专利名称：合成丙烯酰胺衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及合成丙烯酰胺衍生物，特别是丙烯酰胺基固定剂(immobilines)的方法，所述方法特别适合用于合成丙烯酰胺基固定剂丙烯酰胺基胍基丁胺，但是也用于合成任何丙烯酰胺衍生物，通过该方法合成的化合物能够用于生产分离材料，其优选的实例是用于基于等电点(pI)不同而分离，特别是通过电泳方法(等电聚焦，IEF)而分离两性化合物的分离材料，另一优选的实例是用于2D电泳的分离材料。
背景技术：
在二维电泳(2D)中，电泳物质可以在两个方向被分离，在第一维中，通过等电聚焦分离物质，等电聚焦经常伴随着第二维凝胶电泳，其中每个被分离的物质进一步按照分子量和/或分子大小被分离。等电聚焦和凝胶电泳一般在互相垂直的二维方向上进行。能够以分析和制备数量的被分离的物质进行2D电泳。
被分离的物质一般是生物-有机物，并且主要包括具有多肽结构和/或碳水化合物结构的化合物，其中蛋白质是特别重要的。
在某些类型的电泳中，使用提供有利于所需分离条件的基团将载体材料官能化，一种重要类型的基团是pH-缓冲基团，通过在电泳凝胶的阳极端和阴极端之间固定不同pKa的pH-缓冲基团，使二十世纪七十年代后期能够建立固定化的用于等电聚焦pH-梯度(Aminkemi，US4,130,470)。为了有好的pH-梯度，重要的是有不同的pH-缓冲基团范围，所述基团是有处在所需的pH-间隔内的增加/降低的pKa值，两个邻近的缓冲基团的pKa之间的差值一般是1-2个pH单位，对于扩展到pH10以上的间隔，在WO 02/25264(Amersham Biosciences)中描述了带电的载体材料，它们在用于制备分离材料的pH＞10条件下对于水解有改进的稳定性。所述文献记载了(1)在以下范围内适当地选择固定化的pH-缓冲基团(a)在连接sp2-杂化的碳原子的氮原子上的pH-依赖性电荷，和
(b)pKa≥9.5，例如≥10.0或≥10.5或≥11.0，和/或(2)使用基于某些丙烯酰基单体的载体材料。
丙烯酰胺基固定剂是带有缓冲基团的丙烯酰胺衍生物，丙烯酰胺基固定剂是由pK值确定的弱的酸或碱，丙烯酰胺基固定剂的优选用途是用于2D电泳，一个最有兴趣的丙烯酰胺基固定剂是丙烯酰胺基胍基丁胺，丙烯酰胺基胍基丁胺的合成记载于WO O2/25264中，包括让胍基丁胺硫酸盐和氢氧化钡在水中反应，然后过滤除去形成的硫酸钡沉淀，通过冷冻干燥水相而得到脱盐的胍基丁胺。为了除去大部分硫酸钡，至少要重复沉淀一次，下一步是将脱盐的胍基丁胺重新溶解在有机溶剂中，并且加入丙烯酰氯和碱。反应是耗时的，并且经常产率和纯度很低，另外处理反应混合物经常面临除去碱和过量的未反应的丙烯酰氯的困难(在反应过程中经常水解为丙烯酸)。
丙烯酰胺基胍基丁胺的理论pKa值是13.52，并且适用于在pH间隔超过10的情况下制备用于分离的分离材料。
发明的简要说明本发明涉及合成任何丙烯酰胺衍生物，特别是丙烯酰胺基固定剂的简单方法，所述方法避免了上述缺点。
另外本发明涉及生产新的丙烯酰胺衍生物(丙烯酰胺基固定剂)的方法，所述方法弥补了在先公知的丙烯酰胺基固定剂家族的空白。
采用本发明方法生产的优选丙烯酰胺基固定剂是丙烯酰胺基胍基丁胺，但是本发明的方法适合于任何丙烯酰胺衍生物，特别是生产具有高pKa，例如pKa＞10的亲水性丙烯酰胺基固定剂。
