专利名称：从木豆根中分离纯化cajanol的方法
技术领域：
本发明涉及从植物中提取、分离和纯化活性成分的方法，具体是从木豆新鲜或干燥的根茎中提取、分离和纯化cajanol。
背景技术：
Cajanol属于黄酮类化合物，是一种良好的抗菌剂同时又有抗癌的效果。它对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌都具有较强的抗性，可以通过损害DNA来抑制大肠杆菌，而对金黄色葡萄球菌的抗菌作用主要是通过作用于膜上的卵磷脂、磷酸盐和DNA来抑制金黄色葡萄球菌增长(Liu Xiao-Iei 2010)。另夕卜，cajanol还可以在体外抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌生长。除了抗菌效果以 夕卜，cajanol还有较强的抗癌效果，cajanol可以对MCF-7细胞表现出抗性，同时表现出浓度依赖，cajanol使MCF-7细胞存活率下降，导致细胞阻滞于G2/M期，并诱导细胞凋亡，Cajanol诱导的细胞凋亡通过线粒体依赖性途径，包括抑制Bcl-2的表达和Bax的表达诱导desintegrate线粒体膜外,并导致细胞色素c释放。因此,cajanol作为一种潜在的药用成分具有良好的开发前景。根据我们目前的研究发现，cajanol仅存在于木豆根中，并且含量较闻。木豆是为豆科木豆属一年生或多年生木本植物、常绿灌木。又名鸽子豆、树黄豆等，是一种民间用药。《陆川本草》记载木豆叶“平、淡、有小毒”。《中华药海》对此作了进一步说明木豆叶“平、淡、有小毒、入心径”，主治小儿水痘、痛肿。另外木豆还有有清热解毒、补中益气、利水消食、止血止痢、散癖止痛、排痛肿之效。然而，目前对于木豆的研究集中在对木豆叶的研究，对木豆根的研究却报道较少，许多木豆根的药用价值没有得到体现。综上所述，cajanol是一种活性较好的黄酮类物质，其良好的抗菌活性和抗肿瘤活性，使其极有可能成为一种潜在的药用成分。但是，到目前为止对于cajanol的提取、分离和纯化工艺尚未见报道，同时，大量的木豆根资源都被当做农业废弃物燃烧掉，不仅消耗了资源还破坏了环境。因此，本发明旨在建立一种通过多种现代分离纯化技术结合，快速高效的分离cajanol的方法，使木豆根的资源得到合理高效的利用，充分发挥木豆根的价值，并且得到高纯度的cajanol样品为科研和工业生产提供原料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以木豆新鲜或干燥的根茎为原料，通过匀浆诱导技术、酶诱导技术、溶剂提取技术、超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液固萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术，从而大量、快速获得cajanol单体，该方法简单易行、目标化合物损失少。本发明的目的是通过以下方案来达到的木豆新鲜或干燥的根经过水匀浆体系诱导、酶水解，可提高cajanol含量，后经60-85%乙醇溶剂提取，提取物加入水在30-45°C超声波振荡、静止絮凝，所得到絮凝物经负压空化混悬液固萃取、大孔树脂法富集和一次正相硅胶中压柱层析后得到cajanol的产品，纯度大于80%，经过低温析晶和重结晶得到纯度大于95%的纯品。上述的cajanol提取纯化方法，其特征在于，取一定量的新鲜或干燥的木豆根加入水，温度30-45°C，体积为固体质量的3-8倍，连续匀浆诱导3次，每次1_10分钟；在提取过程中使用酶对新鲜或干燥木豆根进行诱导水解；将匀浆诱导后的浆液用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调PH为3. 0-6. 0 ;取0. 2-2%固形物重量的纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶的任意两种或三种组成复合酶，溶于PH 为3. 0-6. 