID NO1)，以及编码此改造重链恒定区的核苷酸序列(SEQ ID NO2)。
图3A和3B分别显示人IgG2(GenBank登录号V00554)和人IgG4(GenBank登录号K01316)的氨基酸及核酸序列。图3C显示质粒pBR322(GenBank登录号J01749)的示意图。
图4A显示载体APEX-13F4VHHuGamma4的示意图。图4B显示此载体的完整核苷酸序列(SEQ ID NO3)，并且指出与不相关的VH区(标记为3F4VH)相邻的higG4插入物的氨基酸(SEQ ID NO4)及核苷酸序列。信号序列、CH1、铰链、CH2和CH3区的位置均显示在图中。
图5A显示载体APEX-13F4VHHuG2/G4的示意图。图5B显示此载体的核苷酸序列(SEQ ID NO5)以及G2/G4插入物的氨基酸(SEQ ID NO6)及核酸序列，并且指出信号序列、不相关的Vh(此处标记为3F4Vh)、CH1、铰链、CH2和CH3区的位置。
图6显示OKT3重链可变区(GenBank登录号A22261)的完整核苷酸序列和氨基酸序列。
图7显示OKT3轻链可变区(GenBank登录号A22259)的完整核苷酸序列和氨基酸序列。
图8显示鼠OKT3重链可变区的完整核苷酸序列(SEQ ID NO7)和氨基酸序列(SEQ ID NO8)，该重链可变区用表达策略#1构建，包括鼠免疫球蛋白启动子，5’端具有内含子的鼠信号序列和位于3’端的剪接供体位点(BamHI)。图上指出了限制酶位点。
图9显示鼠OKT3轻链可变区的完整核苷酸序列(SEQ ID NO9)和氨基酸序列(SEQ ID NO10)，该轻链可变区用表达策略#1构建，包括鼠免疫球蛋白启动子，5’端具有内含子的鼠信号序列和位于3’端的剪接供体位点(BamHI)。图上指出了限制酶位点。
图10显示从载体APEX-13F4VHHuG2/G4上切下的HuG2/G4片断的完整核苷酸序列(SEQ ID NO11)，并且通过在5’末端加入Bam HI位点和来源于天然人IgG4的5’非翻译内含子序列以及在3’末端加入Bgl II位点和来源于天然人IgG4的3’非翻译序列进行修饰，以便插入PUC 19克隆8载体。
图11显示用于表达系统#1的重链表达载体pSVgptHuG2/G4的示意图。
图12显示用于表达系统#1的表达载体pSVgptHuCk的示意图。
图13A、B和C显示用表达策略#2构建的OKT3重链可变区的核苷酸(SEQ ID NO12)和氨基酸(SEQ ID NO13)序列以及huG2/G4恒定区。该构建体缺乏5’前导内含子，并且使用原始OKT3信号序列(如图所示)。图上也指出了限制酶位点。
图14A-D显示用于表达系统#2的表达载体APEX-3P G2/G4的完整核酸序列(SEQ ID NO14)，包括G2/G4插入物的氨基酸序列(SEQ ID NO15)和图示的限制位点。
图15A和B显示用于表达系统#2的表达载体体。通过用重叠40mer的寡核苷酸的基因合成来构建重链和轻链可变区，并通过连接酶反应插入到PUC19克隆载体中。对于表达系统1，通过PCR将包含鼠免疫球蛋白启动子和具有前导内含子的前导序列的序列加到5’端，将包含拼接供体位点的序列加到3’端，从而形成作为Hind III至BamHI片段的重链和轻链(κ)可变区表达盒。图8和图9分别显示了在表达系统1中所用的构建的鼠OKT3重链可变区和鼠OKT3轻链可变区的DNA和氨基酸完整序列。
然后按如下修饰先前描述的改造重链恒定区，以插入到独立的PUC19克隆载体中来源于天然人IgG4的具有5′BamHI位点的5’非翻译内含子序列加到5’末端，来源于天然的人IgG4的具有3′EcoRI和BgIII位点的3’不翻译序列加到3’末端。从PUC19切下作为BamHI和BgIII之间片断的HuG2/G4恒定区，插入重链表达载体pSVgpt.HuG2G4唯一的BamHI位点并且选择正确的方向。图10显示BamHI和BgIII之间HuG2/G4片断的完整核酸序列。
类似地，从PUC19切下作为Hind III与BamHI之间片断的构建的鼠OKT3重链可变区，并且转入包含HuG2/G4插入物的pSVgpt.HuG2G4表达载体中。证实DNA序列是正确的。图11显示重链表达载体pSVgpt.HuG2G4的示意图，并且指出HuG2/G4恒定区相对于载体中包含的构建OKT3可变重链区的位置。
同样从PUC19切下作为Hind III与BamHI之间片断的构建鼠OKT3轻链可变区，并且转入如图12所示的包含人κ恒定区(HuCK)的pSVhygHuCK表达载体中。
另外还生成了另一表达系统，其包含连接人G2/G4恒定区的修饰形式的鼠OKT3可变重链区。这种形式(表达系统2)包括原始OKT3信号序列，并且不包含先前构建体中所描述的免疫球蛋白启动子和内含子序列。通过基因合成来构建嵌合抗体并且连接到包含先前所描述G2/G4恒定区的PUC19克隆载体中。图13显示OKT3VH和人G2/G4插入物的序列(表达系统2)。APEX-3PmOKT3VhG2G4的完整核酸序列(SEQ ID NO16)，包括OKT3可变重链区的氨基酸序列(SEQ ID NO17)和G2/G4插入物。图上指出了限制酶位点。
图16A-F显示用于表达系统#2的PUC19完整核酸序列(SEQ IDNO18)，以及OKT3Vk的氨基酸序列(SEQ ID NO19)和人Ck表达盒。图上指出了限制酶位点。
图17显示用于表达系统#2的穿梭载体LITMUS 28的完整核酸序列(SEQ ID NO20)，以及OKT3VkhCk插入物的氨基酸序列(SEQ ID NO21)。
图18A和B显示用于表达系统#2的APEX-3OKT3Vk+Ck的完整核酸序列(SEQ ID NO22)，以及OKT3Vk和Ck插入物的氨基酸序列(SEQID NO23)。图上指出限制酶位点。
图19A和B显示评估含有G2/G4重链恒定区的抗体结合U937细胞上FcγRI受体能力的测试结果。
图20显示评估含有G2/G4重链恒定区的抗体结合K562细胞上FcγRII受体能力的测试结果。
图21显示设计来评估含有G2/G4重链恒定区的抗体在人PBL中诱导细胞因子产生的能力的测试结果。
图22显示设计来评估含有G2/G4重链恒定区的抗体诱导人T细胞上活化标记物上调的能力的测试结果。