丙烯酰胺基固定剂优选用于含有固定化的pH梯度的等电聚焦分离材料，该分离材料包括本发明方法生产的延伸到用于规定该梯度的至少一部分pH间隔的丙烯酰胺基固定剂。优选地，该梯度/间隔延伸到pH＞10，包括具有pKa≥9.5，例如≥10.0或≥10.5或≥11.0的丙烯酰胺基固定剂。优选的电泳分离方法是2D电泳。
本发明提供合成任何丙烯酰胺衍生物的一般方法，即从在水中溶解亲核性胺的盐形成水溶液开始，并且用碱将所述的溶液脱盐，包括以下步骤a)将溶解的活化的丙烯酸衍生物加入到所述溶液中；
b)酸化水相；和c)萃取所述的水相。
优选的丙烯酰胺衍生物是丙烯酰胺基固定剂，优选的丙烯酰胺基固定剂是丙烯酰胺基胍基丁胺。
为了生产丙烯酰胺基胍基丁胺，优选从胍基丁胺盐开始，优选从胍基丁胺硫酸盐开始。
在优选的实施方案中，步骤c)的萃取使用有机溶剂，优选使用甲基异丁基酮(MIBK)进行。
丙烯酸衍生物是活化的丙烯酸衍生物，选自丙烯酰氯、丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、丙烯酸五氟苯基酯、丙烯酸五氯苯基酯、丙烯酸4-硝基苯基酯等。
按照本发明，胍基丁胺硫酸盐或亲核性胺的任何其它盐的脱盐使用有机碱，优选三乙基胺(TEA)和二异丙基乙基胺(DIPEA)，或者任何无机碱，优选氢氧化钠(NaOH)和碳酸钾(K2CO3)。
在优选的实施方案中，所述方法还包括固定pH到约7。
在另一实施方案中，所述方法包括在步骤b)以前，i)碱化水溶液到pH超过有机碱的pKa，和ii)使用有机溶剂萃取水相以除去有机碱。
按照本发明优选的方法，将胍基丁胺硫酸盐是溶解，使用K2CO3脱盐，并且该方法包括以下步骤a)加入丙烯酰氯；b)酸化到pH1-4，优选pH2.3；c)过滤；d)使用MIBK萃取；e)将pH调节到pH7。
发明的详细说明按照本发明合成丙烯酰胺衍生物的新的方法解决了先有技术中的所有问题，例如重现性问题和涉及健康的问题。按照本发明，NaOH、TEA、DIPEA或K2CO3作为碱用于原料的脱盐以及捕获在丙烯酰氯和脱盐的原料之间的反应期间游离出来的质子，改进了反应过程从而得到了高纯度、高产率和允许容易的放大。过量的丙烯酰氯(对于进行反应而得到优异的产率和在反应过程中水解得到丙烯酸是必需的)在酸化水相以后通过使用MIBK萃取而被除去，该合成方法能够很容易地用于制备其它丙烯酰胺基固定剂的制备。对于制备丙烯酰胺基固定剂，当使用所述物质制备2D电泳凝胶时，污染的丙烯酸是重要的参数。
本发明的方法在选择不同组分方面提供了很多变化，并且受偶合到丙烯酰氯或任何活化的丙烯酸衍生物(丙烯酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、丙烯酸五氟苯基酯、丙烯酸五氯苯基酯、丙烯酸4-硝基苯基酯等)上的游离胺类型的控制。
按照本发明方法为制备丙烯酰胺衍生物提供了新的机会，一个特别的应用是制备2D电泳的丙烯酰胺基固定剂(在下述试验部分予以说明)，对高pKa值的丙烯酰胺基固定剂是特别有兴趣的，但是本发明的方法不限于丙烯酰胺基固定剂的生产，而是能够用于涉及丙烯酰胺衍生物制备的其它目的。丙烯酰胺的实例是未取代的和/或N-烷基取代的丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。
以下使用某些非限制性公开的实施例说明本发明。本发明被更详细地确定在随后的权利要求书中。