0的缓冲液中，在50-60°C水浴中激活8_15分钟；将激活后的复合酶缓冲液加入匀浆诱导浆液中，在温度为30-50°C的水浴上酶解3-6小时；乙醇提取液所提物质为匀浆诱导和酶诱导后的固形物，提取方法选自超声波辅助提取、冷浸提取、超临界CO2提取或微波辅助提取，诱导后固形物使用60-85%乙醇提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后，木豆根提取物中加入水，将提取物加入3-6倍体积的40-50°C温水，于超声波振荡提取器中50-60KHZ条件下振荡絮凝15-30分钟，静止15-30分钟，超声波的震荡作用使得粘稠絮凝物中包含的极性较大的杂质逐渐溶出，絮凝物富集了提取液中90 99%的cajanol。得到絮凝物，以0. 03-0. 06MPa负压为动力用有机溶剂进行负压空化混悬液固萃取，每克粗提物加入萃取溶剂5mL-20mL,萃取次数为5_8次,所用溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷中的一种，有机相回收溶剂后可得目标固形物；浓缩萃取液至干，得到的固形物以20-30%乙醇混悬，配置成料液浓度为2-4mg/mL混悬药液，同时将大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将混悬的药液通过吸附柱，上样量0. 5-1BV,以流速为每小时6-8mL/g树脂、pH = 5条件下过吸附柱。吸附后用30-40%乙醇3BV洗杂质，然后用50-60%乙醇8-10BV解吸。收集解析液，浓缩至干得到固形物。预先称取质量为提取物质量的5-10倍的硅胶，采用湿法装柱，所用溶剂除石油醚外，还包括正己烷。将所得固形物用少量有机溶剂溶解，加入与浸膏质量比为I : I. 2的层析硅胶拌匀、减压旋干，装入正相硅胶中压柱。先后以10-20BV石油醚、石油醚乙酸乙酯=10 I、石油醚乙酸乙酯=5 I、甲醇连续中压洗脱连续中压洗脱，收集洗脱液，每份1/40-1/20BV。TLC监测收集流分，合并相同部分，展开剂为石油醚乙酸乙酯=10 1-2 I,紫外波长为254nm和365nm。得到cajanol溶液，低温析晶得到产品，重结晶后得到纯品。上述的木豆中cajanol的提取纯化方法所用的大孔吸附树脂为D101、NKA-9、NKA-2、AB-8、AL-9、H103、ADS-7、ADS-8、ADS-17 或 ADS-21。本发明的优点I.本发明以在农业生产中大都被废弃的新鲜或者干燥木豆根为原料，提高了木豆这种农业植物的使用价值，合理的利用了资源，对于木豆的开发和利用有着积极和深远的意义。2.发明中采用先进的匀浆诱导技术、酶水解技术、溶剂提取技术、超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液固萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术用于cajanol的诱导和提取分离，所得产品得率高、纯度高。3.本发明所用方法科技含量高，周期短，有机溶剂用量少，对环境污染小，能耗低，成本低，同时,本发明可实现大规模产业化生产。
图I为cajanol的结构图2为分离纯化流程图
具体实施例方式实例I称取木豆干燥根lOOOg，进行初步粉碎，加入8倍体积的40°C温水后连续匀浆诱导3次，每次5分钟，将匀浆诱导好的浆液用冰醋酸调pH为4. O ;取0. 5%固形物重量的纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶按照质量比I : I : I组成的复合酶，溶于PH为4. O的缓冲液中，在40°C水浴中激活8分钟；将激活后的复合酶缓冲液加入匀浆诱导浆液中，在温度为45°C的水浴上酶解6小时。诱导液分离后固形物使用70%乙醇提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后将提取物加入40°C温水中，体积为4. 5L，于超声波提取器中50-60KHZ条件下振荡絮凝20分钟，静止15分钟，取絮凝物，以O. 05MPa负压为动力用13. 5L乙酸乙酯进行负压 空化混悬液固萃取，浓缩萃取液，以30%乙醇配置成料液浓度为4mg/mL混悬药液，上样量