优选实施方案详述描述了具有改造的重链恒定区的重组抗体，所述重链恒定区用于降低由抗体与Fc受体相互作用所引起的抗体介导的细胞活化和炎症事件。改造的重链恒定区包括来源于一种或多种人IgG2抗体亚类的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体亚类的部分。如本领域的技术人员能够理解，抗体重链包括可变区和恒定区。重链恒定区包括重链恒定区1(CH1)、铰链区、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)。在本发明改造的重链中至少CH1、铰链区、CH2或CH3之一的一部分来源于人IG2抗体，并且此改造重链剩余部分至少有一部分来源于人IG4抗体。优选地，整个改造的重链来自于人IG2和IG4部分的组合。
应当理解重链恒定区的两个或多个不连续的部分可以来源于IgG2抗体。在这种情况下，这些部分可以来源于IgG2亚类中的相同或不同抗体(即不同的同种异型抗体)。同样，重链恒定区的两个或多个不连续的部分可以来源于IgG4抗体(注意仅有一种已知的IgG4同种异型)。
在一个如图1所示的尤为有用的实施方案中，改造的重链恒定区包括来源于一种或多种人IgG2抗体亚类的CH1和铰链区，以及主要来源于IgG4抗体亚类的CH2和CH3区。改造的抗体可以为小鼠-人嵌合抗体(图1A)、人源化抗体(图1B)和全人源抗体(图1C)的形式。
应当理解来源于IgG2抗体的部分和来源于IgG4抗体的部分不必在恒定区和/或铰链区的连接处精确终止。例如，在如下实施的实例(见图2)中，来源于IgG2抗体的部分有一些氨基酸延伸出铰链区进入恒定区2，重链恒定区的剩余部分来源于IgG4抗体。
依照本发明公开内容的改造重链恒定区的一个实例具有如图2所示的序列(SEQ ID NO1)。图2还显示编码此改造重链恒定区的核苷酸序列(SEQ ID NO2)。
选择重链恒定区的IgG2和IgG4部分来降低能够导致细胞因子过量释放从而潜在地导致细胞因子释放综合症(CRS)的细胞相互作用。依照本发明公开内容的改造重链恒定区还降低了抗体引发炎症事件的能力，所述炎症事件如细胞活化、细胞因子释放和补体活化。
根据结合特异性来选择抗体的重链可变区，并且可以是任何类型，例如，非人的、人源化的或全人源的。当抗体重链可变区为非人的(例如鼠的)并与依照本发明公开内容的改造重链恒定区重组组合时，形成的重组抗体被称为嵌合抗体(如图1A)。当抗体重链可变区为人源化的并与依照本发明公开内容的改造重链恒定区重组组合时，形成的重组抗体被称为人源化抗体(如图1B)。当抗体重链可变区为人的并与依照本发明公开内容的改造重链恒定区重组组合时，形成的重组抗体被称为全人源抗体(如图1C)。在图1B所示的实施方案中，重链可变区被人源化，它包括人构架区和非人(此处为鼠)互补决定区(CDR)。应当理解构架区可以是一个或多个来源，并且CDR也可以是一个或多个来源。抗体人源化方法为本领域的技术人员所公知，并且已在例如美国专利No 6,479,284、6,407,213、6,350,861、6,180,370、6,548,640、于2002年12月3日提交的共同未决的美国专利申请No.PCT/US 02/38450中公开。所有这些专利和专利申请的公开内容在此处整体引入作为参考。
抗体的轻链可以是人、非人或人源化的。在图1B所示的实施方案中，轻链是人源化的，并包含人构架区、非人(此处为鼠)CDR和人恒定区。应当理解构架区可以是一个或多个来源，并且CDR也可以是一个或多个来源。
基于抗体与细胞表面分子或与细胞表面分子相结合的可溶性分子结合的能力来选择包含改造的重链恒定区的抗体。因此例如可以基于抗体与细胞表面分子结合的能力选择抗体，所述细胞表面分子如细胞因子受体(如IL-2R、TNF-αR、IL-15R等)、黏着分子(如E-选择蛋白、P-选择蛋白、L-选择蛋白、VCAM、ICAM等)、细胞分化或活化抗原(如CD3、CD4、CD8、CD20、CD25、CD40等)及其它。另外，可以基于抗体与结合于细胞表面分子的可溶性分子结合的能力来选择抗体。这种可溶性分子包括(但不限于)细胞因子和趋化因子(如白细胞间素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6等)、生长因子(如EGF、PGDF、GM-CSF、HGF、IGF等)、诱导细胞分化的分子(如EPO、TPO、SCF、PTN等)及其它。
此处所用的术语“抗体”包括完整抗体和含有CH1、铰链区、CH2或CH3中至少两个的抗体片断，优选完整的单克隆抗体。
一般而言，此处公开的抗体的构建是通过用基因工程技术中所用的公认的操作来实现。例如，分离DNA、构建和选择用于表达DNA的载体、纯化和分析核酸、构建重组载体DNA的特定方法、用限制酶切割DNA、连接DNA、通过稳定或瞬时的手段将DNA(包括载体DNA)引入宿主细胞、在选择性或非选择性培养基中培养宿主细胞以选择和维持表达DNA的细胞的技术为本领域所公知。
此处公开的单克隆抗体可以用杂交瘤细胞方法(Kohler等，Nature，256495，1975)，或者本领域中众所周知的其它重组DNA的方法得到。在杂交瘤细胞方法中，用引起淋巴细胞产生抗体的蛋白质免疫小鼠或其它适当的宿主动物。另外，可以在体外免疫淋巴细胞。然后用合适的融合剂(如聚乙二醇)将应答抗原而产生的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103页(Academic Press，1986))。然后杂交瘤细胞在适当的培养基(优选包含抑制非融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质)中接种和生长。优选的骨髓瘤细胞可以有效地融合，支持通过选择抗体产生细胞稳定生产抗体，并且对例如HAT培养基(Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.，Catalog No.H-0262)之类的培养基不敏感。其中，优选鼠骨髓瘤细胞系，例如可从Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA得到的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，以及可从美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md.USA得到的SP-20，NS0或X63-Ag8-653细胞。
杂交瘤细胞在选择性培养基(例如HAT)中生长，扩增存活细胞并测定针对抗原的单克隆抗体的产生。杂交瘤细胞生产的单克隆抗体结合特异性可以通过如免疫沉淀、放射性免疫测定(RIA)、流式细胞术、细胞活化测定或酶联免疫吸附测定(ELISA)之类的测定来确定。