实施例部分I.合成丙烯酰胺基胍基丁胺丙烯酰胺基胍基丁胺的化学结构式如式1。
式1A.使用NaOH作为碱将胍基丁胺硫酸盐(2.28g，10mmol)溶解在装备了电磁搅拌器和pH计的三口圆底烧瓶(50ml)中的蒸馏水(20ml)中，将反应混合物在冰浴中冷却，为了脱盐将氢氧化钠(NaOH)(1M)加入到圆底烧瓶中直到pH＝12，将溶解在丙酮(5ml)中的丙烯酰氯(1.36g，1.22ml，15mmol)滴加到烧瓶中，使用NaOH(1M)在加入丙烯酰氯溶液期间使反应混合物的pH保持在11.8，反应在室温下进行2h，然后停止搅拌。通过加入浓硫酸将水相的pH固定在pH2.5，然后使用MIBK(甲基异丙基酮)(3次，80ml)萃取水相(约40ml)，除去反应期间形成的过量的丙烯酸。使用旋转蒸发器蒸发残留的MIBK，得到在水中的产品。产率至少是50％。
B.使用TEA作为碱将胍基丁胺硫酸盐(2.28g，10mmol)溶解在装备了电磁搅拌器的三口圆底烧瓶(50ml)中的蒸馏水(15ml)中，将三乙基胺(TEA)(3.52ml，25mmol)加入到圆底烧瓶中，将反应混合物在冰浴中冷却，于5℃搅拌混合物10分钟，使用巴斯德移液管将溶解在丙酮(5ml)中的丙烯酰氯(1.36g，1.29ml，15mmol)滴加到烧瓶中，于5℃进行反应lh，停止搅拌。将K2CO3加入到圆底烧瓶中直到将pH固定到11，水相的体积是75ml，使用MIBK(2次，150ml)萃取水相以除去TEA，通过加入浓硫酸将水相的pH固定在pH2.3，然后用MIBK萃取(3次，150ml)水相以除去反应期间形成的过量的丙烯酸。通过加入K2CO3将水相的pH固定在pH7，产率至少是95％。
任选地，可以通过冷冻干燥除去水，但是这将增加丙烯酰胺基胍基丁胺均聚反应的危险，但是假如进行该步骤，可以将最终的白色粉末能够溶解在异丙醇中并且过滤而除去最终形成的聚合物，而盐仍然存在于水相中。
C.使用DIPEA作为碱将胍基丁胺硫酸盐(2.28g，10mmol)溶解在装备了电磁搅拌器的圆底烧瓶(50ml)中的蒸馏水(10ml)中，将二异丙基乙二胺(DIPEA)(3.88g，5.23ml，20mmol)和丙酮(10ml)一起加入到圆底烧瓶中，在冰浴中冷却反应混合物，于5℃搅拌混合物10分钟，使用巴斯德移液管将溶解在丙酮(5ml)中的丙烯酰氯(1.81g，1.625ml，20mmol)加入到烧瓶中，反应于5℃进行lh，停止搅拌，将K2CO3加入到圆底烧瓶中直到将pH固定到12。水相体积是75ml，然后用MIBK(2次，150ml)萃取水相以除去DIPEA，通过加入浓硫酸将水相的pH固定到pH2.3，然后用MIBK(3次，150ml)萃取水相，除去反应期间形成的过量丙烯酸。通过加入K2CO3将水相的pH固定在pH7，产率至少是95％。
任选地，可以通过冷冻干燥除去水，但是这将增加丙烯酰胺基胍基丁胺均聚反应的危险，但是假如进行该步骤，可以将最终的白色粉末溶解在异丙醇中并且过滤而除去最终形成的聚合物，而盐仍然存在于水相中。
D.使用K2CO3作为碱使用K2CO3作为碱是进行本发明的最佳模式，将胍基丁胺硫酸盐(2.28g，10mmol)溶解在装备了电磁搅拌器的圆底烧瓶(50ml)中的蒸馏水中(5ml)，将溶解在蒸馏水(5ml)中的K2CO3(4.14g，30mmol)加入到圆底烧瓶中，在冰浴中冷却反应混合物，于5℃搅拌反应混合物10分钟，使用巴斯德移液管将溶解在丙酮(5ml)中的丙烯酰氯(1.81g，1.625ml，20mmol)滴加到烧瓶中，反应于5℃进行lh，停止搅拌，用浓硫酸将水相固定在pH2.3，用玻璃漏斗过滤，然后用MIBK(2times 100ml)萃取水相，除去反应中形成的过量的丙烯酸。通过加入K2CO3将水相的pH固定到pH7，产率至少是95％。