O.8BV,流速为每小时8mL/g树脂、pH = 5条件下过NKA-9型大孔过吸附树脂柱。吸附后用30%乙醇3BV洗杂质，然后用50%乙醇IOBV解吸。收集解吸液，浓缩至干后用少量甲醇溶解，加入与浸膏质量比为I : I. 2的目数为500-800的层析硅胶拌匀、50°C减压蒸干。预先称取提取物质量7倍的500-800目硅胶，采用石油醚湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，先后以15BV石油醚、石油醚乙酸乙酯=10 I、石油醚乙酸乙酯=5 I、甲醇连续中压洗脱连续中压洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到cajanol粗品，以石油醚乙酸乙酯=5 I的混合溶剂在15°C下结晶，到化合物为cajanol，43. 21mg，纯度为95%。实例2称取新鲜的木豆根2000g，初步粉碎，加入6倍体积的45°C温水后连续匀浆诱导3次，每次3分钟，将匀浆诱导好的浆液用冰醋酸调pH为4. 5 ;取0. 4%固形物重量的纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶按照质量比I : I : I组成的复合酶，溶于PH为4. 5的缓冲液中，在45°C水浴中激活8分钟；将激活后的复合酶缓冲液加入匀浆诱导浆液中，在温度为45°C的水浴上酶解6小时。诱导液分离后固形物使用70%乙醇提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后将提取物加入40°C温水中，体积为4. 5L，于超声波提取器中50-60KHZ条件下振荡絮凝15分钟，静止15分钟，取絮凝物，以0. 055MPa负压为动力用10L乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，浓缩萃取液，以30%乙醇配置成料液浓度为4. 5mg/mL混悬药液，上样量
0.8BV，流速为每小时8mL/g树脂、pH = 5条件下过AB-8型大孔过吸附树脂柱。吸附后用30%乙醇3BV洗杂质，然后用50%乙醇10BV解吸。收集解吸液，浓缩至干后用少量甲醇溶解，加入与浸膏质量比为I : I. 2的目数为500-800的层析硅胶拌匀、50°C减压蒸干。预先称取提取物质量8倍的500-800目硅胶，采用石油醚湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，先后以15BV石油醚、石油醚乙酸乙酯=10 I、石油醚乙酸乙酯=5 I、甲醇连续中压洗脱连续中压洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到cajanol粗品，以正己烷乙酸乙酯=2 I的混合溶剂在20°C下结晶，得到化合物为cajanol，38. 75mg，纯度为97%。
权利要求
1.从木豆根中分离和纯化cajanol的方法,包括以下步骤 (1)诱导和酶水解将木豆根通过匀浆诱导技术诱导，再经过酶水解技术水解以增加游离的cajanol的含量； (2)提取诱导和水解后的固体物质通过60-85%乙醇提取，诱导和水解液及乙醇提取液合并浓缩后加入40-50°C的水超声波振荡絮凝，静止，得到絮凝物，将絮凝物经有机溶剂负压空化混悬液固萃取； (3)分离将萃取得到溶液浓缩后通过大孔吸附树脂进行富集和一次正相硅胶中压柱层析后得到cajanol的粗制品； (4)结晶^fcajanol的粗制品经过低温析晶和重结晶得到纯度大于95%的纯品。、
2.按照权利要求I所述的从木豆根中分离和纯化cajanol的方法，其特征在于步骤(I)所述的木豆根来源于海南产木豆的新鲜或干燥的根部，经过粉碎处理。
3.按照权利要求I所述的从木豆根中分离和纯化cajanol的方法，其特征在于步骤(1)所述的匀浆诱导技术，所用的溶剂为水，温度30-45°C，体积为固体质量的3-8倍，连续匀浆诱导3次，每次1-10分钟；步骤(I)所述的酶水解技术，首先将匀浆诱导后的浆液用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调PH为3. 0-6. 0，然后取0. 2-2%固形物重量的纤维素酶、果胶酶和葡萄糖苷酶中的任意两种或三种组成的复合酶，溶于pH为3. 0-6. O的缓冲液中，在50-60°C水浴中激活8-15分钟；将激活后的复合酶缓冲液加入匀浆诱导浆液中，在温度为30-50°C的水浴上酶解3-6小时。