当鉴定出产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，这些克隆可以通过有限稀释法进行亚克隆并且通过标准方法(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103页(AcademicPress，1986))生长。此外，杂交瘤细胞可以作为腹水瘤在动物体内生长。这些亚克隆分泌的单克隆抗体适于通过常规免疫球蛋白纯化方法(例如，A蛋白Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)从培养基腹水或血清中分离。编码单克隆抗体的DNA易于通过常规方法分离并测序(如通过使用能够特异结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是该类DNA的优选来源。一旦被分离，该DNA可以置于表达载体中，该载体随后被转染到宿主细胞(如大肠杆菌细胞或不另外产生免疫球蛋白的哺乳动物细胞)中，使单克隆抗体在重组宿主细胞合成。也可以从噬菌体抗体库分离抗体或抗体片段，所述抗体库通过McCafferty等，Nature，348552-554(1990)中所描述的技术产生。其他出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology，10779-783，1992)生产高亲和力(nM范围)人抗体以及组合感染和体内重组作为策略构建大型噬菌体文库(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res .，212265-2266，1993)。因此，这些技术是除了传统单克隆抗体杂交瘤技术之外，用于分离抗原特异性单克隆抗体的可行选择。
然后通过组合此处改造的IgG2/IgG4来源的人重链恒定结构域编码序列与重链可变结构域编码序列来修饰此处所描述的抗体。当重组抗体是基于特定的鼠抗体时，例如依照本发明公开内容的改造重链恒定区可以用同源鼠序列代替。另外，可以鉴定功能性抗体片断(例如，通过筛选人噬菌体文库、ScFv文库或Fab文库)，此改造本发明改造的IgG2/IgG4来源的人重链恒定结构域。
在另一方面，本发明公开内容提供了重组表达载体，其包含生产改造的重链恒定区所必需的合成、基因组或cDNA来源的核酸片断。编码依照本发明公开内容的任何改造的重链恒定区或者包含改造重链恒定区的抗体的核苷酸序列，可以插入到包含转录和翻译插入的蛋白编码序列所必需的元件的适当载体中。任何适当的宿主细胞载体都可以用于表达编码嵌合或CDR嫁接重链和轻链的DNA序列。可以用细菌(例如大肠杆菌)和其它微生物系统。可以用真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统来获得本发明的抗体。适当的哺乳动物宿主细胞包括COS细胞和CHO细胞(Bebbington C R(1991)Methods 2 136-145)，以及骨髓瘤或杂交瘤细胞系(例如NSO细胞(Bebbington等，Bio Technology，10169-175(1992))。
包含改造重链恒定区的抗体还可以联合治疗剂作为单独施用的组合物。出于诊断的需要，该抗体标记与否均可。不标记的抗体可以与其他标记抗体(第二抗体)组合使用，上述标记抗体能与去免疫原性抗CD3抗体反应，如与免疫球蛋白恒定区特异性抗体反应。或者，也可以直接标记去免疫原性抗体。可以使用很多不同的标记，如放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。可以使用多种类型的免疫测定法，这些方法均为本领域技术人员众所周知。
本发明的改造抗体可以以含有可药用载体的组合物施用于患者。可药用载体可以是任何适合向患者递送抗体的相容、无毒物质。载体中可以含有无菌水、醇类、脂肪、蜡质以及惰性固体。药物组合物中还可以含有可药用佐剂(缓冲剂、分散剂)。
抗体组合物可以通过多种途径施用于患者。药物组合物优选经肠胃外途径(如皮下、肌内或静脉内)施用。因此，用于肠胃外施用的组合物可以包括抗体、抗体片段或其混合物溶解于适当的载体(优选水性载体)的溶液。可以使用多种水性载体，如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液均为无菌且通常不含有颗粒物质。可以采用常规、为人熟知的灭菌技术将这些组合物灭菌。这些组合物中也可能含有为接近生理条件所需的可药用的辅助物质，如pH调节及缓冲剂、毒性调节剂之类，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。这些制剂中抗体或抗体片段浓度可以大不相同，例如以重量计从低于约0.5％，通常为或至少为约1％到多达15％或20％，根据所选的具体施用方式，主要基于液体体积、粘度进行选择。
制备肠胃外施用的组合物的实际方法以及就施用于受试者所必需的修饰，对本领域技术人员而言为公知且显而易见的，并在如《Remington’sPharmaceutical Science》，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa(1985)中有详细介绍，该书此处其以整体引用作为参考。
在另一个实施方案中，本发明公开内容提供了包含与Fc区融合的非Fc组分的融合蛋白，所述Fc区经过改造后包含来源于IgG2的部分和来源于IgG4的部分。Fc区可以是依照上述关于抗体的多种实施方案的任一改造恒定区。Fc区可以包含CH1、铰链、CH2和CH3结构域的全部或任何部分，但必须包含至少一个来源于IgG2的部分和至少一个来源于IgG4的部分。优选地，来源于IgG2的部分至少包括重链恒定区1和铰链区，来源于IgG4的部分包括重链恒定区2的大部分和重链恒定区3的全部。可以任选地在非Fc组分和Fc组分之间加入接头。当存在接头的时候，接头可以为3-25个氨基酸长。在尤为有用的实施方案中，接头帮助维持非Fc组分的适当折叠和功能。
优选地，依照本发明公开内容的融合蛋白保持非Fc部分的功能，并且/或者与单独的非Fc部分相比具有增加的半衰期。此外，依照本发明公开内容的融合蛋白优选缺乏不需要的抗体Fc介导的细胞活化和炎症特性(包括由于Fc受体与抗体衔接和补体活化所产生的事件)。此外，依照本发明公开内容特定实施方案的包括铰链区的融合蛋白具有与其它融合蛋白分子形成二硫键的能力，因此导致形成可以增加分子非Fc部分与它所结合部分亲和力的二聚体。