任选地，可以通过冷冻干燥除去水，但是这将增加丙烯酰胺基胍基丁胺均聚反应的危险，但是假如进行该步骤，可以将最终的白色粉末能够溶解在异丙醇中并且过滤而除去最终形成的聚合物，而盐仍然存在于水相中。
II.根据本发明生产的丙烯酰胺衍生物的用途优选的用途是用于丙烯酰胺基固定剂，特别是丙烯酰胺基胍基丁胺(见上述)的生产。丙烯酰胺基固定剂例如用于生产2D凝胶。本发明还涉及丙烯酰胺衍生物在其它电泳应用中作为载体的用途。另外丙烯酰胺衍生物能够用于生产色谱珠和其它色谱担体。
丙烯酰胺衍生物的其它用途是作为絮凝剂。
权利要求
1.合成丙烯酰胺衍生物的方法，从在水中溶解亲核性的胺的盐而形成水溶液开始，并且使用碱将所述水溶液脱盐，包括以下步骤a)将溶解的活化的丙烯酸衍生物加入到所述溶液中；b)酸化水相；和c)萃取所述的水相。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的丙烯酰胺衍生物是丙烯酰胺基固定剂。
3.根据权利要求2的方法，其中所述的丙烯酰胺衍生物是丙烯酰胺基胍基丁胺。
4.根据权利要求3的方法，其中所述的盐是胍基丁胺盐。
5.根据上述任何一项权利要求的方法，其中萃取步骤c)使用有机溶剂进行。
6.根据权利要求5的方法，其中有机溶剂是MIBK(甲基异丁基酮)。
7.根据上述任何一项权利要求的方法，其中所述的丙烯酸衍生物是活化的丙烯酸衍生物，选自丙烯酰氯、丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、丙烯酸五氟苯基酯、丙烯酸五氯苯基酯、丙烯酸4-硝基苯基酯。
8.根据上述任何一项权利要求的方法，其中所述的脱盐使用NaOH、TEA(三乙基胺)、DIPEA(二异丙基乙基胺)或K2CO3。
9.根据上述任何一项权利要求的方法，还包括固定pH到7。
10.根据上述任何一项权利要求的方法，包括在步骤b)以前，i)碱化水相到pH超过有机碱的pKa，和ii)使用有机溶剂萃取水相以除去有机碱。
11.根据权利要求1-9中任意一项的方法，其中将胍基丁胺硫酸盐溶解，使用K2CO3脱盐并且包括以下步骤a)加入丙烯酰氯；b)酸化到pH1-4，优选pH2.3；c)过滤；d)使用MIBK萃取；和e)将pH调节到pH7。
全文摘要
本发明涉及合成丙烯酰胺衍生物的方法，该方法从在水中溶解亲核性的胺的盐而形成水溶液开始，使用碱将所述水溶液脱盐，包括以下步骤a)将溶解的活化的丙烯酸衍生物加入到所述溶液中；b)酸化水相；和c)萃取所述的水相。在一个优选的实施方案中，丙烯酰胺衍生物是丙烯酰胺基固定剂，优选是丙烯酰胺基胍基丁胺，丙烯酰胺基固定剂的优选用途是用于生产2D凝胶。
文档编号C07C231/02GK1871205SQ200480031474
公开日2006年11月29日 申请日期2004年10月18日 优先权日2003年10月23日
发明者M·阿尔戈特松, P·布松, N·泰弗南 申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司