4.按照权利要求I所述的从木豆根中分离和纯化cajanol的方法，其特征在于步骤(2)所述的乙醇提取液，乙醇提取液所提物质为匀浆诱导和酶水解后的固形物，提取方法选自超声波辅助提取、冷浸提取、超临界CO2提取、微波辅助提取，所用溶剂为60-85%乙醇。
5.按照权利要求I所述的从木豆根中分离和纯化cajanol的方法，其特征在于步骤(2)所述的超声波振荡絮凝技术，木豆根茎提取物中加入水，温度40-50°C，体积为提取物质量的3-6倍，超声波振荡絮凝时间为15-30分钟，频率为50-60KHZ，静止时间为15-30分钟。
6.按照权利要求I所述的从木豆根中分离和纯化cajanol的方法，其特征在于步骤(2)所述的负压空化混悬液固萃取技术，对絮凝物进行负压空化混悬液固萃取，所用有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷中的一种，每克粗提物加入萃取溶剂5mL-20mL，萃取次数为5-8次，所用压力为0. 03-0. 06MPa，有机相回收溶剂后可得目标固形物。
7.按照权利要求I所述的从木豆根中分离和纯化cajanol的方法，其特征在于步骤(3)所述的大孔吸附树脂富集方法，所用树脂选自DlOl、NKA-9、NKA-2、AB_8、AL_9、H103、ADS-7、ADS-8、ADS-17或ADS-21大孔吸附树脂，该方法中大孔树脂吸附步骤采用湿法装柱，保留液面，将负压空化混悬液固萃取所得到的固形物部分用20-30%乙醇溶液配制成料液浓度为2-4mg/mL混悬药液，同时将大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将混悬的药液通过吸附柱，上样量为0. 5-1BV,以流速为每小时6-8mL/g树脂、pH = 5条件下过吸附柱；吸附后用30-40%乙醇3BV洗杂质，然后用50-60%乙醇8-10BV解吸；收集解吸液，浓缩至干，所得固形物为粗目标产物。
8.按照权利要求I所述的从木豆根中分离和纯化cajanol的方法，其特征在于步骤(3)所述的一次性正相硅胶中压柱层析技术，正相硅胶中压柱层析所用样品为树脂富集后所得固形物，所用硅胶为300-800目；预先称取质量为样品量的5-10倍的硅胶，采用石油醚、正己烷或乙酸乙酯湿法装柱，将样品用少量甲醇溶解，加入与浸膏质量比为I ;`1.2的层析硅胶拌匀、减压旋干，装入预先装好的硅胶柱中；先后以10-20BV石油醚、石油醚乙酸乙酯=10 I、石油醚；乙酸乙酯=5 I、甲醇连续中压洗脱，收集洗脱液，每份`1/40-1/20BV;用硅胶薄层层析检测洗脱液成分，合并相同部分，展开剂为三氯甲烷；甲醇`=30 1-1 1，紫外 波长为 254nm 和 365nm。
9.按照权利要求I所述的从木豆根中分离和纯化cajanol的方法，其特征在于步骤(4)所述的低温析晶和重结晶技术，重结晶所用溶剂为石油醚、乙醚或正己烷中的一种与三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙睛或甲醇中的一种按照50 1-1 I的比例组成的混合溶剂，低温析晶温度为-10°C -25°C。
全文摘要
本发明涉及从木豆根中提取分离纯化活性成分cajanol的方法。目的是提供简便、安全、经济有效的从木豆根茎中提取分离纯化高纯度cajanol的方法。本发明所采取的技术方案是以木豆新鲜或干燥根为原料，采用匀浆诱导技术、酶诱导技术、溶剂提取技术、超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液固萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术等得到精制的cajanol，纯度达95％以上。该方法的原料丰富易得，工艺简单易行，得率高，纯度高，产品附加值高，适用于工业化生产。
文档编号C07D311/40GK102731460SQ20111009156
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月13日 优先权日2011年4月13日
发明者付玉杰, 张东阳, 祖元刚 申请人:东北林业大学, 付玉杰