依照本发明公开内容的融合蛋白可以通过编码此分子的DNA转染的哺乳动物细胞以稳定形式容易地分泌。此外，它们易于迅速有效地纯化(例如使用A蛋)至均一性。因为由此可获得这些分子商业有用的量和形式，因此它们在流式细胞术、免疫组织化学、免疫沉淀、基于细胞的测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)等情况下是单克隆抗体的有利替代品。
任何呈现出有用特性的肽或蛋白质都适合用作与本改造抗体恒定区组合来制备融合蛋白的非Fc组分。肽或蛋白质的活性和用途包括(但不限于)作为激动剂或拮抗剂、结合受体、结合膜联表面分子、结合可溶性蛋白质、结合配体、结合酶或结构蛋白质、活化或抑制受体、靶向药物投递或任何酶促活性。通常选择与Fc结构域组合时能够增加稳定性和半衰期，从而增加其效用的肽或蛋白质。应当理解此处所用的“生物活性”包括生物系统中具有活性的分子的任何活性，包括(但不限于)通过蛋白质-蛋白质相互作用所引发的刺激或抑制活性，以及围绕这种相互作用的动力学，包括蛋白质-蛋白质复合物的稳定性。因此，适于用作非Fc组分的分子的非限制性实例包括细胞因子、激素、酶、配体、生长因子、受体和抗体片断。
适用于制备本发明融合蛋白的适当非Fc组分包括结合通过配体诱导的同型二聚化所活化的受体的肽，包括显示出Whitty和Borysenko，ChemBiol.，(1999)Apr 6(4)R107-18中所描述的G-CSF活性、GHR活性和催乳素活性的活性片断。其它适当的肽的实例包括在Zaccaro等，Med.Chem.(2000)43(19)；3530-40中描述的源于CD环的神经生长因子模拟物；在Eckenberg等，J.Immunol.(2000)165(8)4312-8中描述的IL-2模拟物；在Evans等，Drugs R.D.(1999)2(2)75-94中描述的胰高血糖素样肽1；在Gagnon等，Vaccine(2000)18(18)1886-92中描述的刺激有丝分裂原活化的B细胞增殖的四肽I(D-赖氨酸-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酸)；人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的结合结构域。也考虑表现出受体拮抗剂活性的肽。例如，在Luo等，Biochemistry(2000)39(44)13545-50中描述的作为治疗HIV的CXCR4拮抗剂的vMIP-II N末端肽；在Pakala等，Thromb.Res.(2000)100(1)89-96中描述的抗凝剂治疗的凝血酶受体拮抗肽配体；在owell等，Br.J.Pharmacol.(2000)131(5)875-84中描述的削弱对麻醉药耐受的肽CGRP受体拮抗剂CGRP(8-37)；在Hoare等，J.Pharmacol.Exp.Ther.(2000)295(2)761-70中描述的被称为结节漏斗肽(7-39)的甲状旁腺激素(PTH)-1受体拮抗剂；在Zagon等，Int.J.Oncol.(2000)17(5)1053-61中描述的阿片样生长因子；在Yanofsky，等，Proc.Natal.Acad.Sci.USA，第93卷，7381-7386页，July 1996和Vigers，等，J.Biol.Chem.，第275卷，No 47，36927-36933页，2000中公开的高亲和力I型白细胞间素1受体拮抗剂；以及在Fan等，IUBMB Life(2000)49(6)545-48中描述的酸性成纤维细胞生长因子结合肽。可以与依照本发明公开内容的Fc区融合的生物活性肽的其它实例包括作为身体应答于充血性的心脏衰竭的一部分的心脏分泌蛋白质，例如，在Mukoyama等，J.Clin.Invest.87(4)1402-12(1991)和Clemens，等，J.Pharmacol.Exp.Ther．287(1)67-71(1998)中描述的人脑钠肽(hBNP)。依照本发明公开内容可用的生物活性肽的其它实例包括具有潜力保护或改进β细胞功能(例如通过诱导葡萄糖依赖的促胰岛素效应)的蛋白质，例如胰高血糖素样肽抑制剂4、GLP-1(7-36)、GPL-2(1-34)、胰高血糖素或PACAP-38(参见，Raufman等，J.Biol.Chem.267(30)21432-7(1992))。还应当理解抗体片断也能用作融合蛋白的非Fc组分。因此，例如非Fc组分可以是Sc-Fv、F(ab)或F(ab)’2抗体可变区。作为另一实例，非Fc部分可以是抗体可变区，其中如WO02/46238A2所描述的已经插入模拟肽或用模拟肽取代一个或多个CDR区，WO02/46238A2的公开内容在此整体引入作为参考。
因此，用于构建融合蛋白的非Fc组分可以是例如生长因子。生长因子的实例包括血小板来源的生长因子(PDGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因素(TGF)、肝生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、Wnt-2原癌基因(wnt-2)产物。Aaronson前述；Norman等，《HORMONES》，719-748页(AcademicPress1987)。此外，通常参见Heath(编)，《GROWTH FACTORS》，IRLPress(1990)。
1.融合蛋白的产生A.融合蛋白表达载体的构建本领域的技术人员认识范围内的任何技术都可用来产生包含来源于IgG2的部分来源于和IgG4的部分以及非Fc部分的融合蛋白。适当的技术包括(但不限于)美国专利No.5,670,625、5,726,044和6,403,769中所公开的方法。在其中一种技术中，由哺乳动物细胞以稳定形式分泌融合蛋白，编码此融合蛋白的DNA序列亚克隆入用于转染哺乳动物细胞的表达载体中。在Coligan等(编)，《CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY》，10.19.1-10.19.11页(Wiley Interscience 1992)中描述了用于产生包含抗体序列的融合蛋白的一般技术，其内容在此处引入作为参考。另外参考《METHODSA COMPANION TO METHODS INENZYMOLOGY》，第2卷(No.2)，Academic Press(1991)和《ANTIBODYENGINEERINGA PRACTICAL GUIDE》，W.H.Freeman and Company(1992)，其中生产融合蛋白相关的注释贯穿于各教科书。本发明方法并不限于任何特定的表达方法。因此能够用真核(例如哺乳动物、昆虫)或原核(例如细菌)细胞实现表达，并且融合蛋白可以由细胞分泌或从细胞外周胞质或胞涵体回收。
因此，构建融合蛋白的一个步骤是把融合蛋白的部分亚克隆入克隆载体。在本文中，“克隆载体”是DNA分子，例如质粒、黏粒或噬菌体，它们能在原核宿主细胞中自主复制。克隆载体通常包含一个或少数限制性内切酶识别位点，在这些位点处外源DNA序列以可确定的方式插入，但载体不会损失基本生物功能，载体包含标记基因，它适合用于鉴定和选择转入克隆载体的细胞。标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。在Sambrook等(编)，《MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL》，第2版(Cold Spring Harbor Press 1989)(此后称为″Sambrook″)；Ausubel等(编)，《CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY》(Wiley Interscience 1987)(此后称为″Ausubel″)；以及Brown(编)，《MOLECULAR BIOLOGYLABFAX》(Academic Press 1991)中描述了适当的克隆载体。可以通过商业获得适当的克隆载体。
可以用本领域的技术人员认识范围内的任何技术来获得编码融合蛋白Fc区的DNA序列。也可以用本领域的技术人员认识范围内的任何技术合成编码融合蛋白非Fc部分的DNA序列，例如用从产生非抗体蛋白质的细胞中分离到的RNA进行PCR。DNA可以包含内含子或者通过改造除去某些或所有内含子。
编码融合蛋白非Fc部分的DNA序列与融合蛋白Fc区部分的N末端亚克隆入同一个框内。依照本领域的技术人员认识范围内的技术进行亚克隆，例如用限制酶消化来提供适当的末端，用碱性磷酸酶处理来避免不需要的DNA分子结合，以及通过适当的连接酶的连接。在Sambrook和Ausubel中描述了在本领域中众所周知的用于这种操作的技术。用于在细菌宿主中扩增克隆DNA和从细菌宿主中分离克隆DNA的技术也是众所周知的。
当然应当理解Fc区可以克隆到非Fc组分的氨基末端(如果需要的话)。
从克隆载体上切下克隆的融合蛋白并且插入表达载体中。适当的表达载体通常包含(1)编码细菌复制起始点以及提供表达载体在细菌宿主中生长和选择的抗生素抗性标记物的原核DNA元件；(2)控制转录起始的真核DNA元件，例如启动子；以及(3)控制转物加工的DNA元件，例如转录终止/多腺苷酸化序列。
依照本发明公开内容的融合蛋白可以在真核细胞中表达，例如哺乳动物、昆虫和酵母细胞。在真核宿主中尤为优选哺乳动物细胞，因为哺乳动物细胞提供适当的翻译后修饰，入糖基化。哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢细胞(COS-1；ATCC CCL61)、大鼠垂体细胞(GH1；ATCCCCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝细胞瘤细胞(H-4-II-E；ATCC CRL1548)、SV40转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)和鼠胚胎细胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)。
对哺乳动物宿主，转录和翻译调节信号可以来自病毒来源，例如腺病毒、巨细胞病毒、牛乳头状瘤病毒、猿病毒等，其中调节信号与高水平表达的特定基因相关。适当的转录和翻译调节序列还能够从哺乳动物基因中获得，例如肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白和金属硫蛋白基因。
转录调节序列包括足以指导RNA合成起始的启动子区域。适当的真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因启动子(Hamer等，J.Molec.Appl.Genet.1273(1982))；疱疹病毒TK启动子(McKnight，Cell 31355(1982))；SV40早期启动子(Benoist等，Nature 290304(1981))；劳氏肉瘤病毒启动子(Gorman等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 796777(1982))；以及巨细胞病毒启动子(Foecking等，Gene 45101(1980))。
另外，如果用真核启动子调节原核启动子，那么原核启动子(例如噬菌体T3RNA聚合酶启动子)可用于控制融合基因表达。Zhou等，Mol.Cell.Biol.104529(1990)；Kaufman等，Nucl.Acids Res.194485(1991)。
可以用多种技术将表达载体引入宿主细胞，包括磷酸钙转染、脂质体介导的转染、电穿孔等。优选地，选择和繁殖表达载体稳定整合入宿主细胞基因组从而产生稳定转化体的转染细胞。在Sambrook、Ausubel、Bebbington、《2METHODSA COMPANION TO METHODS INENZYMOLOGY 136》(1991)中的″Expression of Antibody Genes inNonlymphoid Mammalian Cells″，以及Murray(编)，《GENE TRANSFERAND EXPRESSION PROTOCOLS》(Humana Press 1991)中描述了把载体引入真核细胞的技术和用一个显性选择标记来选择稳定转化体的技术。
可以用多种方法鉴定产生融合蛋白的稳定转化体。例如可以用结合融合蛋白非抗体部分或抗体部分的抗体来筛选稳定转化体。用免疫沉淀来鉴定细胞是本领域技术人员众所周知的技术。
当鉴定出产生融合蛋白的细胞之后，培养这些细胞并从培养物上清液中分离融合蛋白。适当的分离技术包括用A蛋白Sepharose进行亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析。A蛋白是从上清液中分离融合蛋白的尤为有用的方法。
可以用常规测定法确定融合蛋白的非Fc部分是否保持其功能性。
可以用任何适当的标记物部分可检测性地标记融合蛋白，所述标记物部分例如放射性同位素、酶、荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物或顺磁标记物。构建和检测这种可检测性标记融合蛋白的方法为本领域技术人员所众所周知。
可以用体外或原位检测方法来帮助诊断或病理情况分期。本发明公开内容还设想了融合蛋白在体内诊断中的用途。
依照本发明公开内容的融合蛋白可以配制进可药用组合物中，并且按照上文抗体实施方案所描述的方式施用。
以下实施例旨在阐明但非限制本发明。尽管它们是可用的典型的实例，也可用本领域技术人员所公知的其它方法进行替代。
实施例1具有改造的重链恒定区的抗CD3抗体通过标准重组DNA方法把OKT3可变重链连接到包含来源于人IgG2的第一个重链恒定区(CH1)、铰链接头区和第二个重链恒定区(CH2)前部数几个氨基酸的基因组DNA盒。然后加入包含第二个重链恒定区(CH2)剩余部分和来源于人IgG4的第三个重链恒定区(CH3)的盒。选择IgG2铰链区和其后氨基酸来降低抗体与Fcγ受体的结合，选择IgG4区来阻止抗体介导的补体活化。
改造的重链恒定区的制备FDA的Ed Max博士提供了作为细菌载体质粒pBR322的插入物的(参见图3C)人IgG2重链恒定区(GenBank登录号V00554；参见图3A)或人IgG4重链恒定区(GenBank登录号K01316；参见图3B)的基因组DNA。通过限制酶分析和完整DNA测序证实获得了人IgG4和IgG2恒定区的正确序列。通过用Hind III和XhoI限制性消化从质粒释放IgG4来源的插入物。通过纯化、剪切和进一步限制性分析插入物来证实发表的人IgG4基因组DNA序列。然后基因组IgG4插入物(Hind III/SmaI限制片断；SmaI位点大约在距离3’翻译终止位点30bp的3’不翻译区)通过连接进表达盒APEX-1(参见图4A和4B，APEX-1 3F4VHHuGamma4)而被亚克隆。通过DNA序列分析证实所需的人IgG4区域的序列正确性。
用包含编码人IgG2的基因组DNA的pBR322质粒作为IgG2CH1、铰链区和CH2第一部分的来源，通过PmII和Bst EII剪切并亚克隆到APEX-13F4VHGamma4中，代替相应的IgG4来源的序列(参见图5A)。图5B 显示生成的嵌合IgG2/IgG4人恒定区的序列(APEX-13F4VHHu G2/G4)。
基于鼠OKT3可变区和人G2/G4重链恒定区的嵌合抗体的制备先前确定了鼠单克隆抗体OKT3重链和轻链可变序列并且存储于GenBank数据库中(登录号分别为A22261(图6)和A22259(图7))。通过两种不同表达系统，用OKT3可变区和人G2/G4恒定区生成嵌合抗用BamHI/BgIII消化从Puc19中切下G2/G4恒定区并且用凝胶分离。然后这些片断从BamHI位点连接到表达载体APEX-3P，生成APEX3PG2/G4(参见图14)。用BsiWI/BamHI消化从上述PUC19载体中分离鼠OKT3VH，并且通过用BamHI-BsiWI接头在其5’末端加入BamHI位点进行修饰。用于生成BamHI-BsiWI的粘性末端接头二联体具有如下序列接头5′------GATCCGCGGCCGC--------------------3′(Seq.IDNo.50)接头3′---------------GCGCCGGCGCATG-------5′(Seq.IDNO51)然后用BamHI打开APEX-3PG2/G4载体，并且插入修饰的OKT3VH区，从而生成表达载体APEX-3PmOKT3VhG2G4(图15)。类似地，包含原始的鼠OKT3VK信号序列和可变κ序列(没有内含子)的另一个OKT3轻链盒连接到人κ轻链恒定区。这通过用基因合成构建OKT3VK基因序列，并且把作为Hind III-BamHI片断的此序列连接到先前插入PUC19克隆载体的人κ恒定区基因序列中而得以完成。图16显示生成的质粒序列。然后用BsiWI/EcoRI从此载体切下OKT3 VK序列，用BsgI/EcoRI从同样的载体中切下hCK。为了把两个片断转入表达载体APEX-3P中，使用商用穿梭载体LITMUS 28(NewEngland′Biolabs，Inc.，Beverly，MA)。用BsiWI/EcoRI消化来打开LITMUS28，并且与OKT3 VK片断连接生成LITMUS28mOKT3(未显示载体)，然后用EcoRI/Bsgl消化打开此载体并且连接上文的hCK片断，从而生成LITMUS28mOKT3VKhCK(图17)。然后用BgIII/BamHI消化此构建体以分离完整的mOKT3VKhCK片断。用BamHI打开表达载体APEX-3P并与mOKT3VKhCK片断连接，从而生成APEX-3OKT3VK+CK(图18)。
包含人G2/G4恒定区的嵌合抗体与人IgG受体(FcγRI)结合能力的评估针对T细胞受体复合物CD3ε组分的抗体(例如OKT3)可以通过交联TCR来活化人T细胞。然而，已知交联需要通过高和低亲和力Fc受体结合抗体Fc部分的佐细胞。测试依照本实施例产生的抗体以评估它与人高亲和力IgG受体(FcγRI)的结合。U937细胞系与指示浓度的生物素化hIgG(Sigma)在4℃孵育15分钟，洗涤，与亲和素-藻红蛋白(SA-PE)在4℃孵育15分钟，洗涤，然后用Becton Dickenson FACS Calibur流式细胞仪进行流式细胞术分析。如图19A所示，产生的结合曲线显示浓度大约2-4ng/mL的生物素化hIgG适合于进一步竞争性研究。U937细胞与3.0ng/mL生物素化hIgG以及指示浓度的竞争性抗体在冰上孵育30分钟，洗涤，用SA-PE孵育15分钟，洗涤，然后通过流式细胞术进行分析(图19B)。mOKT3、hIgG1和hIgG4的制备有效地封闭生物素化hIgG与靶细胞的结合，表明它们结合FcγRI受体。然而，本实施例的重组嵌合抗体(包含改造的IgG2/IgG4人恒定区)不会竞争结合这些细胞上的FcγRI受体，表明包含此修饰恒定区的抗体不会结合FcγRI。
与低亲和力IgG人受体(FcγRII)结合的评估测试依照本实施例产生的包含改造IgG2/IgG4人恒定区的嵌合抗体与人低亲和力IgG受体结合的能力。为了揭示与低亲和力Fc受体的结合，首先通过与等摩尔浓度荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的兔Fab′2抗人Fab′2抗体在4℃孵育过夜来复合抗体制备物。带有人低亲和力IgG受体(FcγRII)两种同种异型的K562细胞系与指示浓度的抗体复合物在冰上孵育30分钟，洗涤，用Becton Dickenson FACS Calibur流式细胞仪通过流式细胞术分析结合抗体。如图20所示，人IgG1抗体复合物显示与K562细胞有效结合，而hIgG2抗体复合物显示低的多的结合水平。人IgG4和嵌合OKT3hG2/G4重组抗体形成不能结合这些细胞上低亲和力FcγRII受体的抗体复合物。另外显示了单独的FITC-兔Fab’2抗人Fab’2抗体的结合。
在PBL中诱导产生细胞因子的能力的评估评估了抗人CD3并且包含改造的IgG2/IgG4人恒定区的实施例1中的嵌合抗体诱导外周血白细胞(PBL)生成细胞因子的能力。通过Ficoll-Hypaque密度沉降从来自一组供体的新鲜分离的人外周血中富集白细胞级分。生成的PBL与带有鼠IgG2a恒定区(OKT3)或人IgGG2/G4恒定区(OKT3hG2/G4)(参见图21)的指示浓度的抗CD3抗体孵育。在24和36小时收集上清液，并且通过夹层ELISA评估TNF-α(A)和IL-2(B)的聚集。图21显示的图表代表观察到特定细胞因子峰水平的时间点(例如24小时观察到IL-2，36小时观察到TNF-α)。结合人FcγRI和FcγRII受体的OKT3抗体诱导大量的两种细胞因子。然而，像OKT3一样结合相同CD3ε表位，但丧失结合Fc受体能力的嵌合重组抗体OKT3hG2/G4不能刺激任何检测的细胞因子产生显著的水平。
评估活化来源于人PBL的靶T细胞的能力评估了抗人CD3并且包含改造IgG2/IgG4人恒定区的实施例1嵌合抗体活化来源于人PBL的靶T细胞的能力。CD25是白细胞间素2(IL-2)的受体，并且通过T细胞受体复合物的活化，它在T细胞表面的表达上调。类似地，CD69也是一个早期T细胞活化标记物，通过T细胞受体衔接，其表达水平增加。因此这两种标记物都适用于T细胞活化的灵敏测量。通过Ficoll-Hypaque密度沉降从来自一组供体的新鲜分离的人外周血中富集白细胞级分。产生的PBL在不存在或存在带有鼠IgG2a恒定区(OKT3)或人IgGG2/G4恒定区(OKT3hG2/G4)(参见图22)的指示浓度的抗CD3抗体的情况下孵育。在24小时收获细胞，洗涤，并且与人CD25和人CD69特异的FITC缀合的单克隆抗体在冰上孵育30分钟。洗涤细胞并用BectonDickenson FACS Calibur流式细胞仪通过流式细胞述分析抗体的结合。图22A和22B显示一个代表性供体的数据，指出了表达CD25(A)或CD69(B)的细胞的百分比。
具有人G2G4Fc部分的人L-SIGN-Fc融合蛋白的产生和表达通过融合来源于编码人L-SIGN(作为非Fc组分)和人免疫球蛋白HuG2G4的cDNA的两个PCR片断产生人L-SIGN-人G2G4融合蛋白。用寡聚核苷酸P1(cagatgtgatatcTCCAAGGTCCCCAGCTCCCTAAG(SEQ ID NO52))和P2(tgggctcgagTTCGTCTCTGAAGCAGGCTGCG(SEQ ID NO53))来扩增来源于人脾cDNA文库的hL-SIGN的胞外部分(用大写字母显示与人L-SIGN互补的引物区域)。P1包含一个上游EcoRV限制性内切酶位点，用于融合前导序列(KLV56)。P2中的下游XhoI限制性内切酶位点用于融合hG2G4Fc区。用引物P3(agacgaactcGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGT(SEQ ID NO54))和P4(cggccctggcactcaTTTACCCAGAGACAGGGAGAGGCT(SEQ ID NO55))通过包含人G2G4恒定区的质粒来扩增从Glu99铰链结构域到羧基末端的人G2G4杂合Fc区。大写字母表示与人G2G4序列互补的区域。在P3中，设计上游XhoI限制性内切酶位点用于与hL-SIGN连接。P4包含一个终止密码子和NgoMIV限制性内切酶位点的下游序列。PCR扩增的人L-SIGN和人G2G4Fc区片断通过的克隆到pCR2.1载体并且证实了其精确序列。用EcRV/XhoI消化形成的质粒pCR2.1hL-SIGN，并且用XhoI/NgoMIV消化质粒pCR2.1 hG2G4。形成的L-SIGN和hG2G4片断连接进修饰的Apex3P质粒(AlexionPharmaceuticals，Inc.)。EcoRV/NgoMIV包含具有Kozak序列和相应于起始甲硫氨酸密码子的ATG的KLV56前导序列(5′-CGCCCTTCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT-3′(SEQ ID NO56))。
细胞培养和蛋白质纯化用Apex3P-hL-SIGNhG2G4转染的293EBNA人胚胎肾细胞生长于含有10％热灭活的FBS、100IU/ml青霉素、100□g/ml链霉素、具250μg/mlG418硫酸盐的2mM谷氨酰胺和1μg/ml嘌呤霉素的DMEM(Celigro#10-013-CV)。在37℃和5％CO2中生长和选择细胞。用15ml HBSS洗涤选择细胞的ConfluentT-175培养瓶，以便在向每个烧瓶加入补充L-谷氨酰胺(瓶上标明量)和青霉素/链霉素的30ml IS Pro无血清培养基(IrvineScientific，Santa Ana，CA，目录号#91103)之前除去血清蛋白质。通过A蛋白层析浓缩和纯化二到三天的上清液。
贯穿于整个说明书参考了多种出版物和专利公开内容。其教导和公开内容在此处整体引入此申请作为参考，以便更充分地描述本发明所属领域的状态。
尽管此处描述了本发明优选的和其它的实施方案，本领域的技术人员可以设想不背离如下权利要求书所定义的本发明范围的其它实施方案。
权利要求
1.用于减弱抗体介导的细胞活化或炎症事件的方法，其包括施用与细胞表面分子或结合于细胞表面分子的可溶性分子相结合的抗体，此抗体包括具有来源于一种或多种人IgG2抗体的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的另一部分的改造重链恒定区。
2.如权利要求1的方法，其中至少CH1和铰链区来源于一种或多种人IgG2抗体，至少CH2和CH3区的一部分来源于一种或多种人IgG4抗体。
3.如权利要求1的方法，其中抗体结合人补体组分。
4.如权利要求1的方法，其中抗体结合细胞因子受体。
5.如权利要求1的方法，其中抗体结合黏着分子。
6.如权利要求1的方法，其中抗体结合细胞分化抗原。
7.如权利要求1的方法，其中抗体结合细胞活化抗原。
8.如权利要求1的方法，其中抗体结合与细胞表面分子相结合的可溶性分子。
9.如权利要求1的方法，其中抗体结合细胞因子。
10.如权利要求1的方法，其中抗体结合趋化因子。
11.如权利要求1的方法，其中抗体结合生长因子。
12.如权利要求1的方法，其中抗体结合诱导细胞分化的分子。
13.如权利要求1的方法，其中抗体结合诱导细胞活化的分子。
14.如权利要求1的方法，其中抗体结合细胞表面分子。
15.阻止或降低细胞因子释放的方法，其包括施用与细胞表面分子或结合于细胞表面分子的可溶性分子相结合的抗体，此抗体包括具有来源于一种或多种人IgG2抗体的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的另一部分的改造重链恒定区。
16.用于预防或降低细胞因子释放综合症严重程度的方法，其包括施用与细胞表面分子或结合于细胞表面分子的可溶性分子相结合的抗体，此抗体包括具有来源于一种或多种人IgG2抗体的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的另一部分的改造重链恒定区。
17.包含非Fc组分和Fc区的融合蛋白，所述Fc区具有来源于一种或多种人IgG2抗体的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的另一部分。
18.权利要求17中的融合蛋白，其中Fc区至少包含CH1区的一部分。
19.权利要求17中的融合蛋白，其中Fc区不包含CH1区的任何部分。
20.权利要求17中的融合蛋白，其中Fc区至少包含铰链区的一部分。
21.权利要求17中的融合蛋白，其中非Fc组分包含抗体片断。
22.权利要求17中的融合蛋白，其中非Fc组分选自单链、scFv、f(ab)和F(ab)′2。
23.权利要求17中的融合蛋白，其中非Fc组分包含抗体可变区，所述可变区具有插入的或代替至少一个CDR的至少一部分的模拟肽。
24.权利要求17中的融合蛋白，其中非Fc组分包括肽。
25.权利要求17中的融合蛋白，其中非Fc组分包括蛋白质或其片断。
26.权利要求17中的融合蛋白，其中非Fc组分选自细胞因子、激素、酶、配体、生长因子、受体和抗体片断。
27.权利要求17中的融合蛋白，其中非Fc组分选自显示G-CSF活性的肽、显示GHR活性的肽、显示催乳素活性的肽、神经生长因子模拟物、IL-2模拟物、胰高血糖素样肽-1、四肽I(D-赖氨酸-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酸)、vMIP-II的N末端肽、凝血酶受体的拮抗肽配体(AFLARAA)、肽CGRP、受体拮抗剂CGRP、甲状旁腺激素(PTH)-1受体拮抗剂、酸性成纤维细胞生长因子结合肽、人脑钠肽(hBNP)、胰高血糖素样肽抑制剂4、GLP-1(7-36)、GLP-2(1-34)、胰高血糖素、PACAP-38、血小板来源的生长因子(PDGF)、角质化细胞生长因子(KGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、肝生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、Wnt-2原癌基因(wnt-2)产物和人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的结合结构域。
28.通过融合非Fc组分到Fc区来增加非Fc组分半衰期的方法，所述Fc区具有来源于一种或多种人IgG2抗体的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的另一部分。
29.通过将非Fc组分与Fc区融合从而增加非Fc组分与它所结合分子的亲和力的方法，所述Fc区具有来源于一种或多种人IgG2抗体的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的另一部分。
30.通过将非Fc组分与Fc区融合来形成非Fc组分二聚体的方法，所述Fc区具有来源于一种或多种人IgG2抗体的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的另一部分。
31.通过将非Fc组分与Fc区融合来促进非Fc组分纯化的方法，所述Fc区具有来源于一种或多种人IgG2抗体的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的另一部分。
32.降低或消除Fc受体结合以及与Fc融合蛋白相关的补体活化的方法，所述方法包括将非Fc组分与Fc区融合，其中Fc区具有来源于一种或多种人IgG2抗体的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的另一部分。
33.如权利要求32的方法，其中在体外降低或消除Fc受体结合和补体活化。
34.通过创造具有融合到Fc区的非Fc组分的Fc融合蛋白来增进非Fc组分在哺乳动物中表达的方法，所述Fc区具有来源于一种或多种人IgG2抗体的部分和来源于一种或多种人IgG4抗体的另一部分。
35.权利要求17的融合蛋白，其中Fc区附着于非Fc组分的氨基末端。
36.权利要求17的融合蛋白，其中Fc区附着于非Fc组分的羧基末端。
37.编码依照权利要求17的融合蛋白的核酸。
38.如权利要求37的核酸，其含有内含子。
39.如权利要求37的核酸，其不含有内含子。
40.包含依照权利要求37的核酸的表达载体。
41.用依照权利要求39的表达载体转染的宿主细胞。
42.包含依照权利要求17的融合蛋白和可药用载体的组合物。
全文摘要
包含具有如下区域的抗体和/或融合蛋白，该区域包含来源于IgG2的部分和来源于IgG4的部分。
文档编号C07H21/00GK1829533SQ200480021659
公开日2006年9月6日 申请日期2004年5月28日 优先权日2003年5月30日
发明者R·P·罗特尔, S·法斯－奈特, 邬大洋, S·P·斯昆托, M·J·埃文斯 申请人:阿莱克申药物公司